PAPER

EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI DNA

KELOMPOK 2
TLM 2B
Iin Inayati
Maidah Hayati
Rizqy Fauziah

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANTEN
JURUSAN ANALIS KESEHATAN
2018
 Ekstraksi DNA
dan Kuantifikasi DNA

Ekstraksi DNA memiliki dua tujuan utama: pertama, menjadi sangat efisien,
mengekstrak DNA yang cukup dari sampel untuk melakukan profiling DNA - ini
adalah semakin penting sebagai ukuran sampel berkurang - dan kedua, untuk
mengekstrak DNA yang cukup murni untuk analisis berikutnya - tingkat kesulitan di
sini sangat tergantung pada sifat dari sampel. Setelah DNA telah diekstrak mengukur
DNA secara akurat penting untuk analisis selanjutnya.

 Ekstraksi DNA
Ada banyak metode yang tersedia untuk mengekstraksi DNA. Pemilihan
metode yang akan digunakan tergantung pada sejumlah faktor, termasuk jenis sampel
dan kuantitas; kecepatan dan dalam beberapa kasus kemampuan untuk
mengotomatisasi prosedur ekstraksi; tingkat keberhasilan dengan sampel forensik,
yang merupakan hasil dari penggalian jumlah maksimum DNA dari sampel dan pada
saat yang sama menghapus setiap inhibitor PCR yang akan mencegah profiling
berhasil bahan kimia yang digunakan dalam ekstraksi, sebagian besar laboratorium
berusaha keras untuk menghindari menggunakan bahan kimia berbahaya; dan biaya
prosedur. Faktor lain yang penting adalah pengalaman staf laboratorium.

 Prinsip-Prinsip Umum Ekstraksi DNA

Tiga tahapan ekstraksi DNA dapat diklasifikasikan sebagai (i) gangguan dari
membran sel, sehingga sel lisis, (ii) denaturasi protein, dan akhirnya (iii) memisahkan
DNA dari protein terdenaturasi dan komponen seluler lainnya. Beberapa metode
ekstraksi yang umum digunakan di laboratorium forensik dijelaskan di bawah ini :

1. Chelex® 100 resin

Metode Chelex R 100 adalah salah satu teknik ekstraksi pertama kali diadopsi oleh
komunitas forensik. Chelex R 100 adalah resin yang terdiri dari stirena-
divinylbenzene kopolimer yang mengandung ion iminodiacetate dipasangkan. Resin
memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk ion logam polivalen, seperti magnesium
(Mg2+).
Prosedur ekstraksi sangat sederhana, Chelex R 100 resin yang disediakan sebagai
manik-manik, dibuat menjadi suspensi 5% menggunakan air suling. Bahan seluler
diinkubasi dengan Chelex R 100 suspensi di 56◦C selama 30 menit. Proteinase K,
yang mencerna protein selular yang paling sering ditambahkan pada saat ini. Inkubasi
ini diikuti oleh 8-10 menit pada 100◦C untuk memastikan bahwa semua sel telah
pecah dan protein yang terdenaturasi. Tabung ini kemudian hanya disentrifugasi
untuk pelet yang Chelex R 100 resin dan protein terdenaturasi di bagian bawah
tabung, meninggalkan larutan berair yang mengandung DNA yang akan digunakan
dalam PCR. The Chelex R 100 suspensi bersifat basa, antara pH 9,0 dan 11,0, dan
sebagai DNA hasil yang terisolasi menggunakan prosedur ini adalah single
terdampar.
Keuntungan utama dari metode ini adalah: sangat cepat, mengambil sekitar 1 jam;
itu adalah sederhana dan tidak melibatkan pergerakan cairan antara tabung, sehingga
mengurangi kemungkinan sengaja mencampur sampel; biaya sangat rendah; dan
menghindari penggunaan bahan kimia berbahaya. Yang penting, itu adalah setuju
untuk berbagai sampel forensik. Ekstrak DNA diproduksi menggunakan metode ini
relatif kasar tapi cukup bersih dalam kebanyakan kasus untuk menghasilkan profil
DNA.

