\

ybrlft'F-JNl

sNt

01 -3541-2002

Standar Nasional lndonesia

Margarin

ICS

67.100.20

Badan Standardisasi Nasional

Dafta; isi

Daftar

isi ...........

Prakata
Ruang lingkup
t:it:.

Acuan

ffi

i"S

Definisi

Syarat mutu

Pengambilan contoh

Cara uji

iligiene

Syarat penandaaan

A
Lampiran B
Lampiran

Lampiran

: Ca!-a uji asam butirai dalam lemak

: Ca!-a ujivitamin

A......

. Cara uji \"/itar,rin D...

..

........

Prakata

Penyusunan Standar Nasional lndonesia (SNl) Margarin ini merupakan revisi SNI 01-

3541-1994 Margarin disiapkan oleh Tim Panitia Teknis Makanan dan Minuman,
Departemen Perindustrian dan Perdagangan.

Adapun tujuan revisi ini dibuat adalah sebagai acuan sehingga produk margarin yang
Lreredar Ci lndonesia dapat terjamin mutu dan keamanannya bagi konsumen. Selain itu

guna mengakomodir cara uji yang mengacu pada standar internasicnal

perkembangan permintaan pasar yang cepat

dan

T.:n ci aias'dcia;'liiiieiri,usi.;i-, F,a,lcangen Si'ii ini 'i.c:an r:e::.pci'hati!-lan iiai-hai ;.'ang telter-a
dalam :

Perrnenkes Rl No. 722ll!'lenkes/PER/l)U88 . Bahan Tambahan Makanan

2.

Kec''nenkes R.l No. 23/Menkes/Sl(!/78

Pedoman Cara Produksi yang Baik untuk

Makarran.

Standar ini suoah oibahas oleh rapat teknis di Ja<arla tanggai 7 Septenrber 2001 dan
prol(onsensus tanggal 21 September 2001 dan terakhii- Cibahas dalam Rapat Konsensus
Nasional pada tarrgoai 14 Nopernber 20C1 di Jakarta. Hadii- dalarn rapat tersebut wakiiwakit dari kbnsunren, prociusen, Lembaga Litba'rg, Lembaga lpfEK, ascsiasi serta
instansi terkait lainnya.

Margarin

'l

Ruang lingkup

Si;-':a'rni menetapkan acuan, istilah dan definisi, syarat mutu, pengambilan contoh, cara
r'',3lene. pengemasan dan syarat penandaan untuk produk emulsi berbentuk semi
:aE: can cair, dengan kandungan lemaknya tidak kurang dari 62% dan iidar iebih dari
!'tl" dan penggunaan utamanya adalah sebagai margai'in,
-iia^iar ini tidak berlaku bagi mentega.

-tr

.Acuan

S"il

1998, Petunjuk pengambilan contoh pafat

1998, Cara uji minyak <ian lemak
1998, Care uii cemaran logam dalam makanan
1992, Cara uji cemaran mikroba
1998, Cara uji cemaran arsen dalant makanan
ACviS The American Oil Chernisi Scciety, 1998 Official $.tiethods arrd recominencied
Frac-Lices of the ACCS 5'h ed. AOCS Press Washington, DC
Ca 5c-87(1989)
19 - O42B 01 - 3555 Sl;i 01 - 2896 SNX 01 - 2897Slii 0'1 - 4865 -

S51

lstilah dan ciefinisi

11

rnargarin
produk makanan berbentuk emuisi {,w/o), baik semipadat maupun cair, yang dibuat dari
lernak ;rrakan dan atau minyak mal<an nabaii, dengan atau tanpa perubairan kirniawi
termasuk hidrogenasi. inteiesienfikasi, darr telair rnelalrri proses pemurrrian. seoagai
bahan utama serta mengandung air Can bahan tambahan pangan yang diizinkan.
CATATAN Bila diperlukan, rnargarin dapat pula mengandung lemak susu yang kandungannya
maximum

3oto dari.

total lemak

3.2

margarin siap makan

margarin meja dan margarin oles yang ditujukan untuk langsung dimakan, tanpa diolah
terlebih dahulu, Can dikemas

CATATAN margarin ini harus ditambahkan vitamin yang dipersyaratkan, yang jumlahnya sesuai
dengan peraturan yang ditetapkan

3.3

margarin industri
margarin yang digunakan sebagai bahan baku uniuk produksi makanan lainnya
I dari 15

r-:TAi'.t

Margarin iniiidak perlu ditambahkan vitamin

:.4
rnrargarin krirn atau spread
-:'-rarin dengan kanndungan lemaktotai : 62ok -7\o/s

Syarat mutu
Tabel

Syarat mutu margarin

Kriteria uji

No.

