SPEKTROFOTOMETRI

I. TUJUAN PERCOBAAN
1. Untuk mengetahui tentang spektrofotometri.
2. Untuk mengetahui tentang macam-macam spektrofotometer.
3. Untuk memahami prinsip dan cara kerja dari peralatan instrumen
spektrofotometer.
4. Untuk menentukan absorban larutan Methylen Red dan Methylen Blue
pada panjang gelombang 380 – 600.

II. TEORI DASAR

Spektrofotometri adalah sebuah metode analisis untuk mengukur konsentrasi
suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas
sinar atau cahaya. Spektofotometri juga merupakan metode dalam kimia analisis
yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif
dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan
cahaya.Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer.Spektrofotometri adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer
dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi.Istilah spektrofotometri berhubungan
dengan pengukuran energi radiasi yang diserap oleh suatu sistem sebagai fungsi
panjang gelombang dari radiasi maupun pengukuran panjang absorpsi terisolasi
pada suatu panjang gelombang tertentu (Underwood, 1988).
Spektrofotometri adalah teknik yamng digunakan untuk mendeteksi atau
mengidentifikasi dan mengukur kadar senyawa kimia yang terdapat dalam
sample. Dasar dari spektrofotometri adalah bahan kimia dapat menyerap dan
menghantarkan cahaya serta semua larutan harus berwarna.
        Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :
a) Spektrofotometer ultraviolet
b) Spektrofotometer sinar tampak
c) Spektrofotometer infra merah

1
d) Spektrofotometer serapan atom
Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat
yang berbeda.Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah
ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm).Cahaya di
dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron
valensi di dalam molekul tersebut.
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau
gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi
rendah.Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron
bebas.Kromofor-kromofor organik seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan
karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak.Panjang gelombang
maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan.Auksokrom
adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil,
metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran
pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan
peningkatan intensitas. Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi
dua kemungkinan.Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan
kemungkinan kedua adalah cahaya discattering.Bila energi dari cahaya (foton)
harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul
tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam
spektrofotometer.
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya
monokromatik dari sumber sinar.Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet
(tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap
oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar
pembaca (Sastrohamidjojo, 1992).
Hasil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia, dapat dilihat
berdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan.Akurasi menunjukkan
kedekatan nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya.Untuk menentukan
tingkat akurasi perlu diketahui nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan
kemudian dapat diketahui seberapa besar tingkat akurasinya.Presisi menunjukkan
tingkat reliabilitas dari data yang diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar

2
deviasi yang diperoleh dari pengukuran, presisi yang baik akan memberikan
standar deviasi yang kecil dan bias yang rendah. Jika diinginkan hasil pengukuran
yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan, misalnya dalam penentuan nilai
konsentrasi suatu zat dalam larutan larutan dilakukan pengulangan sebanyak n
kali. Ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi sedangkan
spektrofotometri adalahpengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi
elektromagnetik pada satu atau lebih panjanggelombang dengan suatu transduser
(detektor). Spektrofotometri adalah analisis kuantitatif yang paling sering
digunakan karena mempunyai sensitivitas yang baik yaitu 10-4 sampai 10-6.
Analisis jenis ini juga relatif selektif dan spesifik, ketepatannya cukup tinggi,
relatif sederhana, dan murah ( Mathias, 2005 ).
Interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan
sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun
spektroskopi emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi
penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga
spektrofotometri disebut juga sebagaispektroskopi absorbsi( Eka, 2007 ).
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hokum Lambert-Beer, bila cahaya
monokromatik (I0),melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut
diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Transmitans adalah perbandingan intensitas cahaya yang di transmisikan ketika
melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati
sampel (Io). Persyaratan hokum Lambert-Beer antara lain : Radiasi yang
digunakan harus monokromatik, energi radiasi yang di absorpsi oleh sampel tidak
menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorpsi harus homogen,
tidak terjadi flouresensi atau phosphoresensi, dan indeks refraksi tidak
berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan harus pekat (tidak encer).

Jenis-jenis Spektrofotometri
Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasarkan sumber cahaya yang
digunakan.  Diantaranya adalah sebagai berikut :
1)   Spektrofotometri Vis (Visible)

3
 Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energy dalah
cahaya tampak (Visible).Cahaya visible termasuk spectrum elektromagnetik yang
dapat ditangkap oleh mata manusia.Panjang gelombang sinar tampak adalah 380-
750 nm.Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia, maka sinar
tersebut termasuk kedalam sinar tampak (Visible).

