TEKNIK ISOLASI,PENGECATAN DAN MORFOLOGI BAKTERI

Risky Bima Purnawan

ABSTRAK

Isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari medium atau lingkungan asalnya dan

menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan yang murni. Bakteri dipindahkan dari satu
tempat ke tempat lainnya harus menggunakan prosedur aseptik.Teknik isolasi bakteri dengan tabur yaitu
menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 45-50 oC dengan suspensi bahan  yang
mengandung mikroba, dan menuangkannya ke dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni-
koloni yang tersebar di permukaan agar yang mungkin berasal dari 1 sel bakteri. Metode goresan umumnya
digunakan mengisolasi koloni mikroba pada cawan agar sehingga didapatkan koloni terpisah dan merupakan
biakan murni.Dasar metode ini yaitu dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung mikroba pada
permukaan medium agar yang sesuai pada cawan petri. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh
koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari 1 sel mikroba.Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang
digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun
bakteri gram negative akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengana lkohol, dan sewaktu
diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding sel

Kata kunci :isolasi bakteri,mikroba,alkohol,zat pewarna,bakteri garam negatif.

1. PENDAHULUAN

Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil
tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus,
sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan
melengkung [1]

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri
dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya
muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang
sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku [4]

AdaBakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya
yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus,
diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah
melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal
tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi [1]

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas,
begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana
sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
 berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan [3].

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya
sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan
pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.
Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus.
Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan
diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan
diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-
kelompok tahan asam dan tidak tahan asam [1]

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih
dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini
disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah
untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur
dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat
fisik atau kimia jazad dapat diketahui [2].

2. MATERIAL DAN METODE

2.1. Material
Bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah suspense bahan yang mengadungbakteri, M
NA (medium Nutrien Agar) tegak, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Larutan cat nigrosine atauti
ntacina, Alkohol, Minyakimersi, Larutan cat Hucker’s crystal violet (Gram A), Larutan MordanL
ugol’s iodine (Gram B), Larutanpencuciatau alcohol (Gram C), danLarutan cat safranin (Gram D).
2.2. Alat/Instrumen

Alat – alat yang digunakan dalam praktikum adalah penangas air, petridish, etiket, gelas ben
da, preparat, mikroskop perbesaran, lampuspiritus, dan pipet tetes.

2.3. Prosedur Kerja

2.3.1 Teoritis
A. Teknik Isolasi Bakteri
1) Cara goresan (Streak plate method)
 Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
 Dinginkan sampai temperatur kurang lebih 500C.
 Tuangkan MNA tegak tersebut ke dalam petridish steril secara aseptik, biarkan sampai dingin
dan padat.
 Ambil satu ose suspensi bahan yang mengandung bakteri secara aseptik, kemudian buat
goresan pada permukaan agar.
 Bungkus dan beri etiket, dan inkubasikan selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar.
 Sesudah inkubasi akan tampak koloni-koloni yang terpisahterpisah.
 Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh berdasarkan bentuk koloni.
2) Cara taburan (Pour plate method)
 Suspensikan bahan yang mengandung bakteri seencer mungkin, maksudnya agar kelak terjadi
koloni-koloni yang terpisahterpisah sehingga dengan mudah dapat diisolasi.
  Cairkan MNA tegak dalam penangas air.
 Dinginkan MNA tegak tersebut sampai temperatur kurang lebih500C,selanjutnya
inokulasikan dengan satu ose suspensi bahanyang mengandung bakteri.
 Gojog hati-hati agar tercampur merata.
 Tuangkan dalam petridish secara aseptik dan ratakan.
 Beri etiket, bungkus dan inkubasikan selama 48 jam secara terbalik pada suhu kamar.
 Amati dan hitung berapa macam koloni yang tumbuh berdasar bentuk koloni.
B. Pengecatan dan Morfologi Bakteri
1) Pengecatan negatif
 Bersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian panggang di atas nyala
lampu spiritus.
 Setelah dingin, ambil suspensi biakan mumi Bacillus subtilis dengan ose secara aseptik dan
letakkan di atas gelas benda.
 Kemudian mlbil sedikit larutan cat nigrosin atau tinta cina, campurkan dengan suspensi
bakteri, ratakan dengan batang gelas hingga merupakan lapisan yang tipis sekali.
 Selanjumya preparat dikering anginkan.
 Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi.
 Gambar preparat bakteri tersebut.
 Ulangi I Sampai dengan 6 untuk biakan mumi Escherichia coli.
2) Pengecatan gram
 Bersihkan gelas benda dengan alkohol hingga bebas lemak kemudian panggang di atas nyala
lampu spiiritus.
 Ambil secara aseptik satu ose suspensi bakteri Bacillus subtilis dan letakkan pada gelas
benda. Ratakan suspensi bakteri tersebut.
 Kering anginkan, dan selanjutnya lakukan fiksasi di atas nyala lampu spiritus.
 Setelah dingin bubuhkan cat utama (Gram A) sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1
menit.
 Cuci dengan air mengalir, kemudian kering anginkan.
 Tetesi dengan larutan mordan (Gram B) dan biarkan selama 1 menit, cuci dengan air mengalir
dan kering anginkan.
 Kemudian cuci dengan larutan pencuci atau alkohol (Gram C) selama kurang lebih 30 detik,
selanjutnya cuci dengan air mengalir dan kering anginkan.
 Beri larutan cat penutup (Gram D) selama 2 menit.
 Cuci dengan air mengalir dan kering anginkan.
 Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat dengan minyak imersi. Bakteri gram
positif berwarna violet, gram negatif berwarna merah, dan gram variabel dapat berwarna
merah atau berwarna violet.
 Gambar hasil-hasil pengecatan bakteri dengan diberi keterangan mengenai bentuk sel, wama
dan reaksi pengecatan.
 Ulangi pekeıjaan I sampai dengan II untuk biakan murni escherechia coli .
3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 1. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni

