ILTEK : Jurnal Teknologi p-ISSN : 1907-0772

Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022 e-ISSN : 2721-3447

PENGEMBANGAN METODE PENENTUAN NITRIT DAN NITRAT DALAM

DAGING SEGAR DAN PRODUK DAGING OLAHAN SECARA
SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Firman Shantya Budi1, Havizul2

1.Program Studi Pendidikan Guru Madrasah Ibtidaiyah, Fakultas Tarbiyah dan Ilmu Pendidikan, Institut Agama Islam
Negeri Pontianak
2. Program Studi Tadris Matematika Fakultas Tarbiyah dan Ilmu Pendidikan, Institut Agama Islam Negeri Pontianak
Email : firman_chem07@yahoo.com

ABSTRAK

Validasi metode analisis nitrit dan nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan secara spektrofotometri
UV-Vis dengan pereaksi sulfanilamida dan N-naftiletilendiamina (NEDA) telah dilakukan. Tujuan dari penelitian ini
adalah untuk mendapatkan metode analisis nitrit dan nitrat pada kondisi optimum yang memenuhi parameter. Nitrat
direduksi menjadi nitrit menggunakan reduktor serbuk Zn. Optimasi metode analisis dilakukan sebelum validasi. Tahap
selanjutnya metode divalidasi dengan pendekatan spiking buta nol berdasarkan parameter validasi meliputi linieritas,
sensitivitas, batas deteksi, batas kuantifikasi, ketelitian dan ketepatan. Metode diaplikasikan untuk penentuan nitrit dan
nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan (sosis, daging asap dan kornet). Absorbansi senyawa azo mencapai
optimum pada panjang gelombang 541 nm. Sementara itu, hasil validasi menunjukkan linieritas standar nitrit pada
rentang 0,1 – 0,8 mg/L (R2= 0,9995) dengan absorptivitas molar sebesar 5,37 × 104 L mol-1 cm-1. Batas deteksi dan
kuantifikasi masing-masing sebesar 0,021 dan 0,063 mg/L dengan %RSD analisis nitrit dan nitrat masing-masing
sebesar 0,56 dan 1,73%. Persentase perolehan kembali analisis nitrit dan nitrat masing-masing antara 85 – 99% dan 82
– 100%. Konsentrasi nitrit dan nitrat yang ditentukan dalam daging masing-masing antara 0,60 – 14,79 mg/kg dan 0,68
– 8,39 mg/kg. Hasil tersebut menginformasikan bahwa nitrit dan nitrat yang ada dalam sampel berasal dari proses
eksogen dan endogen.

Kata kunci : nitrit, nitrat, validasi, spektrofotometri UV-Vis

ABSTRACT

Validation of nitrite and nitrate analysis methods in fresh meat and meat product by UV-Vis
spectrophotometry using sulfanilamide and N-naftyletilendiamine (NEDA) reagent was studied. The purpose of this
study was to obtain a method of analysis of nitrite and nitrate at optimum conditions according to the parameters. Zinc
powder was used as reducing agent to reduce nitrate to nitrite. The method was optimized in advance before validation.
The method was validated by zero blind spiking approach based on various validation parameters such as linearity,
sensitivity, limit of detection, limit of quantification, precision and accuracy. The method was applied for determining
nitrite and nitrate in fresh meat and meat products (sausage, smoked beef and cornet). The azo compound absorbance
reached the optimum level at 541 nm. Meanwhile, the validation results showed linearity nitrite standard in the range
from 0.1 – 0.8 mg / L (R2= 0.9995) with molar absorptivity 5.37 × 104 L mole-1 cm-1. The limit of detection and limit of
quantification of the proposed method were 0.021 and 0.063 mg/L respectively with %RSD of nitrite and nitrate
analysis were 0.56 and 1.73%, respectively. The percent recovery of nitrite and nitrate were 85 – 99% and 82 – 100%,
respectively. The range of nitrite and nitrate concentration were 0.60 – 14.79 mg/kg dan 0.68 – 8.39 mg/kg,
respectively.These results inform that the nitrite and nitrate present in the sample originate from exogenous and
endogenous processes.

