PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMEN

ANALISIS KAFEIN DALAM MINUMAN RINGAN BERSODA JENIS COLA

DENGAN METODE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
(HPLC)

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Praktikum Kimia Analisis
Instrumen

Dosen Pengampu : Mohammad Alauhdin, S. Si., M. Si., Ph. D.

Oleh:
M. Nur Abdul Aziz Al Waro’i 4301417073/Pendidikan Kimia 17-B

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2020
 PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMEN
ANALISIS KAFEIN DALAM MINUMAN COCA-COLA DENGAN HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

A. TUJUAN PERCOBAAN
1. Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC.
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual
pengoperasian instrumen HPLC.
3. Dapat menentukan/meghitung kadar kafein dalam minuman.
B. LATAR BELAKANG
Kesehatan merupakan keadaan sejahtera dari badan, jiwa dan sosial yang
memungkinkan setiap orang hidup produktif secara sosial dan ekonomis. Dan upaya
kesehatan adalah kegiatan untuk memelihara dan meningkatkan kesehatan yang dilakukan
oleh pemerintah atau masyarakat. Setiap orang memiliki hak yang sama dalam
memperoleh derajat kesehatan yang optimal.
Pada proses pembuatan minuman bersoda, sering ditambahkan zat-zat stimulan
kedalamnya, salah satunya adalah kafein. Efek kafein sebagai stimulan tidak diragukan
lagi. Selain dapat menghilangkan rasa kantuk, kafein juga dapat memberikan kebugaran
dankesegaran pada tubuh. Kafein juga berfungsi sebagai zat penenang, sehingga kafein
dijadikansebagai pelengkap obat-obat penawar rasa sakit. Namun, kafein juga dapat
menimbulkan perangsangan terhadap otak dan sistem syaraf pada dosis yang besar. Kafein
dalam tubuhdapat dengan mudah diserap oleh usus dan menyebar dalam beberapa menit
melalui darahkesemua organ dan jaringan. Kafein dapat mengelabui tubuh untuk dapat
tetap beraktivitastinggi, meningkatkan tekanan darah, dan peningkatan pengeluaran urin
(Sinaga, 2012).
Dalam rangka peningkatan derajat kesehatan masyarakat maka pemerintah telah
mengusahakan berbagai cara dan upaya sebagaimana dijelaskan dalam Undang–Undang
No. 23 tahun 1992, yaitu penyelenggaraan kesehatan sebagaimana dimaksudkan dalam
pasal 10 yang dilakukan melalui beberapa kegiatan, dimana salah satu dari kegiatan
itu adalahpengamanan makanan dan minuman (Departemen Kesehatan,1992).

Di kota-kota besar seperti Bandung, Jakarta, Semarang dan Medan banyak dijual
minuman ringan bersoda yang sebagian besar pembeli atau pengguna minuman ini
adalah para pengemudi kendaraan, khususnya para supir bus antar kota. Minuman
 ringan bersoda memungkinkan para supir untuk selalu waspada saat berkendara, karena
minuman berenergi dapat memberi efek tidak mudah lelah dan ngantuk, karena di
dalam minuman berenergi terdapat komposisi kofein yang berperan sebagai zat aktif
yang dapat menimbulkan efek tidak mudah ngantuk dan dapat menjaga stamina
tubuh. Kafein sebagai zat stimulan tingkat sedang memang seringkali dituding sebagai
penyebab kecanduan. Hal tersebut tidak sepenuhnya benar, kafein hanya dapat
menimbulkan kecanduan jika dikonsumsi dalam jumlah yang sangat banyak dan rutin.
Namun kecanduan kofein berbeda dengan kecanduan obat psikotropika, karena
gejalanya akan hilang dalam satu dua hari setelah konsumsi (Moore, 2001).

Pemerintah telah menetapkan standar kafein pada minuman berenergi yaitu SNI
No. 01-6684-2002 tentang minuman bersoda. Tujuan dari SNI tersebut adalah untuk
melindungi konsumen dari efek negatif kafein yang berlebih. Namun disisi lain,
konsentrasi kofein yang telah ditentukan tersebut tidak memberikan efek stamina
yang instan bagi konsumen, sehingga dimungkinkan ada produsen yang meningkatkan
kadar kafeinnya untuk menghasilkan efek yang cepat bagi pengkonsumsinya. Kadar
maksimum pada minuman berenergi berdasarkan peraturan menurut SNI No 01-6684-
2002 yaitu 50 mg persaji (SNI, 2002).