Margarin
siap makarr

Keadaan
1.i Bau
1.2 Warna
1.3 Rasa

i-

% btb
o/c

Vitamin A
Vitarnin D
I Asam bi:tirat.
Bilanqan asam

Cemaran logam
rimbal (Pb)
Timah (Sn)

bib

*a".s

18

nrin 80
2500 -3500
250 - 350

l- rutrcc

',100

-R %biD

_qcks_!g

.)

.L

.J
A

-a

.5
o

.)

I Cemaran arsen
I Arsen (As)
Cemaran mikroba
Angka Lempeng
Tota!

tlll,fu:Lr

dapat diterima
dapat diterirna
daoat diterima
maks 18
min 80

fnglg_gg I

maks.O,Z.

maks 4
maks 4
Sesuai peraturan yang beriaku

rnaks 4

mg/rg

0,1
i'naKs.

mg/kg

40,0/25c*"
mal<s.0,03

'c

Persyaratan
Margarin

0,1

0,1

maks.
40,0i250""
maks. 0,03

maks.

40,0/250"*
maks. 0.03

0,1

Koloniig

$.4aks 10s

maks 10s

maks 10s

APfr4/g

maks 10

maks 10

maks 10

APM/s
E. Coli
Maks 102
Koloni/g
S. aureus
negatif
Koloni/25 g
Salmonella
Maks 102
Koloni
Enterococci
untuk margarin yang mengandung lemak susu

<3

<3

maks 102
negatif
maks 102

maks 102
negatif
maks 102

Q clztari

hanf

r rlz

<3

**) daiam kemasan kaleng

2 dari

li

Pengambitan contoh

Sesuai dengan SNI 19-0428-1998, Petunjuk pengambilan contah padatan

6 Cara uji
6-1 Keadaan
Bau, rasa, dan warna sesuai SNI 01 - 2891
butir 1.2

6-2

1992, Cara uji makanan dan minuman,

Kadar air

Sesuai SNI 01 - 2891 - 1992, Cara uji makanan dan minuman, butir 5.1

6.3

Lemak

Sesua! SN!

6.4

0'i

2891

1992. Cara tiii mai<aneii dan minumJn. Lutir 8.'3

Bilangan asam
- 3555 - 1998, Cara

Sesuai SNI 01

5.5

uji minyak dan iemak, butir 8

Asam Butlrat

Sesua; cara rrji kandr-rngan asam butilat dalam leinak (Lampiran A)

5-G Vitarnin A
Sesuai cara ui!vitar,lin

5.7

Vitamin

A.

(lampiran B)

SesuaiCara UjiVitamin D (Lamoiran C)

6.8

Cara uji cemaran logam

6.8.i

Timbal (Pb)

Sesuai SNI 01

6.8-2

2896 - 1998, Cara ujiceinaran logam dalam makanan

Timah {Sn}

Sesuai SNI 01 - 2896 - 1998, Cara ujicemaran logam dalam makanan

6.8.3

Raksa (Hg)

Sesuai SNI 01

2896 - 1998, Cara uji cemaran logam dalam mak

6.9

Cemaran Arsen (As)

Sesuai SNI 01 - 4866 - 1998, Cara uji cemaran arsen dalam makanan

6.10

Cemaran Mikroba
Sesuai SNI 19 -2897 - 1992, Cara uji cemaran mikraba

3 dari 15

Higiene

ffimduk yang bertanda SNI ini, harus dipersiapkan/diproses dan penanganannya mengacu
mmria pssturan Depademen Kesehaian Rl yang berlaku tentang Pedsman Cara Produksi
gmq Baik uniuk Makinan

Pengemasan

ililwgarin dikemas dalam wadah yang tertutup rapat. Kemasan tidak dipengaruhi atau
nnelnpengaruhi isi, sehingga pi'oduk tetap baik selama penyimpanan dan pengangkutan.