Keywords : nitrite, nitrate, validation, UV-Vis spectrophotometry

ed

120
Copyright (c) 2022 ILTEK : Jurnal Teknologi

DOI: https://doi.org/10.47398/iltek.v17i02.21
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License
 ILTEK : Jurnal Teknologi
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022
PENDAHULUAN
Zat pengawet yang berasal dari garam nitrit dan
nitrat berguna untuk menstabilkan warna merah daging,
mencegah pembusukan, menghambat beberapa
pertumbuhan mikroorganisme anaerobik dan dapat
berkontribusi terhadap cita rasa produk (Mazumdar, et
al., 2022). Garam nitrit dan nitrat yang digunakan
sebagai zat pengawet makanan yaitu natrium/kalium
nitrit (NaNO2/KNO2) dan natrium/kalium nitrat
(NaNO3/KNO3). Konsumsi makanan yang
mengandung nitrit dan nitrat dalam konsentrasi yang
melebihi ambang batas dapat membahayakan
kesehatan manusia karena nitrit dan nitrat dapat
membentuk senyawa N-nitrosamin yang bersifat toksik
di dalam tubuh. Oleh karena itu, perlu adanya
monitoring dan kontrol terhadap nitrit dan nitrat di
dalam makanan. Berdasarkan permenkes Republik
Indonesia nomor 1168/menkes/per/X/1999, penggunaan
nitrit dan nitrat pada produk daging olahan yang
diizinkan masing-masing dengan batas maksimum 125
mg/kg dan 500 mg/kg (Nur & Suryani, 2012). The
Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA)
telah menentapkan asupan harian makanan atau
acceptable daily intake (ADI) untuk nitrit dan nitrat
masing-masing 0 – 0,07 mg/kg berat badan dan 0 – 3,7
mg/kg berat badan (Mazumdar, et al., 2022).
Metode analisis kuantitatif nitrit dan nitrat yang
telah dilakukan meliputi metode sensor polimer
kolorimetri (Garcia, et al., 2022), sensor elektrokimia
berdasarkan nanopartikel (Dorovskikh, et al., 2022),
kromatografi ion kapiler (D'Amore, et al., 2019),
diffused reflectance ultraviolet (DRUV) (Luiz, et al.,
2012), elektroforesis kapiler (Ming & Zhen, 2018),
voltametri siklik (Thomas, et al., 2012), kromatografi
cair kinerja tinggi (KCKT) (Tahboub, 2008) dan
(Iammarino, et al., 2013) dan spektrofotometri UV-Vis
(Nagaraj, et al., 2008), (Merino, 2009) dan
(Malingappa & Yarradoddappa, 2011). Metode KCKT,
elektroforesis kapiler dan voltametri siklik cukup
sensitif, namun metode tersebut memiliki keterbatasan
seperti sulit, memerlukan waktu yang cukup lama dan
peralatan yang canggih serta mahal. Metode
spektrofotometri UV-Vis memiliki keunggulan yaitu
sensitif terhadap analit dalam konsentrasi kecil (trace),
selektif, cepat, reagen murah, non karsinogenik, mudah
larut dalam air, reliabel dan reprodusibel (Malingappa
& Yarradoddappa, 2011) .
Dalam penelitian ini dilakukan analisis nitrit dan
nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan
secara spektrofotometri UV-Vis menggunakan reagen
sulfanilamida yang kemudian dikopling dengan N-
naftiletilendiamin (NEDA) membentuk senyawa azo
yang berwarna merah ungu. Metode spektrofotometri
UV-Vis belum pernah diaplikasikan untuk analisis
nitrit dan nitrat pada sampel daging segar. Keberadaan
nitrit dan nitrat tidak hanya berasal dari bahan
tambahan pangan tetapi juga dapat berasal dari proses
degradasi protein dalam daging segar. Faktor-faktor
p-ISSN : 1907-0772
e-ISSN : 2721-3447
yang dapat menyebabkan terjadinya degradasi protein
meliputi penyimpanan, proses pemanasan pada suhu
tinggi dan aktifitas mikroba (Mazumdar, et al., 2022).
Nitrat tidak bereaksi dengan reagen kromogenik
tersebut sehingga analisis nitrat dilakukan dengan
mereduksi nitrat menjadi nitrit menggunakan serbuk
seng (Zn). Sebelum proses reduksi nitrat, nitrit yang
terdapat didalam ekstrak terlebih dahulu direaksikan
dengan sulfanilamid dan NEDA untuk membentuk
senyawa azo. Cara tersebut dilakukan untuk
menghindari kompetisi reduksi antara nitrit dan nitrat.
Penggunaan serbuk Zn lebih aman, mudah diperoleh
dan murah (Merino, 2009)
Metode analisis nitrit dan nitrat secara
spektrofotometri UV-Vis yang akan digunakan dalam
penelitian ini perlu dioptimasi untuk mendapatkan
kondisi optimum selama proses analisis. Metode yang
telah dioptimasi selanjutnya divalidasi dengan
menggunakan pendekatan spiking buta nol (zero blind
spiking method) berdasarkan parameter validasi yang
meliputi linieritas, sensitivitas, batas deteksi, batas
kuantifikasi, ketelitian (presisi) dan ketepatan (akurasi)
yang dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(Khanage, et al., 2013). Penelitian ini bertujuan untuk