2. Silica Berbasis DNA Ekstraksi

Dalam biologi molekuler umum, “salting out” prosedur telah banyak digunakan.
Tahap pertama dari ekstraksi melibatkan mengerami bahan selular di buffer lisis yang
berisi deterjen bersama dengan deterjen proteinase K umum digunakan adalah
natrium dodesil sulfat (SDS), Tween 20, Triton X-100 dan Nonidet P-40. Buffer lisis
mendestabilkan membran sel, menyebabkan kerusakan struktur selular. Penambahan
garam chaotropic, misalnya 6-M guanidin tiosianat atau 6-M natrium klorida, selama
atau setelah lisis sel, mengganggu struktur protein dengan mengganggu ikatan
hidrogen, interaksi Van der Waals, dan interaksi hidrofobik.
Protein seluler sebagian besar tidak larut dalam kehadiran agen chaotropic dan
dapat dihapus dengan sentrifugasi atau filtrasi. Kelarutan berkurang dari protein
selular disebabkan oleh kelebihan ion dalam konsentrasi tinggi garam bersaing
dengan protein untuk pelarut air, efektif dehidrasi protein. Umumnya digunakan kit
komersial, misalnya, Qiagen kit, mengeksploitasi prosedur salting-out; metode untuk
mengisolasi DNA setelah gangguan selular bervariasi.
Beberapa metode ekstraksi DNA didasarkan pada sifat mengikat dari silika atau
kaca partikel. DNA akan mengikat silika atau kaca partikel dengan afinitas tinggi di
hadapan garam chaotropic. Setelah komponen seluler lainnya telah dihapus DNA
dapat dilepaskan dari partikel silika / kaca dengan menangguhkan mereka di dalam
air. Tanpa garam chaotropic DNA tidak lagi mengikat silika / kaca dan dilepaskan ke
dalam larutan. Metode silika khususnya telah terbukti kuat ketika mengekstrak DNA
dari sampel forensik ; itu juga setuju untuk otomatisasi.
Keuntungan dari berdasarkan metode salting-out silika adalah bahwa mereka
menghasilkan DNA berat molec-ular tinggi yang lebih bersih daripada DNA dari
Chelex R 100 ekstraksi. Seperti Chelex R 100 ekstraksi, bahan kimia tidak ada yang
sangat beracun yang terlibat. Proses ini memakan waktu lebih lama dari Chelex R
100 dan melibatkan lebih dari satu perubahan dari tabung dan sehingga meningkatkan
kemungkinan sampel pencampuran dan kontaminasi silang.
3. Fenol-kloroform berbasis ekstraksi DNA
Metode fenol-kloroform telah banyak digunakan dalam biologi molekuler tetapi
telah perlahan-lahan dihapus sejak pertengahan 1990-an, sebagian besar karena sifat
beracun fenol. Hal ini masih digunakan di beberapa laboratorium forensik, khususnya
masih banyak digunakan untuk ekstraksi DNA dari sampel tulang dan tanah.
Sel lisis dilakukan seperti pada metode sebelumnya. Fenol-kloroform ditambahkan
ke lisat sel dan dicampur dan fenol denatures protein. Ekstrak tersebut kemudian
disentrifugasi dan protein diendapkan membentuk pelikel di antarmuka antara fase
fenol-kloroform organik dan fase air. Proses ini diulang dua sampai tiga kali atau
sampai tidak ada pelikel terlihat. DNA kemudian dimurnikan dari fase berair dengan
presipitasi etanol atau filter sentrifugasi. Metode ini menghasilkan DNA bersih tetapi
memiliki beberapa kelemahan: selain sifat beracun fenol, beberapa perubahan tabung
yang diperlukan dan proses ini padat karya.