Syarat nenandaan

9-1

Labei

Prcduk harus dilabel sesuai PP No. 69/1999 tentang label dan iklan pangan,

9-2

Cara pernberian nama

Elila suatu produk marga;'in ditujukair untuk penggunaan khusus dan atau mempunyai
karakteristik yang spesifik, rnaka kata yang menggambarkan keterangan oenggunaan
atau karaktei'istik tersebut dapat dijadikan kata keterangan dan diletakkan di belakang
kafa rnarga.in.

CONTCH :
llagarin kue adalah margarin yang digurrakan untuk membuat kue.
Margarin
Margarin
Margarin
Margarin
l'largai-in

biskuii adalah margadn untuk

biscurt.
pastry (lipat) adalah margarin 'nernbuat
yang digunakan untuk membuat pastry.
"
dapur adalah margarin untuk rnasak
oles adalah margarin untuk dioies.
put;h adalah margarin tanpa penambahan bahan pewarna.

4 dari

l5

Lampiran A

(normatif)
Cara uji kandungan asarn butirat dalam lemak

4.1

Definisi

Asam butirat dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya lemak susu dalam suatu
produk lemak.

4.2

Ruang lingkup

Metcde ini dapat dipakai untuk rnenentukan kandungan lemak susu dalam margarine,
yang jumlahnva dinyatakan sebagai persentasi asanr buiirat dalam komposisi asam
len:ak dari suatu p;-ocuk.

A.3

Peralatan
Kromatografi gas dengan FID Detektor dan integrator elektronik
Kolom : Chromosorb W, panjang 2 m dan Ciameter dalam 3 mm, glass
Syringe

pl ( 5 pl atau 1C prl ).

Gelas piala 50 ml.

Tabung reaksi 10 ini bertutup asah.
Pipet ukur 2 ml sampai 5 ml.
Kedas saring.
butiran-butiran kaca.
Kaca arloji.
Penangas air.

4.4

Bahan pereaksi / kimia

Aq uadest untuk kromatografi.

Air yang digunakan untuk analisa adalah air kromatografi.

KOH 0,5 N dalam etanol.
Larutan asam orthophosphat 5% b/v dalam air.
Larutan standar asarn n - butirat : 0,4 mg / mldalam air.
Larutan standar internal asam n * valerat .0,25 mg / mldalam air.

5 dari 15

4.5

Kondisi operas! kron-ratografi gas

-.cndisikan kolom sebelum dipakai pada suhu 180 "C seiama nrinimum 43 jam

3.lhu lnjektor

.1750C.

Sunu Detektor

.25

Suhu Oven

,'.aktu rambat (Retention

: 130

tlme)

Gas pembawa (Carrier gas)

4.6

Cara kerja

A.5.i

ri-:--;ak=i!=ra=i

50

oC

135

di atas suhu anaiisa

oC.

: kurang lebih 5 menit

Helium, Nitrogen, dengan kemurnian 99 95%

A.6.f .1 Buat larutan deret siandar dalam tabung reaksi yang mengandung O,0B mg;
J 2 nrg; 0,+ nrg; 0,8 mg, 1,4 mg dan 2,0 mg asam butirat dan 0,5 rng asam valerat dengan
cara sebagai beiikut: li4asukkan ke daiam masing-masing tabung reaksi . C,2 nrl,0,5 ml;
i,(J mi 2,0 ml; 3,5 ml dan 5,0 nri larutan standar asam butirat, kemudran tambahkan
iarutan asam valerat ke Calam rnasing-rnasing tabung reaksi tersebut sebanyak 2,0 mt,
seteiah itu tambahkan air secara bei-urutan 4.8 m!; .1,5 ml; 4,0 ml; 3,0 ml; 1,5 ml dan
0 mi air.
Tr.rtup tabung reaksi dan kocok sampat larutan tercampur rata.

