KLT-

DENSITOMETRI

S1 Farmasi
5B
 Kelompok 2 :

1. Lutfiana Dwi Novitasari (201905049)

2. Naila Syakirotul Rizqiyah (201905052)
3. Putri Widiastuti (201905064)
4. Resty Fitriani (201905066)
5. Reza Angelina (201905067)
6. Riyan Dwi Anggara (201905070)
7. Sekar Kinasih (201905075)
8. Syauqi Afifatul Amiroh (201905082)
9. Usfa Febriani (201905086)
10. Wafda Nailil Muna (201905089)
 Kromatografi Lapis Tipis

 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode pemisahan komponen-komponen atas dasar
perbedaan adsopsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembangan/
pengembang campur.
 KLt dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-
lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna
untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi
kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi , dan isolasi senyawa mulai skala kecil.
 Tujuan Kromatografi Lapis
Tipis

Dipakai untuk menjajaki

Dipakai selayaknya
sistem pelarut dan system
sebagai metode untuk
penyangga yang akan dipakai
mencapai hasil
dalam kromatografi kolom
kualitatif, kuantitatif,
atau kromatografi cair kinerja
atau preparatif .
tinggi.
 DENSITOMETRI

 Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan
analit yang merupakan noda pada KLT.
 Interaksi radiasi elektromagnetik dengan noda KLT yang ditentukan adalah absorpsi, tranmisi, pantulan
(refleksi) pendar flour atau pemadaman pendar flour dari radiasi semua.
 Densitometri lebih dititik beratkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT.
 Densitometri merupakan metode penetapan kadar suatu senyawa pada lempeng kromatografi, menggunakan
instrumen TLC scanner, pengukuran dilakukan dengan cara mengukur serapan anlit (cahaya yang diukur dapat
berupa cahaya yang dipantulkan atau yang diteruskan), pemadaman fluoresensi untuk lapisan yang mengandung
bahan berfluorsensi analit atau hasil reaksi analit.
 Keuntungan dari Kromatografi
Planar

01 02 04
03

Kromatografi lapis tipis Identifikasi pemisahan Ketetapan penentuan Dapat dilakukan elusi
banyak digunakan untuk komponen dapat dilakukan kadar akan lebih baik secara menaik
tujuan analisis. dengan preaksi warna, karena komponen yang (ascending), menurun
fluorosensi atau dengan akan ditentukan (descinding), atau dengan
radiasi menggunakan sinar merupakan bercak yang cara elusi 2 dimensi.
ultraviolet. tidak bergerak.
 Penyerap Untuk Kromatografi Lapisan
Tipis

Zat padat Digunakan untuk memisahkan

Silika Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-
asama lemak, lipida, minyak esensial,
anion, dan kation organic, sterol, terpenoid.
Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-
vitamin, karoten, asam-asam amino.
Kieselguhr Gula, oligosakarida, asam-asam lemak,
trigliserida, asam-asam amino, steroid.
Bubuk selulosa Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida.
Pati Asam-asam amino.
Sephadex Asam-asam amino, protein.
 Fase Diam Kromatografi Lapis Tipis

Penyerap Mekanisme sorpsi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino, hidrokarbon,
vitamin, alkaloid
Silika modifikasi dengan Partisi termodifikasi Senyawa-senyawa non polar
hidrokarbon
Serbuk selulosa Partisi Asam mino, nukleotida,
akarbohidrat
Alumina Adsorpsi Hidrokarbon, ion logam,
pewarna makanan alkaloid
Kieselguhr Partisi Gula, asam-asam lemak
Selulosa penukar ion Pertukaran ion Asam nukleat, nukleotida,
halide dan ion-ion logam
Gel spadex Ekslusi Polimer, protein, kompleks
logam
B-siklodekstrin Interaksi adsorpsi Campuran enansioner
stereospestik
 Fase Gerak Kromatografi Lapis
Tipis

1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknik yang sensitif.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara
0,2 – 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai
Rf. Penambahan pelarut yang bersifat polar sedikit dietil eter ke dalam pelarut non
polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
4. Solut-solut ionik dan solute-solute polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan
tertentu. Penaambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan
meningkatkan solute-solute yang bersifat basa dan asam.
APLIKASI
(PENOTOLAN)
SAKPEL
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang
ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang
ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus
dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar
totolan.
 PENGEMBANGAN

• Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah

ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase gerak
kurang lebih 0,5-1 cm
• Fase gerak dalam bejana harus dibawah
lempeng yang telah berisi totolan sampel.
• Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan
sedapat mungkin volume fase gerak sedikit
mungkin (akan tetapi harus mengelusi
lempeng sampai ketinggian lempeng yang
telah ditentukan.
• Untuk melakukan penjenuhan fase gerak
biasanya bejana dilapisi kertas saring.
• Jika fase gerak telah mencapai ujung dari
kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa
fase gerak telah jenuh.
 DETEKSI BERCAK

 Menyemprot lempeng KLT dengan Reagen

kromogenik.
 Mengamati lempeng dibawah lampu ultraviolet
yang dipasang panjang gelombang emisi 254 atau
366
 Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat
atau asam nitrat pekat.
 Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam
chamber tertutup.
 Melakukan scanning pada permukaan lempeng
dengan densitometer, suatu instrument yang dapat
mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari
permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu
UV atau sinar lampu tampak.
 INSTRUMENTASI
KLT-
DENSITOMETRI
Instrumen pada KLT scanner terdiri dari sumber
cahaya, alat seleksi λ, system kondensor dan focus, system
optic, detector fotosensitisasi, mekanisme menggerakan
lempengan ke bawah berkas cahaya terfokus.
Komponen penting dari densitometer antara lain :
 Sumber rafiasi (Source)
 Pengaturan Panjang gelombang (λ selector)
 Beam Spliter
 Thin layer plate (end view)
 Detector phototube (transmittance position)
 ANALISIS KUALITATIF

Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada

prinsipnya mengacu pada nilai Rf (Retardation factor) atau
Faktor retardasi yaitu :
Membandingkan Rf analit dengan Rf baku
pembanding atau membandingkan bercak kromatogram
sampel dengan kromatogram “Reference Standart” yang
dikenal dengan Factor Retensi Relatif (Rx). Untuk
penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan
bersamaan dengan sample pada pelat yang sama.
 ANALISIS KUANTITATIF

Analisis kuantitatif hamper sama dengan spektrofotometri, penentuan kadar

analit dikorelasikan dengan area bercak pada pelat KLT. Cara penetapan kadar
dapat dilakkan dengan :
1. Membandingkan area bercak analit dengan area bercak baku pembanding
yang diketahui konsentrasinya.
Cx = Ax / Ap x Cp
Ket : Cx = Konsentrasi Analit
Ax = Area Analit
Ap = Area Baku Pembanding
Cp = Konsentrasi Baku Pembanding
 LANJUTAN

2. Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak terhadap

konsentrasi dari satu seri lartan baku pembanding. Krva yang terbentuk harus
linier, kemudian dengan persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit.

Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda plat KLT
akan lebih terjamin kesahihannya disbanding metode KCKT atau KGC, sebab
area noda kromatogram diukuur pada posisi diam atau zig-zag menyelruh.
Kolerasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak
menunjukan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola.
TERIMAKASIH
Alternative Resources