2) Spektrofotometri UV (Ultra Violet)

  Berbeda dengan spektrofotometri Visible, pada spektrofometri UV
berdasarkan interaksi sampel dengan sinar UV.Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm.Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu
deuterium.Deuterium disebut juga heavy hydrogen. Dia merupakan isotop
hydrogen yang stabil tang terdapat berlimpah dilaut dan didaratan.
 Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata manusia maka senyawa yang
dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki
warna.Bening dan transparan.

3) Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible.Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible.Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
      Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling
populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible
atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan
spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat.  Ini berarti menggunakan
cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan
inframerah (NIR)) kisaran.  Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara
langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat.  Di wilayah ini dari
spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi elektronik.  Teknik ini

4
melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan transisi dari
ground state ke eksited state. 

Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
a.    Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.
b.    Penyerapan oleh transisi elektron d dan f dari molekul kompleks
c.    Penyerapan oleh  perpindahanmuatan.

Interaksi antara energy cahaya dan molekul dapat digambarkan sbb :

E = hv
Dimana :
E = energy (joule/second)
h = tetapan plank
v = frekuensi foton

4) Spektrofotometri IR (Infra Red)

  Spektrofotometri ini berdasar kepada penyerapan panjang gelombang
Inframerah. Cahaya Inframerah, terbagi menjadi inframerah dekat, pertengahan
dan jauh. Inframerah pada spektrofotometri adalah adalah inframerah jauh dan
pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 mikrometer.Hasil
analisa biasanya berupa signalkromatogram hubungan intensitas IR terhadap
panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sampel akan dibandingkan dengan
signal standard.
Diagram Peralatan Spektrofotometer

5
 Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual
dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh
suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu
perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang
berbeda.

Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :

A =     log ( Io / It )         =  a b c

Keterangan  :

Io = Intensitas sinar datang

It = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorptivitas

b = Panjang sel/kuvet

c = konsentrasi (mg/L)

A = Absorban

Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari

filter fotometri sebagai berikut :

1. Daerah jangkauan spektrum

Filter fotometer hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak
(400-750 nm). Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah
tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm).

2. Sumber sinar

Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer

menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar
tampak, UV, IR). Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah
tampak.

3. Monokromator

Filter fotometer menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro

digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.

6
4. Detektor

-   Filter fotometer menggunakan detektor fotosel

-   Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.

Pada percobaan ini, dilakukan pengukuran larutan Methylen Red (MR) dan
Methylen Blue (MB) pada panjang gelombang 380 – 600 nm.

III. PROSEDUR KERJA

III.1 ALAT
1. Spektrofotometer untuk mengukur transmitan larutan
2. Buret 50 mL untuk mengeluarkan zat secara teliti
3. Gelas piala 250 mL untuk melarutkan zat secara tidak teliti
4. Labu ukur 100 mL untuk melarutkan zat secara teliti
5. Gelas ukur 100 mL untuk mengambil zat secara tidak teliti
6. Pipet gondok 1 mL untuk memipet larutan secara teliti
7. Standar tempat tegaknya alat gelas
8. Klem untuk menjepit alat gelas pada standar
9. Tabung reaksi 10 mL sebagai tempat larutan standar
10. Rak tabung reaksi tempat meletakkan tabung reaksi
11. Corong untuk membantu memindahkan larutan
12. Pipet tetes untuk mengambil larutan per tetes
13. Botol semprot untuk menyimpan aquades

III.2 BAHAN
1. Aquades sebagai pembilas alat gelas
2. HCl 0,1 N sebagai pelarut
3. Methylen Red0,1 % sebagai larutan yang akan diukur
4. Methylen Blue 0,1 % sebagai larutan yang akan diukur