A.6.1.2

Stabilkan kolurn KG sekur'ang-kui-angrrya 30 menit pada suhu analisa

A.6.'t.3

lnleksikan secara bergi!iran

1 p! lar-utan standar yang telah dipersiapkan

(butir- A.6.1.1)

A.6 1.4 Ukurtinggi puncak kromatogram (peak) asanr butirai dan asam I'alerat dengan
ketelitian 0,5 rnm

A.6.1=5. Hiiung rasio tinggi puncak (asam butir-at / asam valerat) untuk setiap stanoar
dan buat kurva hubungan antara ratio tinggi puncak dengan berat asam butirat ;-ang
terkait.

4.6.2

Penetapan kandungan asam butirat

4.6.2.1 Timbang contoh dengan teliti kurang lebih 100 mg ke dalam piala gelas
tambahkan 3 nrl larutan KOH 0,5 N dalam ethanol dan beber-apa butir batu didih- Tutup
gelas piala dengan kaca arloji dan letakkan dalam penangas air yang mendidih kirakira 10 menit atau sampaitioak kelihatan lagi butiran lemak di permukaan
Angkat kaca arloji dan lanjutkan pemanasan sampai seluruh
Angkat gelas piala dan diamkan sampaiciingin.

4.6.2.2

Tambahkan 5 ml air

6 dari 15

etanol

menguap

A.6.2.3 Tutup

ciengan kaca arloji dan goyangkan peilahan-lalran sampai sernua

sabunnya larut (dapat dibantu dengan pemanasan).

4.6-2.4 Tambahkan larutan asam

orthophosphat 5,0 m!, goyangkan sedikit untuk

mengengkoagulasi asarn le-rnak yang mengendap.

A.6-2.5 Saring dengan kertas saring lipat

A.6-2.6 Ambil dan pindahkan filtrat sebanyak 5,0 ml ke dalam tabung reaksi
tambahkan ke dalamnya 2,0 ml larutan standar internal asam valerat.Tutup
honrogenkan

A.6.2.7
A.6.2.8

4.7

dan
dan

Stabilkan koiom kurang lebih 30 menit pada suhu analisa.

lnjeksikan

pl larutan contoh tadike dalam KG.

Perhitungan

Hitung rasio tinggi puncak kromatogi'am asam butirat / asam valerat yang diperoleh dari
analia contoh dan hitung kanciungan asam butirat berdasarkan kurva standar yang
didapai
Kaitdungan asarn hutirat dinyatakan seoagai persentasi (b/v) sebagai berikut

W (b) x 100

(s)

dengan pengertian :
w (b) adalah ber'al asam butlrat (mg) yang drbaca dari kurva standar
W (s) adalahberat contoh (mg)

A.8

Referensi

AOCS Oftrcial Metirod Ca 5c - 87 (19S9)

Tdari

15

Lampiran B
( normatif )

Cara uji vitamin A

8.1

Prinsip.

Lemak atau margarin dilarutkan dalam isopropanol / chloroform dan di analisa dengan
khromatogi-afi kinerja tinggi (HPLC) menggunakan detektor UV. Peak vang dioeroieh
untuk,vitamin A asetat dihitung dengan membandingkannya dengan standar eksternal.

8.2

Pereaksi

Pereaksi yang digunakan harus yang berkualitas atau HPLC grade (lihat butir B.Ba)
Propanol- 2 (lso propanol)
Chloroform
f\letanol
Standar vitamin A asetat yang kepekatannya diketahui (lihat butir B. Bb).

8.3

Peraiatan

Geias piala 25 rn!

Labu ukur 25 mi, 100 ml
Seperangkat HPLC
Seperangkat alat penyaring, sepe:'ti : Miilex SR, penangas air. oven dengan thermostat,
neraca dan lain - larn.

