LAPORAN SEMENTARA

PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI INSTRUMENTAL

ANALISIS KUANTITATIF VITAMIN C DALAM SAMPEL

BUAH JERUK MENGGUNAKAN HPLC (High Performance
Liquid Chromatography)

Tanggal Percobaan : 21 September 2020

Disusun Oleh :

Resa Imani Kusuma 22010319130020/3A

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2020
ANALISIS KUANTITATIF VITAMIN C DALAM SAMPEL BUAH JERUK
MENGGUNAKAN HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

1. TUJUAN
1.1. Mahasiswa mampu mengerjakan analisis kuantitatif vitamin C dalam
sampel buah jeruk menggunakan HPLC.

2. DASAR TEORI
1.1. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
1.1.1. Definisi HPLC
High Performance Liquid Chromatography (HPLC),
merupakan teknik kromatografi cair (LC) yang digunakan
untuk pemisahan berbagai komponen dalam campuran. HPLC
juga digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi senyawa
dalam proses pengembangan obat dan telah digunakan di
seluruh dunia sejak beberapa dekade (Chawla, 2016). Tujuan
penggunaan HPLC adalah memisahkan molekul dalam waktu
minimum (Behnoush, 2015).
Analisis dengan HPLC ini mempunyai beberapa kelebihan
seperti mudah dioperasikan dan mempunyai kapasitas
pemisahan yang tinggi sehingga metode analisis ini dijadikan
sebagai preferensi dalam hal identifikasi molekul senyawa
organik. Selain itu untuk mendeteksi senyawa PAH lebih
banyak dilakukan dengan menggunakan instrumen HPLC
dibandingkan dengan kromatografi. Di samping kelebihan
yang ada, HPLC juga memiliki kelemahan yakni sering
mengalami kesulitan dalam mengidentifikasi dengan tepat
seluruh puncak kromatogram pada pemisahan. Hal ini terjadi
terutama untuk kromatogram senyawa PAH yang puncaknya
saling tumpang tindih satu dengan lainnya sehingga
memungkinkan hasil keseluruhannya berupa kekeliruan
identifikasi molekul (Hirjani et al., 2018).
1.1.2. Prinsip Kerja HPLC
Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan komponen analit
berdasarkan kepolarannya. Setiap campuran yang keluar akan
terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam bentuk
kromatogram. Dimana jumlah peak menyatakan jumlah
komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran (Hendayana, 2006). Molekul yang
berbeda akan tertahan pada waktu yang berbeda dalam kolom
kromatografi sesuai dengan polaritas struktur molekulnya
(Hirjani et al., 2018).

1.1.3. Komponen HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase
gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),
kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan
suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram
skematik sistem kromatografi cair seperti berikut :

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah

pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan
sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut (Settle,
1997). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Untuk fase normal
(fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara
untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini.
Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis (Kenkel, 2002). Fase gerak yang paling sering
digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah
campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase
gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-
pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau
menggunakan pelarut-pelarut jenis alcohol (Meyer, 2004).
Pompa untuk HPLC mempunyai syarat yaitu harus inert
terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan
fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Tujuan
penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah
untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan
(Munson, 1981).

Alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan

katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel internal atau
 eksternal. Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kebanyakan
fase diam pada HPLC berupa silica. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-
OH). Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan
yaitu detektor universal dan golongan detektor yang spesifik
yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif.
(Kealey dan Haines, 2002).

1.2. Vitamin C
Vitamin C adalah salah satu senyawa kompleks yang terdapat
dalam buah dan sayuran yang memiliki sifat larut air. Vitamin C
dikenal juga dengan nama asam askorbat. Vitamin C memiliki sifat
mudah larut dalam air, mudah teroksidasi, dan dalam buah-buahan
dan sayuran akan rusak atau berkurang akibat proses oksidasi berupa
paparan udara, pemasakan dan pengirisan, serta penyimpanan yang
tidak tepat. Salah satu bentuk tindakan agar kandungan vitamin C
pada sayuran dan buah-buahan tetap terjaga yaitu proses pengemasan
buah dan sayuran pada suhu rendah (di lemari es) (Ngginak dkk.,
2019). Berikut struktur vitamin C (Nerdy, 2017).

Vitamin C bisa ditemukan pada buah-buahan ataupun sayuran.

Contoh buah-buahan lokal yang diketahui kaya akan vitamin C adalah
buah lemon lokal, jeruk nipis, jambu biji, apel Malang dan nenas.
(Almatsier, 2001). Manfaat vitamin C bagi tubuh yaitu sebagai
antioksidan, sintesis kolagen, dan anti kanker (Aina & Suprayogi,
2011). Selain itu, vitamin C dapat menjaga kehamilan dan mencegah
dari diabetes (Arifin dkk,, 2007).
Asam askorbat merupakan komponen aktif dari tablet vitamin C.
Asam askorbat tidak stabil bahkan pada suhu kamar dimana
peningkatan suhu dan kelembaban dapat mempercepat proses
degradasinya. Kecepatan degradasi dari asam askorbat yang tidak
terlindungi umumnya meningkat dua kali lipat setiap peningkatan suhu
10oC (Pavlovska, 2011).
3. METODE
1.1. Alat dan Bahan
1.1.1. Alat
a. Gelas ukur
b. Timbangan analitik
c. Labu takar
d. Mikropipet
e. Tip
f. HPLC instrument
g. Milipore membran filter HA 0.22 µm
h. Eppendorf
i. Alat gelas
1.1.2. Bahan
a. Asam metafosforik 6%
b. Standard L-ascorbic acid
c. Larutan asam benzoat 0.01%
d. Asam asetat 0.1 M, pH 4.25
1.2. Cara Kerja
3.2.1 Pembuatan larutan standar vitamin C