C. DASAR TEORI
Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam
biji kopi, daunteh, daun mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar.
Kafein memiliki beratmolekul 194,19 gr/gmol dengan rumus kimia C8H10N8O2 dan pH 6,9
(larutan kafein 1% dalam air). Secara ilmiah, efek langsung dari kafein terhadap kesehatan
sebetulnya tidak ada,tetapi yang ada adalah efek tak langsungnya seperti menstimulasi
pernafasan dan jantung,serta memberikan efek samping berupa rasa gelisah (neuroses),
tidak dapat tidur (insomnia),dan denyut jantung tak beraturan (tachycardia). Kafein
termasuk dalam famili bahan alam yang dikenal sebagai xantin. Kafein adalah jenis xantin
yang kuat, dengan kemampuannya untuk meningkatkan kesadaran, tidak tertidur,dan
kafein merupakan vasodilator (relaksasi pebuluh darah) dan sebagai diuretik
(meningkatkan jumlah urin) (Hermanto, 2007).
 Gambar 1. Struktur Kimia Kafein

HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi

(pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang
merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke
dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-
senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan
sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama.
Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram. Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif,
sedangkan informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif (Hendayana,
2006).

Gambar 2. Diagram Skema Kerja HPLC

 Metode HPLC yang diusulkan memungkinkan pemisahan pasda 13 senyawa antara
lain asam askorbat, asam nikotinat, asam pentolenat, piridoksin, nikotinamida,
piridoksamin, riboflavin 5-fosfat (flavin mononukleotida), kafein, asam folat,
sianokobalamin dan riboflavin dalam waktu yang relatif singkat. Metode HPLC selektif
untuk penentuan vitamin B2 dan B6 (Gliszczynska, 2014).
Penentuan kadar kafein menggunakan kromatografi merupakan teknik yang
berkembang di kimia analitik. Beberapa penelitian menggunakan HPLC telah dilaporkan
oleh J.W. Weyland, dkk (1982), Qing-Chuan Chen dan Jin Wang (2001), dan C.M. Lino
and A. Pena (2010).

D. ALAT DAN BAHAN

Alat:
1. HPLC Agilent 1120 Compact LC
2. Peralatan gelas
3. pH Meter
4. Syringe filter
5. Neraca analitik
6. Botol reagen
7. Labu ukur
8. Botol semprot
9. Batang pengaduk
10. Pipet tetes
11. Pipet volume
12. Pompa vacum

Bahan:
1. Kafein standar
2. Buffer asetat
3. Metanol
4. Aquades
5. Sampel berupa minuman ringan
E. RANCANGAN KERJA
1) Cara Pengoperasian Instrumen HPLC Agilent 1120 Compact LC
Persiapan Awal Sebelum Menggunakan HPLC
Berikut ini tahapan awal yang perlu dilakukan, sebelum menggunakan HPLC :

1. Lakukan persiapan sample yang yang akan dianalisa dengan menggunakan

instrument ini, pastikan jumlahnya sesuai dan anda mengerti metode apa yang
perlu digunakan.
2. Lakukan pengecekan kabel ke sumber daya(listrik). Pastikan setiap kabel sudah
terhubung, baik komputer ke listrik, instrumen ke listrik atau komputer ke
instrumen.
3. Jika dirasa tegangan listrik di wilayah anda tidak stabil, disarankan menggunakan
stabilizer untuk memastikan sumber daya stabil.
4. Nyalakan komputer dan setiap modul pada alat HPLC. Perhatikan sejenak setiap
modul dan komputer, apakah menyala dengan baik. Jika terdapat modul yang
tidak menyala atau komputer tidak menyala, lakukan pengecekan kabel yang
terhubung ke sumber daya.
5. Saat anda merasa sudah menyalakan instrument sesuai prosedur, namun tidak
menyala. Tidak perlu menekan tombol power berulang kali, hubungi saja teknisi
laboratorium anda.
6. Buka atau double click icon software yang HPLC di komputer anda. Lakukan
pengecekan sederhana, apakah instrument dan komputer sudah saling terhubung
dan bisa berkomunikasi. Pada beberapa kasus, jika instrument sudah terhubung
dengan komputer ditandai dengan bunyi beep pada instrument.