8.4 Kondisi

HPI-C

Kolom

Detektor
Panjang gelombang
Kepekaan detektor
Campuran solven
Solven 'i
HPLC eluen
Kecepatan alir eluen
Volume injeksi

Li chrosorb RP 18,5 um, 150 x 4,6 mm kolom baja

(lihat butir 8 c)
UV
-?25 mm
0,02 AUFS (lihat butir B f)
lihat butir 8 a
Proponal-2 : chloroform 85 : 15 (untuk melarutkan
contoh)
metanol : chloroform 97,5 2,5 (untuk standar
vitamin A)
1,0 ml / menit
20 pl
,

dari

15

8.5

Kalibrasi standar

Siapkan larutan stock 10 mg vitamin A asetat dalam 100 ml propanol-2 yang sudah
(lihat butir B.Ba), sebaiknya dengan mengencerkan dari larutan yang
dihilangkan gasnya
-100
mg / 50 mg). Sebelum dianalisis, encerkan 1 ml larutan stock ke
tebih plkat fnris
dalam 100 rni solvent 1 (propanol-2: Chloroform = 85:15). Gunakan iarutan ini untuk
mengkalibrasi HPLC (lihat butir B.B b).

8.6 Cara kerja

a.

Persiapan contoh

Tiinbang clengan telrti 1 .5 - 2 0 g contoh ke dalam piala 25 ml- Tambahkan

sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC (lilrat buttr B'B e)'

+l

&

b.

Pencucian / ReconCition
Cucilah kolom dengan alat HPLC dengan memompa eluen yang seSuai untuk kira-kira
1-2 jam sebelum airalisis. Pada selang waktu ter-tentu, injeksikan larutan pengkalibrasi
untuk meyakinkan bahwa retensi w;rktunya stabil dan hasilnya jelas terlihat.

Kalibrasi
Buatlah kuiva kalibrasi Cengan cara yang biasa

ci. Analisis

tnjek.20 ql tarutan contoh. Uku:' area peak zat yang ciitetapkan Catam ccntoh. Untuk
'
induk dan larutan konsentrat yang iain, larutan contoh harus dienceirkan
"",rpurrrl
dengan sesuai sebelum dianalisis. Disarankan uniuk mencuci kolcm iIPLC dengan
mempercepat kecepatan alir antara injeksi ccntoh'

B.7 Perhi'rungan
Faktcr kalibrasi
!-uas
F_

puncak

Jilmlah

As
Ms

Perhitungan kandungan vitamin A asetat

AAMs
C- --- x D=
FWASW

x ----- x D

Dengan pengertian :
F adalah faktor kalibrasi
As adalah merupakan peak area dari standar yang sesuai dalam kromatogram
kalibrasi (lihat butir B Bg)
Ms adalah jumlah standar yang diinjeksikan (lihat butir B B g)
B B g)
C acjalah kandungan vitamin A asetat dalam contoh (lihat butir
kromatogram
dalam
asetat
A
A adalah merupakan luas puncak vitamin
contoh (lihat butir- B B g)
9 dari l5

W
D

adalah kandungan vitamin A asetat dalarn conioh (lihat buiir B. 8 g)

adalah merupakan luas puncak vitamin A asetai cialam kromatogram
contoh (lihat butir B. B g)
adalah bobot contoh dalam gram
adalah faktor pengenceran

8.8 Catatan

,ati;

a.

Semua solven dan campuran solven sebelum digunakan harus diitilangkan gasnya,
untuk menghindari kehilangan vitamin A dan menjarnin kelayakan kemarnpuan pompa
HPLC. Cara menghiiangkan gas daoat dilakukan seperti dijelaskan dalam manual alat
HPLC atau dengan menrupkan helium melalui solven, atau dengan memanaskan
sebentar di bawah titik didih dengan reflux kondeser. Solven harus transparan dalam
UV pada 325 n'tr.

Jika konsentr-asi standar vitamin A yang digunakan tidak diketahui, standar tersebut
harus ditetapkan derrgan UV spektrofotcmetri, dan kemurniannya Cicek dengan HPLC
(hanya satu peak harus diperoleh pada 325 nrn ketika menggunakan cara reverseC phase HPLC).

c.

Umunrnya koiom C18 reversed phase akan bekerja dengan baik. Tapi perlu
penyesuaian ratio campuran eluen HPLC (metano! : .;hloroforrn) untuk nrempercieh
peak yang oapat digunakan.

d.

Pernanasan sebentar pada penanggas aii-, mengocok deirgan pengaduk, jika perlu
pemanasan harus minimal darr larutan hanya hangat (+/- 30 "C).

e.