mengaplikasikan metode yang telah dioptimasi dan
divalidasi untuk analisis nitrit dan nitrat secara
spektrofotometri UV-Vis dalam daging segar dan
berbagai produk daging olahan.
PROSEDUR PENELITIAN
Alat dan bahan penelitian
Daging sapi segar, produk daging olahan
berbagai jenis dan merk (sosis, kornet, sosis curah dan
daging asap), air deionisasi, natrium nitrit (NaNO2),
kalium nitrat (KNO3), sulfanilamida, N-
naftiletilendiamina dihidroklorida (NEDA.2HCl),
buffer amonia pH 9, buffer asetat pH 6, serbuk Zn,
asam klorida (HCl) 37%, kalium heksasianoferat(II)
(K4[Fe(CN)6].3H2O), seng asetat
(Zn(CH3COO)2.2H2O). Semua bahan kimia yang
digunakan berstandar analytical grade dan diproduksi
oleh Merck. spektrofotometer UV-Vis (GBC Cintra
2020 V4131).
Preparasi sampel daging segar dan produk daging
olahan
Sebanyak 50 g daging segar dan produk
daging olahan dengan berbagai jenis dan merk masing-
masing ditambahkan 50 mL air deionisasi hangat (50-
60 oC) dan dihomogenisasikan selama 5 menit dengan
blender. Khusus untuk sampel daging segar, campuran
ditempatkan pada waterbath yang mempunyai suhu 70
o
C selama 5 menit. Campuran kemudian masing-
masing ditambahkan 4 mL larutan K4[Fe(CN)6].3H2O
0,25 mol L-1 dan Zn(CH3COO)2 1,00 mol L-1.
Campuran diaduk kemudian disentrifugasi selama 10
menit pada 4000 rpm pada suhu kamar. Supernatan
disaring dengan kertas saring Whatman No.42.
Volume campuran diencerkan sampai 100 mL dengan
air deionisasi.
121
 ILTEK : Jurnal Teknologi
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022
Analisis nitrit dalam daging segar dan produk
daging olahan
Pembuatan kurva standar nitrit
Larutan kerja nitrit 100 mg/L dipipet sebanyak
0,5; 1; 2; 3 dan 4 mL. Masing-masing larutan
diencerkan sampai 100 mL. Sejumlah 20 mL alikuot
dengan berbagai konsentrasi ditambahkan 2 mL
larutan sulfanilamida 1% dan 10 mL buffer amonia pH
9. Campuran dibiarkan selama 5 menit pada suhu
kamar. Selanjutnya ditambahkan 2 mL larutan NEDA
0,1% dan diencerkan sampai batas volume. Campuran
dibiarkan selama 30 menit di tempat yang gelap
kemudian diukur absorbansinya pada 541 nm
menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
Penentuan konsentrasi nitrit dalam daging segar
dan produk daging olahan
Sejumlah 20 mL sampel daging segar dan
produk daging olahan masing-masing ditambahkan 10
mL buffer amonia pH 9 dan 2 mL larutan
sulfanilamida 1%. Campuran dibiarkan selama 5 menit
pada suhu kamar. Selanjutnya ditambahkan 2 mL
larutan NEDA 0,1% dan diencerkan sampai 100 mL.
Gambar 1. Mekanisme reaksi pembentukan senyawa azo
p-ISSN : 1907-0772
e-ISSN : 2721-3447
Campuran dibiarkan selama 30 menit di tempat yang
gelap kemudian diukur absorbansinya pada 541 nm.
Analisis nitrat dalam daging segar dan produk
daging olahan
Penentuan konsentrasi nitrat dalam daging segar
dan produk daging olahan
Sejumlah 20 mL sampel daging segar dan
produk daging olahan masing-masing Erlenmeyer
ditambahkan 2 mL larutan sulfanilamida 1%.
Campuran dibiarkan selama 5 menit pada suhu kamar.
Selanjutnya ditambahkan 2 mL larutan NEDA 0,1%.
Untuk mereduksi nitrat menjadi nitrit, campuran
tersebut ditambah 10 mL buffer asetat pH 6 dan 100
mg serbuk Zn. Campuran dikocok selama 5 menit
dengan menggunakan shaker. Hasil pengocokan
disentrifugasi selama 10 menit pada 4000 rpm.
Supernatan yang diperoleh ditambahkan 10 mL buffer
amonia pH 9 dan diencerkan sampai 100 mL.
Campuran dibiarkan selama 30 menit di tempat yang
gelap kemudian diukur absorbansinya pada 541 nm
menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
122
 ILTEK : Jurnal Teknologi
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ion nitrit yang terdapat dalam sampel
direaksikan dengan sulfanilamida yang mengandung
gugus amino (–NH2) berupa amina primer yang dalam
suasana asam dapat membentuk ion benzenadiazonium
kemudian ion tersebut dikopling dengan agen
pengkopling NEDA membentuk senyawa azo yang
berwarna merah ungu. Mekanisme reaksi pembentukan
senyawa azo dapat ditunjukkan pada gambar 1. Hasil
pengukuran diperoleh absorbansi optimum dari
senyawa azo pada panjang gelombang optimum 541
nm. Spektra absorpsi senyawa azo yang terbentuk
ditunjukkan pada Gambar 2.
0,6
541 nm;
0,5
0,50718
0,4
Absorbansi (A)
0,3
0,2
0,1
0 mol ion benzenadiazonium dengan 1 mol NEDA.
350 450 550 650
-0,1
Panjang Gelombang (nm)
Gambar 2. Spektra absorpsi senyawa azo