No Hasil Pengamatan Bentuk Koloni Bentuk Tepi Struktur Dalam Koloni

1.
Curled Undulate Coarsely Granula
2.
Curled Undulate Smooth

Tabel 2. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram Positif

No Hasil Pengamatan Bentuk Koloni Warna
.
1.
Myceloid Merah
2.
Myceloid Violet

Tabel 3. Hasil Pengamatan Pengecatan Gram Negatif

No. Hasil Pengamatan Bentuk Koloni
1.
Myceloid
2.
Myceloid

Gambar 1. Hasil Pengamatan Pertumbuhan Bakteri Terhadap Teknik Isolasi

Adapun yang akan di bahas pada praktikum ini ialah mengenai teknik isolasi
bakteri,pengecatan dan morfologi bakteri. Dalam teknik isolasi bakteri dapat dilakukan dengan dua
cara, yaitu cara goresan dan cara taburan. cara pertama adalah cara goresan dilakukan dengan
menuangkan medium ke dalam cawan petri kemudian ambil satu atau dua ose biakan bakteri dan
goreskan ke dalam cawan yang berisi medium secara zig zag, sedangkan pada cara taburan dilakukan
dengan memasukkan satu atau dua ose biakan bakteri ke dalam tabung raeaksi yang berisi medium
kemudian digogog lalu tuangkan ke cawan petri. Medium yang digunakan adalah medium MNA.
Teknik isolasi bakteri diinkubasikan selama 48 jam dan setelah itu dilakukan pengamatan. Setelah
dilakukan pengamatan dapat diketahui bahwan bentuk koloni yang tumbuh dari cara goresan dan
taburan adalah berbentuk bulat atau circul air.
Pada peroses pengecatan bakteri dilakukan dengan dua cara juga yakni teknik pengecatan
negatif dan pengecatan gram. Ada perbedaan diantara keduanya yakni pengecetan negatif
 menggunakan bahan tinta cina sedangkan pengecatan gram menggunakan bahan (gram A), (gram B),
(gram C) dan (gram D). Adapun fungsi dari penambahan larutan tinta cina dan gram adalah untuk
mengethui bakteri yang diamati masih hidup atau sudah mati di dalamnya. Melihat dan mengamati
bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan
sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri,
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam melakukan penelitian-penelitian mikrobiologi
Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar
belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan
sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif,
metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi latar belakngnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan.Teknik ini biasanya digunakan untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel-selnya.

4. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat di ambil dari praktikum isolasi bakteri,pengecatan dan morfologi bakteri
maka dapat disimpulkan bahwa, pada Isolasi bakteri merupakan proses mengambil bakteri dari
medium atau lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan
yang murni.selain itu Bakteri dipindahkan dari satu tempat ke tempat lainnya harus menggunakan
prosedur aseptik. Pada pratikum ini juga menerapkan dengan cara goresan, Cara goresan dapat
dilakukan dengan menuangkan medium ke dalam cawan petri kemudian ambil satu atau dua ose
biarkan bakteri dan goreskan ke dalam cawan yang berisi medium secara zig-zag. Fungsi dari
penambahan larutan tinta cina dan gram adalah untuk mengetahui bakteri yang diamati masih hidup
atau sudah mati.bakteri yang masih hidup ditandai dengan memiliki bentuk/warna transparan
sedangkan yang mati akan memiliki warna biru

REFERENSI
[1] Dwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang
[2] Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I, Jakarta
[3] Khairunnisa, A. 2016. Mikrobiologi Pewarnaan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta
[4] Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium,Jakarta

[5] Puspitasari, F, D. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Aerob Proteolitik dari Tangki Septik,Universitas
Indonesia, Jakarta.
[6] Sutedjo, Mul Mulyani.1991.Mikrobiologi Tanah,Jakarta
 BUKTI JURNAL
Jurnal 1.
Jurnal 2
Jurnal 3