4. FTA® kertas
Kertas FTA R digambarkan sebagai metode untuk koleksi sampel dan penyimpanan,
terutama dari penyeka bukal dan sampel darah segar. Setelah sampel diterapkan untuk
kertas FTA R itu adalah stabil pada suhu kamar selama beberapa tahun. Bahan selular
lisis pada kontak dengan kertas FTA R dan DNA menjadi terikat ke kertas.
Untuk menganalisis sampel DNA, langkah pertama adalah untuk mengambil
wilayah kartu kecil, biasanya lingkaran berdiameter 2 mm, menempatkannya ke
dalam tabung 1,5 ml dan komponen non-DNA hanya dicuci off, hanya menyisakan
DNA pada kartu. Lingkaran kecil kertas FTA R kemudian ditambahkan langsung ke
PCR. FTA ekstraksi kertas sangat sederhana untuk melakukan dan tidak memerlukan
beberapa perubahan tabung, sehingga mengurangi kemungkinan sampel
pencampuran.

 Ekstraksi DNA dari sampel yang menantang

Ekstraksi dari banyak sampel ditemui di laboratorium forensik, termasuk darah
dan sel-sel epitel menumpahkan, dapat dilakukan secara rutin menggunakan salah
satu teknik di atas. Namun ada beberapa jenis sampel yang memerlukan variasi pada
teknik dasar, yaitu sebagai berikut:

1. Air mani
Semen adalah salah satu jenis yang paling umum ditemui bukti biologis. Ekstraksi
DNA dari spermatozoa yang rumit oleh struktur spermatozoa. DNA ditemukan dalam
kepala spermatozoa yang dibatasi oleh akrosom pelindung yang kaya akan asam
amino sistein, sebuah number besar jembatan disulfida membentuk antara sistein
dalam akrosom. Proteinase K, yang merupakan proteinase umum, tidak bisa
melepaskan ikatan disulfida dan ini mengurangi efisiensi ekstraksi. Penambahan
dithiothreitol (DTT), agen mengurangi yang akan memecah ikatan disulfida, sangat
meningkatkan pelepasan spermatozoa DNA.
Komplikasi lain dengan air mani adalah bahwa hal itu sering pulih sebagai
campuran sper-matozoa dan sel-sel epitel. Akrosom bisa menjadi keuntungan dalam
kasus ini karena mungkin untuk melakukan lisis diferensial: sel-sel epitel dipecah
oleh kondisi lisis ringan dan spermatozoa dapat secara efektif dipisahkan dari sel-sel
epitel yang segaris.

2. Poros rambut
Poros rambut yang telah ditarik keluar sering memiliki akar yang kaya akan bahan
selular dan DNA dapat diekstraksi dengan menggunakan salah satu teknik yang
umum digunakan. Akar yang telah di tarik terbukti mengandung sebanyak 0,5 ug
DNA . Rambut yang telah ditumpahkan bila dalam fase telogen beristirahat sering
tidak mengandung bahan selular di sekitar akar. Poros rambut terdiri dari keratin,
jejak logam, udara dan pigmen fragmen sel, termasuk DNA dapat terjebak dalam
matriks rambut dan memberikan cukup DNA untuk menghasilkan profil. Namun,
rambut ini sangat sulit untuk menganalisis dan dalam banyak kasus itu mungkin
hanya berhasil untuk profil DNA mitokondria, meskipun DNA nuklir dalam beberapa
kasus dapat dipulihkan.
Batang rambut, seperti akrosom spermatozoa, kaya jembatan disulfida dan
membutuhkan baik mekanik grinding atau penambahan zat pereduksi seperti
dithiothreitol yang akan memecah ikatan disulfida dan memungkinkan proteinase K
untuk mencerna rambut protein dan melepaskan asam nukleat terjebak. Setelah
merilis DNA dapat diekstraksi dengan menggunakan prosedur salting-out atau fenol-
kloroform berdasarkan ekstraksi organik. Metode alternatif termasuk pencernaan
dalam buffer yang mengandung proteinase K diikuti oleh langsung PCR atau
melarutkan batang rambut sodium hidroksida dan setelah dinetralisir, DNA dirilis
terkonsentrasi menggunakan filter cen-trifugation.
Karena batang rambut mengandung tingkat yang sangat rendah, DNA itu adalah
rentan terhadap kontaminasi tapi tidak seperti jenis lain dari bukti biologis dengan
rendahnya tingkat DNA adalah mungkin untuk membersihkan batang rambut
sebelum ekstraksi DNA. Beberapa metode telah digunakan untuk membersihkan
rambut termasuk cuci di deterjen ringan, air dan etanol dan juga menggunakan
langkah lisis ringan dengan cara yang sama seperti yang digunakan dalam ekstraksi
diferensial air mani .

