REPLIKASI DNA

Bambang F. Suryadi
PS BIOLOGI – FMIPA UNRAM
 Replikasi DNA
Replikasi DNA memungkinkan tiap sel anakan/baru mendapatkan salinan/copy
informasi genetis (genom) yang sama dengan induknya, sebelum terjadi
pembelahan.
Replikasi menuntut ketepatan yang sangat tinggi. Error rate sebesar 0.01% (1
kesalahan per 10.000 nukleotida) dapat menghasilkan kerusakan yang
signifikan.
Kecepatan replikasi DNA:
Eukaryot: ± 50 bp/detik
Prokaryot: ± 1000 bp/detik
Pada eukaryot, replikasi DNA terjadi pada fase S (antara fase G1 dan G2)
lamanya ± 6-8 jam.

2
M: Mitosis ± 1 jam
G1: Gap >12 jam
S: Sintesis ± 6-8 jam
G2: Gap ± 4 jam
3
 Pola Replikasi DNA
Setelah struktur DNA diketahui pada tahun 1950an muncul pertanyaan:
Bagaimana cara perbanyakan/replikasinya?
Apakah masing-masing utas menjadi cetakan, atau keduanya secara
bersamaan (intact) menjadi cetakan?
Pertanyaan ini dijawab dengan percobaan yang dilakukan oleh Meselson dan
Stahl pada 1958
 Melabel molekul DNA E. coli dengan isotop 15N, yang disubkultur pada
media yang mengandung 14N. DNA E. coli pada masing-masing medium
kemudian diputar dengan sentrifugasi gradien.
Kesimpulan:???

4
5
6
7
Replikasi DNA

8
 Komponen Replikasi DNA (1)

Replikasi diawali dengan pembukaan heliks ganda yang dimulai dari

suatu daerah/posisi yang disebut titik Ori (Origin of Replication).
Titik Ori berupa urutan DNA oligomer (tersusun masing-masing oleh
13 nukleotida) kaya A-T (menyebabkan utas ganda DNA mudah
terlepas), yang bagian hilirnya terdapat daerah pengikatan untuk
enzim-enzim yang betanggung jawab pada pembukaan heliks
(topoisomerase, girase dan helikase).

9
 Komponen Replikasi DNA (2)

Pada E. coli diketahui sekuens Ori: 5- GATCTNTTNTTTT -3’.

Pada sel prokaryot, titik Ori terdapat hanya pada satu lokasi.
Replikasi berjalan/bergerak dari satu tempat hingga seluruh genom
terreplikasi  struktur  (theta).
Pada sel eukaryot, titik Ori tersebar di seluruh genom, sehingga
replikasi bisa berjalan bersamaan pada beberapa titik  gelembung
replikasi.

10
11
 Komponen Replikasi DNA (3)
Beberapa enzim/protein penting yang terlibat dalam replikasi DNA:
Pembukaan heliks ganda  persiapan proses replikasi, karena DNA
polimerase bekerja hanya pada ssDNA.
Dh DNA  Ds DNA (membuka heliks): Topoisomerase dan girase
Ds DNA  Ss DNA (membuka dupleks): Helikase
DNA Polimerase
DNA Pol I  Bukan DNA pol dominan dalam replikasi. Memiliki aktivitas
eksonuklease 3  5/ mundur (memeriksa) dan 5  3/ maju (mengganti
kesalahan)
DNA Pol III  DNA pol dominan dalam replikasi. Tidak memiliki aktivitas
eksonuklease.

12
 Komponen Replikasi DNA (4)

Masalah: DNA polimerase tidak dapat bekerja tanpa primer (DNA

pendek, ± 60 bp) yang berfungsi sebagai “jangkar”/”tambatan” DNA
pol.
RNA Primase: Sintesis primer RNA yang digunakan sebagai awal
kerja (“jangkar”/”tambatan”) enzim DNA pol.
Ligase: Menyambung celah yang terbentuk pada lagging strand
garpu replikasi
Protein SSB: Menstabilkan ss DNA dan mencegah renaturasi
menjadi ds DNA.