Untuk menyaring, gunakan peralatan penyaring biasa yang cocok untuk menyaring
yang padikelnya Ci atas 1 pm. Sebagai alternatif, dapat digunakan Milex Sr 0,5 um
(tekan 1-2 ml larutan conioh melalui penyaring memakai syringe 2 ml, buang 2C0 500 rnl pertama, injek larutan saringan yang berikutnya).

Harus digunakan variable, panjang gelcnrt-rang detektor UV yang sensitif,

memberikan signat yang baik uniuk noise rasio pada 0,02 av a.u.f.s (a.u.f.s. = unit
serapan pada skala penuh). Berapa model yang l<uno mungkin tidak cukup sensitif.

Luas purlcak dan jumlah vitarlin dapat diukur atau dihitung dalam unit yang,sesuar,
misalnya peak area dalam mm', cmt, uv detik atau pembacaan planmeter dan;umlah
dalam pg ester vitamin A bebas atau dalam internasionai unit (lU). Buatlah bahwa
unit-unit yang sama diqunakan melalui prosedur untuk kalibrasi dan analisis.

l0 dari l-\

Lampiran C
(ncrmatif)
Cara uji vitamin D

C.1 Prinsip
Penyabunan contoh pada suhu ruang dan recovery fraksi kandungan vitamin D dari
bahan yang tidak tersabunkan menggunakan teknik RP. Pemisahan penyerapan
kromatografi fraksi ini untuk penetapan kualitatif dan kwantitatif vitamin D. ldentifikasinya
drbuat dengan membanCingkan retensi waktu relatif dengan standar.

C.2

Pei'eaksi dan baha;-i-banaii

a. Vitanrin D3 (ergocalciferol 50-14-6) atau vitamin D3 (67-97-0). Harus digunakan

standar yang murni dengarr diketahui jumlahnya.

Peritatian'.
Ergocalcifrel (vitamin D2) dan vitamin D3 adalan sangat be;-acurr bila dhisap, kena k'.rlit
atau ditelan. Ada kernr-rrlg(lnan akibar pengaruhnya. Jika mer3sa kurang enak baCan.
temullah dokter (tunjukkan labelnya jika mungkin): Pakai pakaian petindung yang sesuai,
sarung tangan Can pelindung mata / muka iangan menghisap debtr.
b. Pl,rogallol i87-e5-1)
Perhatian : Pyrogallol berbahaya bila dihisap, mengenai kulit dan iika ditelan
c. Etanoi 96%
d. Larutan KOH jenuh
e. Metanol untt-rk chrcmatografi

f. Dietii eter, bebas percksida

,4

dioxane, uniuk kh;ornatografi

h. n-heksana, untuk khromatografi

i. Nitrogen 99,99%

;. ilatrium suifat, bebas air

k. Alumunium Foil

l.

Eluen 1. Air dalam metanol Q = 8 ml /

m. Eluen 2'. 1,4

dioxane dalam n - heksan Q = 75 ml

dari l5

C.3

Peralatan

a.
b.

Neraca analitik.

c.

Gelas ukui- 10 ml, 5C ml, 250 ml dan 500 nil.

d.
e.

Corong pemisah i labu kocok berwarna coklat 250 ml.

Erlenmeyer berwarna coklat 200 ml.

rabu berdasar bulat coklat 250 ml.

f. Ccrong 0,8 cm.

g. Rotai-y evaporator.
h. Flutecj filter, watei- repellent
:

j.
k.
l.

n^-

-,-,1 '-..-,r;
^^--L!'L..-^
-,,^,-; n ?.J.----iJUii-iiuiiu.i
i-'enyaiing vacuiil iiiieio az iiii,
L;er-,Ee: L^-^^]eiiang pengniiDiinE

Labu berbentuk lancip coklat 10 ml, ciengan sambungan bawah.

Labu ukur coklat 1 rr,l, 2 ml, 5 mi dan 100 ml.
Kombirrasi seperangkat i-IPLC dengan detector UV

m. Rekorder / alat pencatat.

n.
o.

Sis'rem integrator'.

