Metode difusi pada awalnya dikembangkan oleh Bauer dkk.

(1966 cit Baker

dkk. 1991) sehingga metode difusi sering disebut sebagai Kirby-Bauer test.

124 Kemudian metode ini dikembangkan oleh National Committee for Clinical

Laboratory Standars.124 Prinsip dari metode difusi adalah antimikroba dijenuhkan ke

dalam cakram kertas (disc blank). Cakram kertas yang mengandung obat tertentu

ditanamkan pada media perbenihan agar padat yang telah dicampur dengan mikroba

uji. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Selanjutnya diamati

adanya daerah jernih di sekitar cakram kertas yang menunjukkan tidak adanya

pertumbuhan. Diameter zona hambat bisa dihitung dengan penggaris atau jangka

sorong (calliper) dalam satuan mm. Diameter zona hambat merupakan pengukuran

Kadar Hambat Minimum (KHM) secara tidak langsung dari zat antibakteri terhadap

mikroba. Ukuran dari zona hambat dapat dipengaruhi oleh kepadatan atau viskositas

dari media biakan, kecepatan difusi zat antibakteri, konsentrasi zat antibakteri,
sensitivitas mikroorganisme terhadap zat antibakteri dan interaksi zat antibakteri

dengan media.122,123,124

Cara pengukuran zona hambat dapat dilihat pada gambar 2.5122,123

8.1 Metode Dilusi

Pada awalnya metode difusi dikembangkan oleh Bauer dkk. (1966 cit Baker

dkk. 1991).124 Metode dilusi digunakan untuk menentukan kadar hambat minimal

(KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) dari suatu obat antimikroba. Uji kadar

hambat minimal (KHM) adalah uji untuk mengetahui konsentrasi minimum atau

terendah bahan uji yang masih menghambat pertumbuhan mikroorganisme di dalam

tabung (in vitro), dan merupakan konsentrasi antibakteri yang masih efektif untuk

mencegah pertumbuhan patogen dan mengindikasikan dosis yang efektif dalam

mengontrol infeksi. 122,123

Prinsip dari metode dilusi ini adalah menggunakan satu seri tabung reaksi

yang diisi media cair dan sejumlah tertentu sel mikroba yang diuji. Setelah itu

masing-masing tabung diuji dengan obat yang telah diencerkan secara serial. Seri

tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Konsentrasi terendah obat pada

tabung yang ditunjukkan dengan hasil biakan yang mulai tampak jernih (tidak ada

pertumbuhan mikroba) adalah KHM dari obat. Metode dilusi kemudian dilanjutkan

dengan pembiakan ulang atau subkultur pada media agar darah guna menentukan nilai kadar bunuh
minimal (KBM), yaitu konsentrasi terendah obat yang ditunjukkan

dengan idak terdapatnya pertumbuhan koloni mikroba. Nilai KBM ditentukan

sebagai konsentrasi bahan uji yang membunuh 99.9% melalui tes mikroorganisme

pada perbenihan asli.122