3. Jaringan keras
Menyusul pembunuhan, serangan teroris, perang dan kecelakaan fatal itu
diinginkan untuk kelompok bersama bagian tubuh dari individu ketika fragmentasi
telah terjadi dan akhirnya untuk mengidentifikasi almarhum. Jika waktu antara
kematian dan pemulihan tubuh pendek maka jaringan otot menyediakan sumber yang
kaya DNA, yang bisa digali menggunakan, misalnya, salah satu Chelex R, salting-out
dan metode ekstraksi organik. Namun, jika jaringan lunak yang menampilkan negara
maju dekomposisi mereka tidak akan memberikan DNA apapun yang cocok untuk
analisis. Ketika struktur selular rusak selama DECOM-posisi, enzim yang
mendegradasi DNA dilepaskan dan DNA dalam sel dengan cepat dicerna. Proses ini
dipercepat oleh aksi menjajah bakteri dan jamur.
Osteosit adalah sel berinti paling umum dalam matriks tulang. Dalam odontoblasts
gigi dalam dentin dan fibroblas di sel zona kaya rongga pulpa menyediakan sumber
sel berinti. Jaringan keras tubuh, tulang dan gigi memberikan perlindungan bagi
DNA. Selain hambatan fisik, hidroksiapatit/mineral apatit, yang merupakan
komponen utama dari jaringan keras, menstabilkan DNA yang menjadi erat terikat
pada mineral bermuatan positif. Interaksi ini membatasi aksi merendahkan enzim.
Jaringan keras memberikan keuntungan lebih bentuk-bentuk lain dari bahan biologis
karena mereka memiliki permukaan yang bisa dibersihkan untuk menghilangkan
DNA mengkontaminasi dengan menggunakan deterjen untuk menghilangkan jaringan
lunak, diikuti oleh perendaman fisik abrasi sodium hipoklorit (pemutih), dan paparan
sinar ultraviolet yang kuat.
Setelah dibersihkan, bahan tulang/gigi biasanya dipecah menjadi bubuk dengan
pengeboran atau grinding di bawah nitrogen cair. Bahan yang dihasilkan dekalsifikasi
menggunakan 0,5-M EDTA baik sebelum atau pada saat yang sama seperti lisis sel.
Organik fenol-kloroform dan metode ekstraksi silika yang mengikat biasanya
digunakan untuk mengekstrak DNA. Proses ekstraksi DNA dari sampel tulang
memakan waktu lebih lama dibandingkan dengan jenis lain dari sampel.