Kondisi optimum pembentukan senyawa azo
Diazotasi melibatkan reaksi antara larutan nitrit
dengan sulfanilamida dalam kondisi asam membentuk
ion benzenadiazonium. Optimasi dilakukan dengan
variasi waktu diazotasi (0,5 – 20 menit). Waktu
optimum yang diperlukan untuk reaksi diazotasi
sebelum penambahan reagen NEDA yaitu 5 menit.
Pengukuran waktu kestabilan senyawa azo
dilakukan pada rentang waktu 10 – 140 menit dengan
interval 10 menit. Kestabilan senyawa azo terjadi pada
rentang waktu antara 30-80 menit setelah penambahan
reagen NEDA. Pengukuran lebih lanjut pada waktu
lebih dari 80 menit terjadi penurunan absorbansi
larutan. Hal ini disebabkan ada kemungkinan senyawa
azo tersebut mengalami dekomposisi atau terurai
sehingga intensitas warnanya menurun akibatnya
absorbansi juga menurun (Rohman & Gandjar, 2007).
Oleh karena itu, pengukuran senyawa azo tersebut
harus dilakukan pada rentang waktu antara 30 – 80
menit setelah penambahan reagen NEDA.
Optimasi pengaruh pH dilakukan dengan
mereaksikan larutan standar nitrit 0,40 mg/L dengan
larutan sulfanilamid 1%, larutan buffer dengan variasi
pH 5 (buffer asetat), pH 7 (buffer fosfat), pH 9 dan pH
11 (buffer amonia) kemudian dikopling dengan larutan
larutan NEDA 0,1%. Pada medium asam gugus azo
sangat mudah mengalami protonasi sedangkan pada
medium basa gugus azo tidak mengalami protonasi.
Penggunaan larutanbuffer pH 9 memberikan
absorbansi optimum dalam analisis nitrit dan nitrat.
p-ISSN : 1907-0772
e-ISSN : 2721-3447
Larutan standar nitrit 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 dan 0,8
mg/L direaksikan dengan larutan sulfanilamida 1%,
buffer amonia pH 9 dan larutan NEDA pada
konsentrasi 0,1; 0,3; 0,5 dan 1,0%. Linieritas yang
paling baik (memiliki koefisien korelasi paling tinggi)
dihasilkan dari pengujian dengan menggunakan NEDA
0,1% sehingga larutan NEDA 0,1% digunakan dalam
analisis nitrit dan nitrat.
Rasio mol dioptimasi dengan memvariasikan
volume larutan sulfanilamid 1% dan NEDA 0,1%
masing-masing dimulai dari 0,5 – 3,5 mL dengan
volume total untuk kedua reagen tersebut berjumlah 4
mL. Absorbansi optimum terjadi pada fraksi rasio mol
ion benzenadiazonium terhadap NEDA sebesar 0,5
(Gambar 3). Volume yang digunakan yaitu memiliki
rasio 1 : 1 dengan penggunaan masing-masing 2 mL
larutan sulfanilamida dan NEDA. Konstanta kestabilan
senyawa (Kf) yang diperoleh sebesar 8,1 × 1013 L mol-
1
. Reaksi melibatkan reaksi substitusi elektrofilik
aromatik antara ion benzenadiazonium dengan NEDA
pada posisi para membentuk senyawa azo melalui
penggabungan (kopling) diazo (Gambar 1). Dari
mekanisme reaksi tersebut dapat diketahui bahwa
senyawa azo terbentuk pada rasio mol 1 : 1 yaitu dari 1
750 Larutan standar nitrat 10 mg/L direduksi dengan
serbuk Zn pada variasi pH 4; 5; 6; 6,5; 7 dan 7,5 dan
waktu reaksi selama 5 menit. Nitrit yang terbentuk
direaksikan dengan larutan sulfanilamida 1%, buffer
amonia pH 9 dan larutan NEDA 0,1%. Absorbansi
optimum terjadi pada penggunaan buffer pH 6 karena
reduksi nitrat dengan menggunakan serbuk Zn yang
dilakukan pada pH 6 tidak membentuk gas NO
(persamaan 1)
Larutan standar nitrat 10 mg/L direduksi dengan
serbuk Zn pada pH 6 selama variasi waktu reaksi 0,5;
1; 1,5; 2; 3; 5; 10; 15 dan 30 menit. Waktu reaksi
optimum yang diperlukan untuk mereduksi nitrat
menjadi nitrit yaitu dari 3 – 5 menit. Pada kondisi
waktu reaksi tersebut, tidak terjadi kenaikan maupun
penurunan absorbansi yang signifikan. Hal ini
disebabkan ion nitrit yang terbentuk tidak mengalami
perubahan menjadi gas NO akibat proses reduksi
lanjutan. Namun semakin lama waktu reaksi yaitu dari
10 – 30 menit terjadi penurunan absorbansi. Hal ini
disebabkan semakin lama ion nitrat bereaksi dengan
serbuk Zn maka ada kecenderungan ion nitrit yang
terbentuk dari hasil reduksi nitrat mengalami reduksi
lanjutan membentuk gas NO karena serbuk Zn
memiliki permukaan yang baik untuk terjadinya
transfer elektron di dalam fase larutan (Woollard &
Indyk, 2014) sesuai dengan persamaan 2.
Pengaruh massa reduktor serbuk Zn : 20 mL
larutan standar nitrat 10 mg/L direduksi dengan
menggunakan variasi massa serbuk Zn yaitu 10, 25, 50,
75, 100, 125 dan 150 mg pada pH 6 dengan waktu
reaksi 5 menit. Absorbansi optimum terjadi pada
penggunaan 100 mg serbuk Zn. Hal ini disebabkan
seiring dengan bertambahnya massa serbuk Zn maka
kemampuan serbuk Zn untuk mereduksi nitrat menjadi