Kolcrn RP-18,5

!m, 250mnr x 4,5 mm

Cengan 2 cm pre kolorn RP-13.

p Kolom . Si 60,5 um,125 mm x 4.5 n-im.

q. Feeding system 100 pi - 2000 pl
r. Mesin pengccok atau nragnetic stirrer
s. Alat pendingin untuk +/- 0 oC
t. Porrrpa vacu;'n
.

I
i

u.

lripet ukur 5 ml

Syi-inges '10

Ut

2000 pl atar-r autosampler

C.4 Cara Kerja

Timbang dengan ketelitian 1 mg 109 -15 g contoh ke dalam labu 200 ml

Tanibah 50 ml etanol, 100 pyrogallol dan 20 ml larutan KOH jenuh

Kocok atau aduk campuran tersebut di atas dengan kuat di bawah tekanan N2 pada 25 oC
- 30 oC selama 30 menit

Pindahkan ke dalam labu kocok 500 ml dan dibilas dengan 150 ml airdan 150 ml dietil
eter lalu kocok dengan kuat
Eksti-ak lapisan airnya dua kali dengan masing-masing 100 ml dietil eter

Gabungkan dietil eter dar dicuci dengan 100 ml air sebanyak 3 kali.

ll

dari l5

CATATAN Air oencucinya harus betul-betu! sarnpai netral

Tanrbah 5 g natrium sulfat dan larutan eter ke dalam rvater-repellent filter dan saring

ke

dalam labu berdasar bulat 250 ml

Bilas labu kocok dengan sedikit dietil eter

oC di baw'ah tekanan yang

Uapkan solven dengan rotary evaporator pada maks. 40
dikurangi (pcmpa uap air).
oC dan saring clenga;t
Tambah residu tersebut dengan 10 ml metanol, biarkan pada 0
vacum mikro. Buang residu saringannya.
Masukkan saringan ke dalam iabu lancip 10 ml dan uapkan dengan rotary evapoi-ator
sampai kira-kira tersisa 1 ml
Pindahkan ke dalam labu 2 ml dan impitkan dengan metanol.

'
'1.

cA-iAlAi.j

,;:ka t--r;adr !,..i.ierui:al .,,anc mcnia;;t"3x 6epain:/a .oengeniapan, g'-riiakarr iar'uiarr

yang jernih untuk diinjeksikan ke HP'*C.

C.5

Pemisahan bahan yang trdak tersabunkail dengan cara tehirik :'eversing

phase.

Penetapan fraksi vitarnin

[.r

Timbang 50 rn! vit.'D ke dalani labir ukur 100 ml, larutan dalam metanol pada suhu
kamar dan irnpitkan sampai garis tancia dengan nretanol.

Encerkan +l- 100 rn! larutan (a) ke Caiarn labu ukur 100 rnl dan diimpitkan dengan
metanol.

Kondisikan kolom RP 18 Cerrgan pre-kolom menggunakan eluen icjan kecepatan aiirnya

2 ml t rnenit sampai menciapatkan garis lurus yairg stabil pada panjang gelombang
265 nm.

,r

I i.

qn

Aiirkan 1000 ml larutan (b) ke dalam kclcm RP r 8 da:r pre kolorn yang sr.rdah dikondisikan
mengguirakan eluen I dengan kecepatan alir 2 ml/rnenit.
Tetapkan waktu retensi dari awal sampai akhir dari aiiran vitamin D. Tentukan waktu
antara permulaan aliran "- 1 menit" dan akhir aliran "+ menit" sebagai fraksi window.

C.6

Recovery fraksi vitamin D

a.

ln.iek 1C00 ml larutan (e) ke,Jalanr kclom F.P 18 dengan pre kolom yang st:dah
dikondisikan dan alirkan eluen I dengan kecepatan alir 2 ml / menit.

b.

Kumpulkan fi'aksi vit. D (C.5e) yang dialirkan di antara fraksi windov'r dalam labu lancip
10 ml.