(A)
(B)
(C)
Gambar 1. Tulang dan gigi material dapat penuh semangat dibersihkan dengan
menggunakan: (a) abrasi untuk menghapus permukaan luar dan (b) mencuci di
deterjen dan pemutih untuk menghilangkan mencemari bahan. (C) Paparan sinar UV
yang kuat memperkenalkan dimer timin ke setiap DNA eksogen mengkontaminasi -
mencegah amplifikasi selama PCR.
 Kuantifikasi DNA
Setelah mengekstrak DNA pengukuran yang akurat dari jumlah DNA dan juga
kualitas dari ekstrak DNA yang diinginkan. Menambahkan jumlah yang benar DNA
untuk PCR akan menghasilkan hasil kualitas terbaik dalam waktu singkat,
menambahkan DNA terlalu banyak atau tidak cukup akan menghasilkan profil yang
sulit atau bahkan tidak mungkin untuk menafsirkan. Hal ini sangat penting ketika
profil sampel forensik, ketika itu sangat sulit untuk mengetahui keadaan pelestarian
bahan biologis dan juga, dalam banyak kasus, sulit untuk memperkirakan berapa
banyak bahan selular telah dikumpulkan.
Hal ini kurang penting untuk mengukur DNA bila menggunakan beberapa sampel
referensi - di mana jumlah yang sama dari DNA dapat diharapkan untuk diekstraksi
setiap kali karena tidak ada sangat banyak variabel. Walaupun demikian, banyak
laboratorium masih akan mengukur DNA dari sampel referensi sebagai bagian dari
analisis standar mereka. Menanggapi pentingnya kuantifikasi sampel pulih dari TKP,
Dewan Penasehat DNA di Amerika Serikat mengadopsi aturan yang membuat
kuantifikasi DNA manusia wajib.
Jumlah DNA yang dapat diekstraksi dari sampel sangat tergantung pada jenis
material. Setiap sel berinti mengandung sekitar 6 pg DNA: cairan darah mengandung
5000-10 000 sel darah berinti per mililiter; air mani mengandung rata-rata 66 juta
spermatozoa per mililiter (ejakulasi rata-rata menghasilkan 2,75 ml air mani) .
Sampel biologis pulih dari TKP biasanya tidak di kondisi murni dan sering terdiri dari
jumlah yang sangat kecil, akibatnya, jumlah DNA yang dapat dipulihkan bisa sangat
rendah dan sulit untuk diukur.

1. Visualisasi pada gel agarosa

Sebuah metode yang relatif cepat dan mudah untuk menilai kuantitas dan kualitas
DNA diekstraksi adalah untuk memvisualisasikan itu pada gel agarosa. Agarose
merupakan polimer yang dapat dituangkan ke dalam berbagai bentuk gel - Mini gel
kira-kira 10 cm panjang yang cukup untuk memvisualisasikan DNA. Gel terendam
dalam elektroforesis penyangga dan DNA dimuat ke sumur yang terbentuk dalam gel
dengan sisir, arus listrik diterapkan di gel dan DNA bermuatan negatif bermigrasi
menuju anoda.
Gel agarosa membentuk matriks berpori dan molekul DNA yang lebih kecil
bergerak melalui gel lebih cepat daripada molekul DNA yang lebih besar. Pewarna
yang intercalate dengan helix ganda DNA, seperti etidium bromida, dapat
ditambahkan ke gel baik sebelum atau setelah elektroforesis, jumlah pewarna
diselingi sebanding dengan kuantitas DNA. Sebuah pewarna alternatif, DAPI (4, 6-
diamidino-2-phenylindole), dapat ditambahkan langsung ke DNA sebelum
elektroforesis. Ini bermigrasi melalui gel terikat pada alur kecil DNA beruntai ganda.
 DNA divisualisasikan dengan menempatkan gel pada transilluminator yang
memancarkan cahaya UV pada 260 nm. Standar kuantifikasi dapat dijalankan
sepanjang sisi sampel yang tidak diketahui untuk memungkinkan konsentrasi DNA
untuk diperkirakan. Selain menampilkan kehadiran DNA, ukuran molekul DNA yang
diekstrak juga dapat diperkirakan. DNA berat molekul tinggi dapat dilihat sebagai
sebuah band tunggal sementara DNA yang rusak atau DNA yang telah dicukur
selama ekstraksi muncul sebagai smear. Hal ini membuat perbandingan dengan
standar sulit karena DNA yang tersebar di berbagai daripada di sebuah band tunggal.
Ini bermigrasi melalui gel terikat pada alur kecil DNA beruntai ganda.
Standar kuantifikasi dapat dijalankan sepanjang sisi sampel yang tidak diketahui
untuk memungkinkan konsentrasi DNA untuk diperkirakan. Selain menampilkan
kehadiran DNA, ukuran molekul DNA yang diekstrak juga dapat diperkirakan. DNA
berat molekul tinggi dapat dilihat sebagai sebuah band tunggal sementara DNA yang
rusak atau DNA yang telah dicukur selama ekstraksi muncul sebagai smear. Hal ini
membuat perbandingan dengan standar sulit karena DNA yang tersebar di berbagai
daripada di sebuah band tunggal.
Keuntungan dari elektroforesis gel agarosa adalah bahwa itu adalah cepat dan
mudah untuk melaksanakan dan juga memberikan indikasi ukuran molekul DNA
yang telah diekstrak. Kerugiannya adalah bahwa quantifications bersifat subjektif,
berdasarkan relatif Band intensitas sulit untuk mengukur jumlah DNA terdegradasi
karena tidak ada standar referensi yang cocok. Total DNA terdeteksi yang bisa
menjadi campuran manusia dan DNA mikroba, dan ini dapat menyebabkan lebih
perkiraan konsentrasi DNA itu tidak dapat digunakan untuk mengukur sampel
diekstraksi menggunakan metode Chelex karena ini menghasilkan DNA beruntai
tunggal dan pewarna fluorescent yang intercalate dengan DNA beruntai ganda tidak
mengikat DNA beruntai tunggal.