nitrit semakin besar. Bertambahnya konsentrasi nitrit
123
 ILTEK : Jurnal Teknologi
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022
hasil reduksi akan meningkatkan konsentrasi senyawa
azo yang terbentuk. Terjadi penurunan absorbansi pada
penggunaan serbuk Zn pada massa lebih dari 100 mg.
Hal ini disebabkan sisa serbuk Zn yang tidak terlibat
selama proses reduksi nitrat menjadi nitrit dapat
mereduksi asam nitrit yang terbentuk dari hasil reduksi
nitrat membentuk gas NO sebagaimana ditunjukkan
Oksidasi : Zn(s) → Zn2+(aq) + 2e
Reduksi : NO3-(aq) + 3H+(aq) + 2e → HNO2(aq) + H2O(l) Eo = +0,940 V
Zn(s) + NO3-(aq) +
+ 3H (aq)
2+
→ Zn
Oksidasi : Zn(s) → Zn2+(aq) + 2e
Reduksi : 2HNO2(aq) + 2H (aq) + 2e → 2NO(g) + 2H2O(l) Eo = +0,984 V
+
Zn(s) + 2HNO2(aq) + 2H+(aq) → Zn 2+
Validasi Metode Analisis
Linieritas
Absorbansi larutan standar nitrit 0,1; 0,2; 0,4;
0,6 dan 0,8 mg/L diukur dan dibuat sebanyak 3 ulangan
pada hari yang berbeda (interday). Setelah memproses
data pengukuran (Tabel 1) melalui perhitungan regresi
kurva standar nitrit (Gambar 4) diperoleh dengan nilai
slope, intersep, koefisien korelasi (R2) dan parameter
optikal lainnya dirangkum dalam Tabel 2. Persamaan
regresi linear yang diperoleh dapat digunakan untuk
menentukan konsentrasi nitrit yang berasal dari reduksi
standar nitrat (Tabel 3).
Batas deteksi dan batas kuantifikasi
Batas deteksi dan batas kuantifikasi ditentukan
dengan pendekatan yang didasarkan pada nilai standar
deviasi intersep dan slope persamaan regresi linier.
Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh nilai batas
deteksi dan batas kuantifikasi masing-masing sebesar
0,021 mg/L dan 0,063 mg/L.
Ketelitian
Analisis nitrit
Ketelitian ditentukan berdasarkan parameter
keterulangan (repeatability) dan presisi antara
menggunakan standar nitrit dengan konsentrasi
terendah, menengah dan tertinggi dalam rentang kurva
standar. Konsentrasi nitrit terendah, menengah dan
tertinggi yang digunakan dalam penelitian ini masing
masing 0,1; 0,4 dan 0,8 mg/L. Keterulangan ditetapkan
selama 3 kali pengulangan dalam hari yang sama
(intraday) sedangkan presisi antara ditetapkan selama 3
kali pengulangan dalam 3 hari yang berbeda (interday).
Hasil perhitungan menunjukkan rata-rata %RSD atau
koefisien variasi untuk presisi intraday dan presisi
interday masing-masing sebesar 0,69% dan 0,42%.
p-ISSN : 1907-0772
e-ISSN : 2721-3447
persamaan reaksi 2. Terbentuknya gas NO
menyebabkan berkurangnya konsentrasi nitrit di dalam
larutan sehingga konsentrasi senyawa azo yang
terbentuk juga mengalami penurunan. Reduksi nitrat
menjadi nitrit yang dilakukan pada kondisi optimum
akan mencegah pembentukan gas NO yang dapat
menurunkan nilai absorbansi (Persamaan 2)
Eo = -0,762 V
+
(aq) + HNO2(aq) + H2O(l) E = +0,178 V….(1)
o
Eo = -0,762 V
+
(aq) + 2NO(g) +2H2O(l) E = +0,222 V….(2)
o
Analisis nitrat
Konsentrasi nitrat terendah, menengah dan
tertinggi yang digunakan dalam penelitian ini masing
masing 2; 10 dan 20 mg/L. Hasil perhitungan
menunjukkan bahwa analisis presisi intraday dan
interday pada konsentrasi standar nitrat 10 dan 20
mg/L memiliki ketelitian yang tinggi dan baik karena
menghasilkan nilai %RSD yang kurang dari 2%.
Namun analisis presisi intraday dan interday pada
konsentrasi standar nitrat 2 mg/L memiliki ketelitian
yang tidak baik. Hal ini disebabkan absorbansi rata-rata
nitrit yang dihasilkan dari reduksi nitrat menghasilkan
konsentrasi nitrat yang berada dibawah nilai batas
kuantifikasi yaitu 0,063 mg/L.
Ketepatan
Ketepatan dalam metode ini ditentukan sebagai
persentase perolehan kembali. Untuk analisis nitrit,
larutan sampel ditambah dengan larutan standar
internal nitrit 0,3; 0,5 dan 0,7 mg/L sedangkan untuk
analisis nitrat, sampel ditambah dengan larutan standar
internal nitrat 2, 5 dan 10 mg/L. Hasil yang diperoleh
menunjukkan persentase perolehan kembali nitrit dan
nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan
masing-masing antara 85 – 99% dan 82 – 100%
(Gambar 5 dan 6). Nilai persentase perolehan kembali
yang termasuk dalam rentang akurasi juga
mengindikasikan bahwa komposisi matriks (daging
segar dan produk daging olahan) tidak
menginterferensi secara signifikan dalam analisis nitrit
dan nitrat (Luiz, et al., 2012).
124
 ILTEK : Jurnal Teknologi p-ISSN : 1907-0772
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022 e-ISSN : 2721-3447