13
14
 Mekanisme Replikasi DNA (1)
1. Replikasi berawal dari posisi tertentu, yaitu di dekat titik Ori (origin of replication)
2. Diikuti unwinding struktur heliks ganda:
Topoisomerase-girase Helikase
dhDNA dsDNA ssDNA.
3. ssDNA akan membentuk struktur garpu (= garpu replikasi), terbagi atas: Leading
strand (utas DNA baru/anakan berpolimerisasi menuju ke arah pangkal garpu)
dan Lagging strand (utas DNA baru/anakan menuju ke luar/ujung garpu.
Utas DNA yang telah terpisah akan distabilkan oleh SSB (single-side binding
protein), sehingga tidak terrenaturasi (bergabung kembali)
4. Sintesis DNA dimulai pada kedua utas garpu. Sintesis dimulai dari primer RNA
(produk enzim primase) dengan arah 5  3.

15
16
 Mekanisme Replikasi DNA (2)
5. Konsekuesi: terdapat fragmen yang utuh dan fragmen yang putus-
putus/diskontinue (= fragmen Okazaki).
Fragmen utuh terjadi karena polimerisasi searah dengan arah pembukaan
garpu, fragmen Okazaki terjadi karena polimerisasi berlawanan arah dengan
arah pembukaan garpu)
6. Nasib fragmen okazaki: Proof reading dan koreksi terhadap fragmen
diskontinue oleh DNA Pol I dan penyambungan gap (daerah kosong antar
fragmen) oleh enzim Ligase
7. Dua utas DNA yang baru terbentuk akan digabung (winding) dengan utas
lama/induk  menghasilkan 2 pasang DNA heliks ganda yang identik.

17
18
 Replikasi pada Prokaryot dan Eukaryot

Pada Prokaryot:
DNA bakteri terdapat dalam 2 bentuk, yaitu kromosomal/genom dan
ekstrakromosomal (= plasmid). Keduanya direplikasi dengan mode
, berawal dari satu titik Ori.
Replikasi tetap membentuk struktur garpu replikasi berjalan ke 2
arah, hingga seluruh bagian selesai direplikasi.

19
 Replikasi pada Prokaryot dan Eukaryot (2)

Pada Eukaryot:
Pada saat baru memasuki fase S akan terbentuk beberapa garpu
replikasi (gelembung replikasi), sehingga replikasi bisa berjalan
lebih cepat.
Replikasi/gelembung replikasi akan selesai pada akhir fase S.
Replikasi akan selesai pada daerah telomer (daerah pada ujung
kromosom yang kaya GT), yang bertanggung jawab pada fungsi
proteksi dan positioning kromosom pada pembelahan sel

20
Repication Bubble

21
 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Ditemukan oleh Karl Mullis (1980an)  peneliti pada Cetus Corp.
Merupakan proses replikasi DNA In-vitro yang terkontrol (batas urutannya maupun
jumlahnya).
Komponen PCR:
- Template (DNA yang akan diperbanyak/cetakan)
- Pasangan primer (DNA pembatas)
- dNTP mix
- Enzim DNA pol tahan panas (dari Termus aquaticus)
- Komponen pereaksi lain (buffer, air, dan mineral oil)
Aplikasi:
- Deteksi urutan DNA spesifik
- Deteksi mutasi pada urutan tertentu
- Amplifikasi fragmen untuk keperluan kloning dan sequencing
Pro: Cepat, sensitif dan spesifik. Cont: Relatif mahal dan perlu ketelitian tinggi.
22
Polymerase Chain Reaction

23
 DNA Sequencing
Ditemukan oleh Maxam-Gilbert (jarang digunakan) dan Sanger (sering digunakan)
Teknik Sanger: Replikasi DNA in-vitro yang terkontrol menggunakan campuran dNTP
danddNTP (dideoksiNTP)  Reaksi akan terhenti bila polimer dNTP bertemu dengan
ddNTP.
Komponen sequencing:
- Template
- Primer
- dNTP dan labeled-ddNTP mix
- Enzim DNA pol III
Manfaat: untuk mengetahui urutan suatu DNA secara spesifik

25
 Aplikasi:
DNA Sequencing

26
 DNA Sequencing
Aplikasi sequencing:
1.Identifikasi spesies berdasarkan sequens DNA pada gen penyandi ribosomal
RNA.
2.Deteksi sequens gen dan DNA pelengkapnya.
3.Deteksi mutasi secara langsung (pada tingkat DNA).

27
See You Next Week