2. Ultraviolet spektrofotometri
DNA menyerap cahaya secara maksimal pada 260 nm. Fitur ini dapat digunakan
untuk memperkirakan jumlah DNA dalam ekstrak dan dengan mengukur berbagai
panjang gelombang dari 220 nm sampai 300 nm juga memungkinkan untuk menilai
jumlah karbohidrat (maksimum absorbansi 230 nm) dan protein (absorbansi
maksimum 280 nm) yang mungkin co-diekstraksi dengan sampel. DNA ditempatkan
dalam kuvet kuarsa dan cahaya bersinar melalui; absorbansi diukur terhadap standar.
Sebuah ekstrak DNA bersih akan menghasilkan kurva seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 4.5; jika ekstrak DNA bersih, rasio absorbansi pada 260 nm dan 280 nm
harus antara 1,8 dan 2,0.
Spektrofotometri umumnya digunakan untuk kuantifikasi dalam biologi molekuler
lab-oratorium namun belum banyak diadopsi oleh komunitas forensik. Kerugian
utama adalah bahwa hal itu sulit untuk mengukur sejumlah kecil DNA secara akurat
menggunakan spektrofotometri, itu bukan manusia yang spesifik dan lainnya bahan
kimia, untuk ujian-ple, pewarna dari pakaian dan asam humat dari sampel tulang,
dapat mengganggu analisis.

Gambar 2. UV absorbansi dengan larutan yang mengandung DNA maksimal pada 260 nm. 260: rasio 280
dari 1,91 menunjukkan bahwa ekstrak tersebut tidak terkontaminasi dengan protein.

3. Fluoresensi spektrofotometri
Etidium bromida atau DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) dapat digunakan
untuk memvisualisasikan DNA dalam gel agarose ini adalah contoh bahan kimia
yang berpendar di tingkat yang jauh lebih tinggi ketika mereka intercalate dengan
DNA. Selain gel agarosa pewarnaan, pewarna fluorescent juga dapat digunakan
sebagai alternatif untuk spektrofotometri UV untuk kuantisasi DNA.
Berbagai pewarna telah dikembangkan yang dapat digunakan dengan pembaca mi-
croplate neon dan ini sangat sensitif. PicoGreen R pewarna spesifik untuk DNA
beruntai ganda dan dapat mendeteksi sesedikit 25 pg/ml DNA [35]. Ketika PicoGreen
R mengikat DNA fluoresensi meningkat dye lebih dari 1000 kali lipat - bromida
etidium dibandingkan kenaikan fluoresensi 50-100 kali lipat ketika intercalates
dengan double terdampar DNA.