Tabel 1. Metode linieritas

Konsentrasi nitrit Absorbansi , λmaks = 541 nm

Rata-rata
(mg/L) Hari I Hari II Hari III

0,1 0,1311 0,1337 0,1349 0,1332

0,2 0,2332 0,2375 0,2395 0,2367

0,4 0,4799 0,4805 0,4795 0,4799

0,6 0,7141 0,7163 0,7140 0,7148

0,8 0,9323 0,9359 0,9335 0,9339

Tabel 2. Parameter optikal penentuan nitrit dan nitrat dengan sulfanilamida + NEDA

Parameter Karakteristik
Warna Merah ungu
λ max (nm) 541
Stabilitas (menit) 30 – 80
Konstanta Kestabilan (Kf) (L mol-1) 8,1 × 1013
Rentang hukum Beer (mg/L) 0,1 – 0,8
Absorptivitas molar (L mol-1 cm-1) 5,37 x 104
LOD (mg/L) 0,021
LOQ (mg/L) 0,069
RSD analisis nitrit dan nitrat (%) 0,56 dan 1,73

Persentase recovery nitrit dan nitrat (%) 85 – 99 dan 82 – 100

Persamaan regresi
Koefisien korelasi (R2) 0,9995
Slope 1,1667
Intersep 0,0081

0,508
0,5; 0,5064
0,506
0,504
0,502
Absorbansi

0,5
0,498
0,496
0,494
0,492
0,49
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Fraksi mol Ion Benzenadiazonium
Gambar 3. Hubungan fraksi rasio mol antara ion benzenadiazonium dengan NEDA terhadap absorbansi senyawa azo

125
 ILTEK : Jurnal Teknologi p-ISSN : 1907-0772
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022 e-ISSN : 2721-3447

1
0,9 y = 1,1563x + 0,0141
0,8 R² = 0,9996
0,7

Absorbansi
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
[NO2 -] (mg/L)

Gambar 4. Kurva standar nitrit

Tabel 3. Data hasil penentuan konsentrasi nitrit hasil reduksi standar nitrat

[NO3-] Absorbansi , λmaks = 541 nm

[NO2-] (mg/L) [NO3-] (mg/L)
standar Rata-
hasil reduksi, yang tereduksi,
(mg/L), V= rata
Hari I Hari II Hari III V= 100 mL V= 100 mL
20 mL

2 0,0613 0,0640 0,0605 0,0621 0,0463 0,0463

5 0,2887 0,2447 0,2653 0,2662 0,2212 0,2212

10 0,5559 0,5431 0,5467 0,5486 0,4633 0,4633

15 0,8646 0,8446 0,8590 0,8561 0,7268 0,7268

20* 0,5087 0,5099 0,5108 0,5098 0,4300 0,4300

0,8600 0,8600

[NO2-] hasil reduksi = [NO3-] yang tereduksi

(5) [NO3-] yang tereduksi = 0,4300 mg/L x fp(100/50) = 0,8600 mg/L

Keterangan : fp = faktor pengenceran (dalam metode faktor pengenceran = 2)

* = dianalisis dengan proses pengenceran

Aplikasi ditunjukkan pada Gambar 7. Untuk menghindari

Metode yang sudah dioptimasi dan divalidasi dapat
diaplikasikan untuk analisis nitrit dan nitrat yang
terdapat dalam daging segar dan produk daging olahan.
Saat proses reduksi berlangsung, spesies asam nitrit
yang terbentuk dari nitrit dengan asam akan lebih
mudah mengalami reduksi dari pada spesies nitrat.
Kemudahan suatu spesies untuk tereduksi berdasarkan
nilai potensial reduksi standar, dimana nilai potensial
reduksi standar spesies asam nitrit lebih besar dari pada
nilai potensial reduksi standar nitrat. Grafik kompetisi
reduksi antara nitrit dan nitrat di dalam sampel
kompetisi reduksi antara nitrit dan nitrat, maka nitrit
yang terdapat dalam ekstrak sampel tersebut
direaksikan dengan larutan sulfanilamida 1% dan
dikopling dengan larutan NEDA 0,1% membentuk
senyawa azo. Sama seperti analisis nitrit, nitrat yang
terkandung di dalam ekstrak sampel tidak bereaksi
dengan larutan sulfanilamida 1% dan NEDA 0,1%
sehingga nitrat direduksi menjadi nitrit dengan
menggunakan serbuk Zn pada pH 6 dalam waktu reaksi
5 menit serta ditambahkan buffer amonia pH 9.