7
III.3 CARA KERJA
1. Pembuatan Larutan Deret Standar
a. Dipipet 1 mL larutan Methylen Red (MR) dalam labu ukur 100 mL
dan diencerkan dengan HCl 0,1 N sampai tanda batas dan
dihomogenkan.
b. Dipipet pula 1 mL larutan Methylen Blue (MB) ke dalam labu ukur
100 mL dan diencerkan dengan larutan HCl 0,1 N sampai tanda
batas. Dan dihomogenkan.
c. Diisi tabung reaksi pertama dengan HCl 0,1 N sebagai blanko dan
tabung reaksi kedua dengan larutan Methylen Red dan tabung reaksi
ketiga dengan larutan Methylen Blue.
2. Pengukuran % Transmitan dengan Spektrofotometer
a. Dihidupkan alat spektrofotometer dan ditunggu sampai alat stabil.
b. Diatur alat untuk pengukuran transmitan (%T).
c. Diatur panjang gelombang dengan menekan tombol atas bawah pada
spektrofotometer.
d. Dimasukkan larutan blanko yag terdapat dalam tabung reaksi ke
dalam alat spektrofotometer, sebelumnya dilap bagian luar tabung
reaksi dengan tisu dan pegang bagian atas tabung reaksi, dan bagian
yang bertanda putih dihadapkan ke depan.
e. Dilakukan setting blank setiap pergeseran panjang geombang.
f. Setelah blanko di set 100 %T, dikeluarkan tabung reaksi.
g. Dimasukkan tabung reaksi yang berisi larutan Methylen Red, dan
dibaca transmitannya.
h. Dilakukan juga hal yang sama untuk larutan Methylen Blue dan
larutan tugas (Cx).
i. Dibuat kurva kalibrasi standar hubungan panjang gelombang dengan
absorban.

8
III.4 SKEMA KERJA
III.4.1 Pembuatan larutan deret standar

Dipipet 1 mL larutan Methylen Red

(MR) dalam labu ukur 100 mL

Diencerkan dengan HCl 0,1

N sampai tanda batas dan
dihomogenkan.

Dipipet pula 1 mL larutan

Methylen Blue (MB) ke dalam
labu ukur 100 mL

Diencerkan dengan larutan HCl

0,1 N sampai tanda batas. Dan
dihomogenkan

Diisi tabung reaksi pertama

dengan HCl 0,1 N sebagai
blanko

Tabung reaksi kedua dengan

larutan Methylen Red dan tabung
reaksi ketiga dengan larutan
Methylen Blue.

Larutan standar siap diukur

9
III.4.2 Pengukuran dengan Alat Spektrofotometer

Dihidupkan alat spektrofotometer dan

ditunggu sampai alat stabil

Diatur panjang
gelombang dan %T

Diukur blanko (set 100 %T) dan

diukur %T larutan MR dan MB

Diukur juga untuk larutan

tugas (Cx)

Dibuat kurva kalibrasi standar

(Absorban vs panjang gelombang)

IV. PENGAMATAN
Larutan MR 0,1 % Larutan berwarna merah, bening
Larutan MB 0,1 % Larutan berwarna biru, bening
HCl 0,1 N Larutan bening, tak berwarna
Aquades Larutan bening tak berwarna

10
V. PEMBAHASAN
Pada praktikum ini, larutan methylen red dan methylen blue yang
digunakan harus diencerkan terlebih dahulu. Agar memudahkan kita untuk
mengukur nilai transmitan dari larutan tersebut.Berdasarkan grafik yang terbentuk
dimana garis warna merah menunjukkan serapan dari metil red.Sedangkan garfik
yang terbentuk dimana garis warna biru menunjukkan serapan dari metilen
blue.Sehingga diperoleh titik isobestik dari kedua grafik tersebut.

VI. KESIMPULAN DAN SARAN

VI.1 KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa titik
isobestik adalah titik pada panjang gelombang tertentu serapannya tidak
dipengaruhi oleh pH.
VI.2 SARAN
Supaya didapatkan hasil yang tepat dan akurat, larutan standar maupun
larutan sampel harus benar-benar homogen.Sehingga nilai transmitannya dapat
diukur dengan baik oleh spektrofotometer.

11
VII. DAFTAR PUSTAKA

Eka. 2007. Metode Analisa Kimia-Spektrofotometri. Jakarta : Gramedia.

Imam. 2006. Kimia Analisa Semi Makro dan Mikro. Jakarta : Erlangga.

Khopkar,1990Konsep Dasar Kimia Analitik.Jakarta : Universitas Indonesia.

Mathias, Ahmad. 2005. Spektrofotometri. Solo: Exacta.

Sastrohamidjojo, Hardjono. 1992. Spektroskopi Inframerah. Yogyakarta : Liberty

Yogyakarta.

Suparno. 1994. Fisika Dasar 2.Jakarta : Erlangga.

Underwood, dkk. 1998.Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga.

12