1. Dibuat larutan stok vitamin C 500 ppm (50 mg/L) dengan

menimbang kurang lebih 50 mg vitamin C, masukkan ke
dalam labu takar 100 mL

2. Dimasukkan asam metafosforik 6% (pelarut) ke dalam labu

takar, aduk perlahan. Tambahkan pelarut hingga tanda batas.
3. Dibuat larutan baku vitamin c menggunakan larutan stok
vitamin c 500 ppm dengan rentang konsentrasi 1, 4, 8, 12, 20
dan 30 ppm masing-masing sebanyak 25 mL menggunakan
asam metafosforik 6% sebagai pelarut.

4. Disaring larutan standar yang telah dibuat dengan milipore

membran filter HA 0.22 µm.
3.2.2 Pembuatan larutan internal standar (IS)
 1. Digunakan larutan internal standar yaitu larutan asam
benzoat.
2. Dibuat larutan asam benzoat dengan konsentrasi 0.1 % (1
µg/µl) dalam aquadest
3. Disaring larutan dengan milipore membran filter HA 0.22 µm
3.2.3 Pembuatan larutan sampel

1. Difiltrasi ekstrak hasil percobaan 1 menggunakan milipore

membran filter HA 0.22 µm.

2. Diambil ekstrak sebanyak 5-10 µl, pindahkan ke eppendorf

3. Ditambahkan larutan standar vitamin C 0.1% sebanyak 1-3 µl

(untuk 3 replikasi), campur perlahan.
3.2.4 Injeksikan larutan standar vitamin C dan larutan sampel ke
dalam HPLC dengan parameter sebagai berikut:
1. Fase diam : Partisil 10 SAAX
2. Fase gerak : 0.1 M asam acetat, pH 4.25
3. Flow : 1.3 ml/menit
4. Deteksi : 250 nm pada 0.08 AUFS range
5. Volume sampel : 5-10 µl
6. Internal standar : 10 µl 0.01% asam benzoate
7. tR : vitamin C sekitar 3.7 menit, asam benzoat sekitar 5.1
menit
3.2.5 Dicatat hasil analisis dengan HPLC, seperti peak area dan
kromatograi
3.2.6 Dihitung persamaan kurva baku melalui hubungan antara
konsentrasi vitamin c dan rasio luas area standar vitamin C/luas
area IS.
3.2.7 Dihitung konsentrasi sampel dari 3 replikasi.
 Daftar Pustaka

Aina, mia, & Suprayogi, D. 2011. Uji Kualitatif Vitamin C Pada Berbagai
Makanan Dan Pengaruhnya Terhadap Pemanasan. Jurnal Sains Dan
Matematika, 3(1); 61-67

Almatsier, S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama

Arifin, Helmi, dkk. 2007. Pengaruh Pemberian Vitamin C terhadap Fetus pada
Mencit Diabetes. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi 12(1)

Behnoush, B., Sheikhazadi, A., Bazmi, E., Fattahi, A., Sheikhazadi, E., & Anary,
S. H. S. 2015. Comparison of UHPLC and HPLC in Benzodiazepines
Analysis of Postmortem Samples: A Case–Control Study. Medicine, 94(14)
: 1-7

Chawla, G., & Ranjan, C. 2016. Principle, Instrumentation, And Applications Of

UPLC: A Novel Technique of Liquid chromatography. Open Chemistry
Journal, 3(1) : 1-16

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan

Elektroforesis Modern. Bandung: Remaja Rosdakarya Offset

Hirjani, Harno Dwi Pranowo, dan Mudasir. 2018. Prediction of High

Performance Liquid Chromatography Retention Time for Some Organic
Compounds Based on Ab initio QSPR Study. DOI: 10.29303/aca.v1i1.6

Kealey, D dan Haines, P.J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. New York:
BIOS Scientific Publishers Limited

Kenkel, J. 2002. Analytical Chemistry for Technicians. 3th. Edition. USA : CRC
Press

Meyer, F.R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography. 4th Ed.

New York: John Wiley & Sons.

Munson, J.W. 1981. Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and B,

diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi. Surabaya : Airlangga University
Press
Nerdy. 2017. Determination Of Vitamin C In Several Varieties Of Melon Fruits
By Titration Method. Jurnal Natural 17(2); 116-121

Ngginak, James, Anggreini Dian Naomi Rupidara, dan Yanti Daud. 2019.
Kandungan Vitamin C dari Ekstrak Buah Ara (Ficus carica L.) dan
Markisa Hutan (Passiflora foetida L.). Jurnal Sains dan Edukasi Sains
2(2); 54-59

Pavlovska, G. & S. Tanevska. 2011. Influence of Temperature and Humidity on

The Degradation Process of Ascorbic Acid in Vitamin C Chewable
Tablets. J Therm Anal Calorim DOI 10.1007/s10973-011-2151-z

Settle, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry.

USA: Prentice Hall PTR, New Jersey

Snyder, L. R., Kirkland, S.J., dan Glajch, J.L. 1997. Practical HPLC Method
Development. New York : John Wiley & Son