Pengoperasian HPLC dengan Sample

Perlu diketahui di awal, penggunaan HPLC dengan konfigurasi manual injector dan
auto sampler memiliki sedikit perbedaan, namun masih dalam alur yang sama. Berikut
ini adalah tahapan cara mengguna HPLC secara global :

1. Perhatikan pipa atau selang outlet sudah terletak pada penampung yang benar.
karena ini penting untuk menampung limbah proses analisa.
2. Fokus ke software yang ada di komputer. Sebelum dan setelah menggunakan alat
laboratorium ini, diharapkan melakukan flush atau purge atau dikenal dengan
 istilah pencucian kolom. Hal ini dilakukan agak kondisi kolom selalu dalam
keadaan bersih dan tidak tersumbat. Pastikan membuka katup tekanan sebelum
melakukan pembersihan kolom.
3. Perhatikan dan pastikan larutan yang digunakan untuk fase gerak tersedia dalam
jumlah yang cukup. Beberapa jenis larutan yang digunakan diantaranya adalah :
Asetonitril, Metanol atau Aquabidest.
4. Lakukan setting method pada software HPLC. Pada tahap ini, diminta untuk
melakukan setting detail mengenai aplikasi, komposisi dan waktu injeksi. Jika
sebelumnya sudah memiliki method, tidak perlu membuat baru, gunakan saja
yang sudah ada.
5. Operasikan instrument untuk mendapatkan base line yang stabil. Jika belum
mendapatkan base line yang stabil, perhatikan langkah-langkah sebelumnya. Jika
diantaranya ada yang masih pemula, mintalah seseorang yang lebih ahli untuk
membantu dalam hal ini.
6. Pastikan tidak terdapat gelembung pada cairan fase gerak. Salah satu hal yang
membuat base line menjadi tidak stabil adalah adanya gelembung. Beberapa jenis
HPLC biasanya dilengkapi dengan degasser.
7. Setelah base line didapat, anda bisa mulai memasukan sample. Dengan cara
injeksi manual atau auto sampler, itu tergantung konfigurasi dari alat yang
digunakan. Kelebihan menggunakan auto sampler tentunya lebih otomatis dan
presisi.
8. Detektor akan menangkap data dari sample dan menampilkannya di software.
Pada beberapa kasus mungkin saja anda menemukan puncak ganda, dan belum
langsung menemukan puncak tunggal pada chromatogram. Lakukan optimasi jika
diperlukan.
9. Save atau print hasil pengukuran.

Tahapan Setelah Penggunaan HPLC

Beberapa hal yang perlu anda perhatikan setelah menggunakan alat laboratorium ini
adalah :

1. Keluarkan vial dari auto sampler.

2. Lakukan flush atau membersihkan kolom.
 3. Mematikan instrument sesuai dengan alur yang ditetapkan. Jika perlu melakukan
disconnecting instrument, lakukan itu terlebih dahulu sebelum menonaktifkan
switch power.
4. Matikan komputer dan cabut sumber daya, jika tidak digunakan dalam waktu
lama.
5. Tutup HPLC dengan cover atau case lainnya untuk mencegah debu dan kotoran
menempel.

Untuk video cara pengoperasian HPLC Agilent 1120 Compact LC dapat diakses
pada link berikut:
Part I : https://www.youtube.com/watch?v=_fzpPERcjH0
Part II: https://www.youtube.com/watch?v=B2K4h0rmASY

2) Prosedur Percobaan
Optimasi Parameter Pengukuran HPLC
a. Penentuan Fasa Gerak Metanol : Air

Sebanyak 5 mL larutan standar kafein

diinjeksikan ke dalam injektor HPLC.

Komposisi fasa gerak yang digunakan adalah

metanol : air dengan perbandingan 100 : 0; 90 :
10; 80 : 20; 70 : 30; 60 : 40; dan 50 : 50.

Mulai melakukan penentuan fasa

gerak.

Data yang didapatkan kemudian

dicatat.

Ulangi langkah-langkah tersebut dengan

mengganti larutan standar dengan larutan
sampel minuman.
b. Penentuan Laju Alir

Pada tahap ini digunakan

komposisi fasa gerak yang
optimum.

Sebanyak 5 mL larutan standar kafein diinjeksikan ke

dalam injektor HPLC dengan berbagai laju alir berbeda
yaitu 0,5; 0,8; 1; 1,25; dan 1,5 mL/menit.

Mulai melakukan penentuan

laju alir.

Data yang didapatkan kemudian

dicatat.

Ulangi langkah-langkah tersebut dengan

mengganti larutan standar dengan larutan
sampel minuman.

c. Penentuan pH

Sebanyak 5 mL larutan standar kafein

diinjeksikan ke dalam injektor.

Fasa gerak yang digunakan diatur pada berbagai variasi pH 3-8 dengan
menggunakan buffer phosfat pada komposisi dan laju alir optimum yang
diperoleh pada penelitian sebelumnya

Mulai melakukan penentuan pH.

Data yang didapatkan kemudian

dicatat.

Ulangi langkah-langkah tersebut dengan mengganti

larutan standar dengan larutan sampel minuman.