4. Hibridisasi
Metode kuantifikasi berdasarkan hibridisasi telah banyak digunakan dalam
genetika forensik sejak awal 1990-an, khususnya kit yang tersedia secara komersial
Quantiblot R (Applied Biosystems). DNA diekstraksi diterapkan pada membran nilon
bermuatan positif menggunakan slot atau proses dot blot; DNA ini kemudian
ditantang dengan probe yang khusus untuk DNA manusia. Target yang umum
digunakan adalah repeat satelit D17S1 alpha yang ada di kromosom manusia 17 di
500-1000 eksemplar. Probe dapat diberi label dalam berbagai cara termasuk
kolorimetri dan chemiluminescent.
Serangkaian standar diterapkan untuk membran, dan perbandingan dari sinyal dari
DNA diekstraksi dengan standar memungkinkan kuantifikasi. Keuntungan dari
metode berbasis hibridisasi adalah bahwa kuantifikasi adalah khusus manusia -
elektroforesis gel agarosa dan spektrofotometri mendeteksi DNA total dan forensik
sampel yang telah terkena lingkungan untuk waktu yang lama rentan terhadap
kolonisasi oleh bakteri dan jamur.
Sistem hibridisasi menderita dari kurangnya sensitivitas. Untuk sampel
menghasilkan hasil negatif dalam banyak kasus masih mungkin untuk menghasilkan
profil setelah PCR. Analisis hasil juga subjektif, yang mengarah operator yang
berbeda untuk datang ke kesimpulan yang berbeda. Selain sensitivitas terbatas, proses
ini padat karya, mengambil sekitar 2 jam untuk menghasilkan blot. metode berbasis
hibridisasi yang secara luas digantikan oleh sistem PCR real-time.

5. Real-time PCR

Saat membuat profil DNA, produk PCR biasanya dianalisis di titik akhir setelah
28-34 siklus. Namun demikian, mungkin untuk memantau generasi produk PCR
seperti yang dihasilkan real time. Ini adalah pertama dikembangkan menggunakan
bromida etidium: sebagai produk PCR yang dihasilkan dalam setiap siklus, lebih
etidium bromida intercalates dengan molekul DNA beruntai ganda dan berfluoresensi
di bawah sinar UV. Kenaikan fluoresensi dapat dideteksi menggunakan cocok
'kamera'. Semakin sensitif tes telah dikembangkan, seperti SYBR R Hijau dan sistem
TaqMan R. Menggunakan SYBR R Hijau, sebagai produk PCR yang dihasilkan,
pewarna mengikat produk untai ganda dan meningkat fluoresensi.
Sistem TaqMan R menggunakan pendekatan yang berbeda, dengan dua primer dan
probe; probe dalam wilayah didefinisikan oleh primer dan diberi label pada ujung 5
dengan molekul neon dan di 3 akhir dengan molekul yang memuaskan fluoresensi.
Sebagai primer diperluas oleh Taq polimerase, salah satunya memenuhi probe, yang
terdegradasi oleh polymerase, melepaskan probe dan pemadam ke dalam larutan -
pendinginan yang efisien dari molekul neon hanya terjadi ketika mereka berada di
dekat pada probe molekul.
Sebagai produk PCR lebih dihasilkan, molekul lebih fluorescent dilepaskan dan
fluoresensi dari sampel meningkat. Real-time tes yang sangat sensitif, manusia yang
spesifik dan tidak padat karya.

6. DNA IQTM sistem

Sebuah pendekatan baru untuk kuantifikasi digunakan dalam DNA IQ tersedia
secara komersialTMIso-lation System (Promega Perusahaan). Metode isolasi
didasarkan pada salting-out dan mengikat untuk silika: jumlah yang sangat spesifik
silika dilapisi manik-manik ditambahkan ke ekstraksi dan ini mengikat jumlah
maksimum DNA; Oleh karena itu, ketika DNA tersebut dielusi dari manik-manik
konsentrasi maksimum diketahui. Ini memiliki keuntungan dari menggabungkan
langkah-langkah ekstraksi dan kuantifikasi tetapi memiliki kelemahan karena tidak
spesifik manusia.
 DAFTAR PUSTAKA

Goodwin, william. Adrian Linacare. Sibte hadi 2007. An introduction To Forensic

Genetics. New Delhi, India:Wiley