126
 ILTEK : Jurnal Teknologi p-ISSN : 1907-0772
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022 e-ISSN : 2721-3447

95%
Sosis curah 1 94%
92%
85%
Daging asap 92%
93%
85%
Sosis sapi 1 96%
87%
86%
Sosis Sapi 2 99% Sampel + standar nitrit
98% 0,7 mg/L
97% Sampel + standar nitrit
Sosis sapi 3 85%
92% 0,5 mg/L
85% Sampel + standar nitrit
Sosis curah 2 92%
87% 0,3 mg/L
91%
Kornet 96%
89%
91%
Daging segar 96%
94%

75% 80% 85% 90% 95% 100%

% Perolehan Kembali

Gambar 5. Persentase perolehan kembali nitrit dalam daging segar dan produk daging olahan

93%
Sosis curah 1 91%
91% Sampel + standar nitrat 10 mg/L
94%
Daging asap 87%
86%
Sampel + standar nitrat 5 mg/L
94%
Sosis sapi 1 99%
99%
Sampel + standar nitrat 2 mg/L
93%
Jenis Sampel

Sosis Sapi 2 98%

99%
99%
Sosis sapi 3 99%
100%
93%
Sosis curah 2 86%
89%
87%
Kornet 87%
82%
83%
Daging segar 83%
90%

0% 20% 40% 60% 80% 100%

% Perolehan Kembali

Gambar 6. Persentase perolehan kembali nitrat dalam daging segar dan produk daging olahan

Gambar 8 menunjukkan bahwa konsentrasi nitrit
dan nitrat yang terdapat dalam sampel untuk setiap
jenis (daging segar, sosis, daging asap dan kornet)
masing-masing berada pada rentang 0,60 – 14,79
mg/kg dan 0,68 – 8,39 mg/kg. Konsentrasi nitrit yang
terbesar dan terkecil masing-masing terdapat dalam
sampel sosis sapi 1 (14,79 mg/kg) dan sosis curah 2
(0,60 mg/kg) sedangkan konsentrasi nitrat yang
terbesar dan terkecil masing-masing terdapat dalam
sampel kornet (8,39 mg/kg) dan daging segar (0,68
mg/kg).

127
 ILTEK : Jurnal Teknologi p-ISSN : 1907-0772
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022 e-ISSN : 2721-3447

0,8708
0,9 0,7599 0,7842
0,8
0,5599 0,5924 0,6174
0,7 0,501
Absorbansi
0,6 0,4384
0,5 0,3452
0,3281
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Sampel Sampel + Sampel + Sampel + Sampel +
tanpa reduksi reduksi + reduksi + reduksi +
reduksi tanpa standar standar standar
standar nitrat 2 nitrat 5 nitrat 10
nitrat mg/L mg/L mg/L

Sosis sapi 1 Sosis sapi 2

Gambar 7. Kompetisi reduksi antara nitrit dan nitrat di dalam sampel

14,79
16
Konsentrasi nitrit dan nitrat

14 11,64
12 9,46
10 8,06 8,39
8
(mg/kg)

6 3,08 3,92 3,25

4 1,86
2
0,6 0 0 0 0 0 0,68
0
Sosis Sosis Sosis Sosis Sosis Daging Kornet Daging
Curah Curah Sapi 1 Sapi 2 Sapi 3 Asap Segar
1 2
Jenis Sampel

Konsentrasi Nitrit Konsentrasi Nitrat

Gambar 8. Kadar nitrit dan nitrat dalam daging segar serta produk daging olahan

Sampel daging segar yang telah dianalisis
menunjukkan adanya nitrat dengan konsentrasi 0,68
mg/kg sedangkan nitrit tidak terdeteksi. Hasil analisis
tersebut sama dengan hasil analisis nitrit dan nitrat
yang telah dilakukan Iammarino dan Taranto (2012),
dimana hasil analisis nitrit dan nitrat menggunakan
kromatografi ion yang dilakukan pada 200 sampel
daging segar diperoleh konsentrasi nitrat dari 10,2
sampai 36,5 mg/kg sedangkan nitrit tidak terdeteksi.
Terbentuknya nitrat pada sampel daging segar
disebabkan oleh degradasi protein dalam daging yang
meliputi paparan udara dan aktifitas mikroba. Reaksi
degradasi protein dalam daging terjadi melalui 2
tahapan yaitu pembentukan oksida nitrit dan oksidasi
oksida nitrit. Reaksi yang terjadi dapat ditunjukkan
pada persamaaan reaksi 3 (Merino, 2009).
NO sintase
(1) L-arginin + O2
(2) NO + Hb2+O2
….(3)
Hasil analisis nitrit dan nitrat terhadap semua sampel
menunjukkan nilai konsentrasi nitrit dan nitrat berada
dibawah batas maksimum yang diijinkan pemerintah
yaitu 125 mg/kg untuk nitrit dan 500 mg/kg untuk
nitrat.
KESIMPULAN
Analisis nitrit secara spektrofotometri UV-Vis
dengan menggunakan sulfanilamida sebagai sumber
amina dan NEDA sebagai agen pengkopling dapat
membentuk senyawa azo. Hasil validasi metode
analisis nitrit dan nitrat secara spektrofotometri UV-
Vis dengan pendekatan spiking buta nol (zero blind
spiking method) memberikan nilai linieritas (R2 =
0,9995), sensitivitas (ε = 5,37 x 104 L mol-1 cm-1),
batas deteksi (LOD = 0,021 mg/L), batas kuantifikasi
(LOQ = 0,063 mg/L), ketelitian (rata-rata %RSD
analisis nitrit dan nitrat masing-masing sebesar 0,56
L-citrulin + NO
dan 1,73%) dan persentase perolehan kembali analisis
NO3- + Hb3+
nitrit dan nitrat masing-masing antara 85 – 99% dan 82