(Yamauchi dan Akiko, 2007).

Optimasi Kinerja Analitik
a. Linearitas Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi dibuat dengan memvariasikan

konsentrasi larutan standar kafein 0,5; 0,8; 1; 2; 5; 8
dan 10 ppm.

Kemudian masing-masing diinjeksikan

sebanyak 5 mL ke dalam kolom pada
kondisi optimum.

Direkam kromatogr.am dan dibuat

kurva kalibrasi dari luas pucak

Lalu dihitung persamaan regresi dan

koefisien korelasinya.

Ulangi langkah-langkah tersebut dengan mengganti

larutan standar dengan larutan sampel minuman.

b. Kebolehulangan

Sebanyak 5mL larutan standar kafein 0,5 ppm

diinjeksikan ke dalam kolom menggunakan fasa
gerak dan kecepatan alir yang optimum.

Diulang sebanyak 7 kali.

Kemudian dicatat luas puncaknya.

Ulangi langkah-langkah tersebut dengan

mengganti larutan standar dengan larutan
sampel minuman.
 c. Limit Deteksi
Limit deteksi adalah jumlah terkecil anlit dalam sampel yang dapat dideteksi yang
masih memberikan respon signal yang signifikan dibandingkan dengan signal
blanko (Panggabean et al., 2010)

F. DAFTAR PUSTAKA

C.M. Lino, A. Pena. 2010. Occurrence of Caffeine, Saccharin, Benzoic Acid and Sorbic
Acid in Soft Drinks and Nectars in Portugal and Subsequent Exposure
Assessment. Journal Food Chemistry, Volume 121, Issue 2, 503-508.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1992. Undang-Undang Tentang Kesehatan

Nomor 23. Jakarta

Gliszczynka, A. dan Rybika. 2014. Simultaneous Determination of Caffein and Water-

Soluble Vitamins in Energy Drintis by HPLC with Photodiote Array and
Fluorosence Detection. Poland: Poznan University of Economic

Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya

Hermanto, S. 2007. Kafein Senyawa Bermanfaat atau Beracunkah?

https://www.youtube.com/watch?v=_fzpPERcjH0 (diakses pada 27 Juni 2020, pukul

12:50 WIB)
https://www.youtube.com/watch?v=B2K4h0rmASY (diakses pada 27 Juni 2020, pukul
12:55 WIB)

Johnson, E. and L., Stevenson R.., 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB

J.W. Weyland, H. Rolink, D.A. Doornbos. 1982. Reversed-Phase Highperformance

Liquid Chromatographic Separation of Saccharin, Caffeine and Benzoic Acid
Using Non-Linear Programming. Journal of Chromatography A, Volume 247,
Issue 2, 1 October 1982, 221-229.

Moore. 2001. Essensial Obstetri dan Ginekologi Edisi Dua. Jakarta: Gramedia

Panggaben, A. A., Amran, M. B., Buchari and Pasibu, S. P. 2010. Integrated Gas-Liquid
Separator-Reactor for Determination Sn(II) at Trace Levels in Solution. Journal
Indo Chem : 51-57
Qing-Chuan Chen, Jing Wang. 2001. Simultaneous Determination of Artificial
Sweeteners, Preservatives, Caffeine, Theobromine and Theophylline in Food
and Pharmaceutical Preparations by Ion Chromatography. Journal of
Chromatography A, Volume 937, Issues 1- 2, 57-64.

Sinaga S. 2012. Analisa Kadar Kafein Dalam Minuman Berenergi Yang Beredar Di Kota
Medan Tahun 2006. Sumatera Utara: USU

Standar Nasional Indonesia. Minuman Energi No. 01-6684-2002. Jakarta

Yamauchi, Y., dan Akiko N. 2007. Improved Sampel Pre-Treatment for Determination
of Caffein in Tea Using Cadrige Filled with PVPP. Journal Chem Pharm, Bull :
1393-1396
 LAMPIRAN

Data pengamatan

t0= …. menit
Larutan C(ppm) tR luas
(menit) area*
Standar
sampel

Perhitungan
1. Faktor kapasitas (k’)
tR − t0
K′ =
t0
2. Faktor selektivitas (α)
K′2
α=
K′1
3. Uji linieritas kurva kalibrasi

Membuat kurva linier larutan standar dengan C (ppm) sebagai sumbu x, dan luas area
sebagai sumbu y. setelah kurva diperoleh dan didapatkan persamaan garis linier, untuk
menentukan konsentrasi sampel adalah dengan mensubstritusikan luas area sampel yang
diperloeh ke persamaan garis linier