128
 ILTEK : Jurnal Teknologi
Volume 17, Nomor 02, Oktober 2022
– 100%. Konsentrasi nitrit dan nitrat yang terdapat
dalam sampel untuk setiap jenis (sosis, daging asap dan
kornet) berada pada rentang 0,60 – 14,79 mg/kg untuk
nitrit dan 0,68 – 8,39 mg/kg untuk nitrat.
UCAPAN TERIMA KASIH
Terima kasih kepada Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi (DIKTI) melalui program Beasiswa
Unggulan yang telah mendanai penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
D'Amore, T. et al., 2019. Development and validation
of an analytical method for nitrite and nitrate
determination in meat products by capillary ion
chromatography (CIC). Food Analytical Methods,
Volume 12, pp. 1813-1822.
Dorovskikh, S. I., Klyamer, D. D., Fedorenko, A. D. &
Morozova, N. B., 2022. Electrochemical sensor
based on iron (III) phthalocyanine and gold
nanoparticles for nitrite detection in meta products.
Sensors, 22(15), p. 5780.
Garcia, M. G. et al., 2022. Easy nitrite analysis of
processed meat with colorimetric polymer sensor
and a smartphone app. Applied Materials &
Interfaces, Volume 14, pp. 37051-37058.
Iammarino, M., Taranto, A. D. & Cristino, M., 2013.
Endogenous levels of nitrites and nitrates in wide
consumption foodstuff : Results of five years of
official controls and monitoring. Food Chem,
Volume 140, pp. 763-771.
Khanage, S. G., Mohite, P. B. & Jadhav, S., 2013.
Development and validation of UV-Visible
spectrophotometric method for simultaneous
determination of eperisone and paracetamol in
solid dosage form. Adv Pharm Bull, 3(2), pp. 447-
451.
Luiz, V. H. M., Pezza, L. & Pezza, H. R., 2012.
Determination of nitrite in meat products and
water using dapsone with combined spot
test/diffuse reflectance on filter paper. Food Chem,
134(4), pp. 2546-2551.
p-ISSN : 1907-0772
e-ISSN : 2721-3447
Malingappa, P. & Yarradoddappa, V., 2011.
Quantification of nitrite/nitrate in food stuff
samples using 2-aminobenzoic acid as a new
amine in diazocoupling reaction. Food Analytical
Methods, 4(1), pp. 90-99.
Mazumdar, R. et al., 2022. Simultaneous determination
of nitrite and nitrate in meat and meat products
using ion -exchange chromatography. Food
Research, 6(3), pp. 145-152.
Merino, L., 2009. Development and validation of a
method for determination of residual nitrite/nitrate
in foodstuff and water after zinc reduction. Food
Analytical Method, Volume 2, pp. 212-220.
Ming, L. X. & Zhen, M. L., 2018. Simultaneous
determination of nitrate and nitrite in vegetables
and meat products by high performance capillary
electrophoresis. Food science, 39(12), pp. 301-
307.
Nagaraj, P., Prakash, J. S., Shivakumar, A. & Shrestha,
A. K., 2008. Sensitive spectrophotometric methods
for the assessment of nitrite in water sample.
Environmental Monitoring and Assesment,
Volume 147, pp. 235-241.
Nur, H. H. & Suryani, D., 2012. Analisis kandungan
nitrit dalam sosis pada distributor sosis di kota
Yogyakarta tahun 2011. Kesmas UAD, Volume 6,
pp. 1-74.
Rohman, A. & Gandjar, I. G., 2007. Kimia Analisis
Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Tahboub, Y. R., 2008. Determination of nitrite and
nitrate in cell culture medium by reversed-phase
high-performance liquid chromatography with
simultaneous UV-VIS and fluorescence detection.
Jordan Journal of Chemistry, 3(1), pp. 69-75.
Thomas, D. et al., 2012. Sensitive determination of
nitrite in food samples using voltammetric
techniques. Food Analytical Methods, Volume 5,
pp. 752-758.
Woollard, D. C. & Indyk, H. E., 2014. Colorimetric
determination of nitrate and nitrite in milk and
milk powders – use of vanadium (III) reduction.
International Dairy Journal, 35(1), pp. 88-94.
129