CATATAN

Fraksi vit. D yang dikumpulkan harus melewati detector ultra violet, ini dapat

diperoleh dengan menghalangi penutup atau klep corresponding pilot

c.

di bawah tekanan yang Cikurangi dalam rotary

Uap'<an fraksi (b) dengan sempurna

oC.
eva'roratoi- pacia maksimunr 40
I

dai-i

l-5

a--i":-

; c^'

':sl.r-r dengan kira-kira

'1

ml eluen 2 dan ciinciing iabu dibilas dengan hati-

e F -,::-. e- anlar Cengan ada sebagian yang menganciung oartikel padat dalam i C00
ii - -;: tre._lan dipasang penyaring mikro yang berpo.i-pori 0,45. Gunakan larutan
S_,

ja-

::rcebut untuk penetapan secara kuantitatif (butirC. Ba). ir4asukkan larutan

sal-,1:- : aias ke dalam labu ukur 2 ml dan impiikan clengan eluen 2- Gunakan
sa--

lar:a- -

C.7

th

Merrlbuat grafik kalibrasi

a. Ti-:=-_

seiiac kaii sebanyak 200 ml.

Cengan keielitian 1 mg, i00 mg vit. D ke dalam labu ukur 100 ml dan
2 lmoitkan samoai garis tanda dengan eluen 2.

\zi:t,'-^'?- -='r.')Ai'i eluen

Pice: i n': leru*tan a ke dalam laou ukur 100 mi cian impitran dengan eiuen 2 sai-npai
ca.is ianca

c.
d

Pice:5 -nl larutan h ke Calam labu ukur 100 rnldan impitkan dcngan cluerr2.
lnj:<:ebanyar< 10 plsarnpai 100 pii ia'utan c untuk menrbtrat grafik kalibrasi ke dalam
aia: HPLC
CATA

tAN t0 ul larutan c mengandung

25 mg

vit D.

e.

Alirka;r laruian c ke cialam fraksi F.oiom dengan eluen 2 pada kecepatart aiir'1,2 nrl /
ni:nit. DeteKsi ultr-a violet pada 265 nrn.

f.

Plot grafik kaiibiasi dengan rneirggambark.ar, tanda{a;rda waktu detektor sebagai

jumlah vitamin D yang diinjerkan.

C.8

Penetapan v;tamin D secara kuantitatif dan kualitatif

?.

Gunakan fraksi yang dipercieh pada (C.6c) unttrk peneiapan vitamin D. Untuk injeksi
pada saat pengujian awal, pilinlan vclunre )/ang penetapan vitarnin D secara kuaniitatif
cjapat dilakukan sesuai grafik kaltbrasi.

b.

Pemisah kondisi-kondisi fraksivitamin D kerjakan seperti C.7e.

C.9 Perhitungan
a.

Penetapan kualitatif
Rrnrlinnk:n luaktrr retensi khr"omatoot'afi
vano diner-oleh sesuai C.8b elenqan \.'anQ
-..j-..Y-.i"".'J
ditetapkan pada waktu plot grafik kalibrasi untuk vit. D dan incientifikasi vit. D dalam
khromatogram.

b.

Penetapan kuantitatif
Kandungan vitamin D (M), dihitung dalam unit per'100 gram margarin, di mana satu
unit vitamin D. Sesuai dengan 25 mg vitamin D dengan rumus :

14 ciari

l5

,?a

l/t

Mt.10c.vt.v3
Mo. F.V2.V4

Cengan pengertian

Mo adalah bobot contoh dalam

gram;

Ml
v1

adalah bobot vitamin D yang di dapat dari grafik kaiibrasi dalam monogram;
adalah volume larutan contoh yang ciiukur (butir 4a) unruk pemisahan
RP-phase dalam mikroliter;

V2

adalah volume yang diinjeksikan untuk pemisah RP-phase (butir 6a) dalam
mikroliter;

V3

adalah volurie larutan contoh yang rjiukui- uniuk khomatografi (buiir C.Ba) dalam
mikroliter,

V4 adalah

volume larutan conioh (yanE Ciukur) yang pada khomatografi (butir C.Ba);
acalah Faktor ko;':versi dari monogranrs vitamin D ke dalam units 25;

Jika ada keragr-r-raguart plci vitarnin D pada fr-axsi vitamin D yang diperoleh sesuai
butir C.6c dan khiornatograr.r- berikutni,a di bawah ini kondisl
-vani Oiietaikrn p"O" Urti,
c.6b

CATATAN Untuk

penetapan vitamin D khromatogram yang diperoleh secara rutin untuk

margarrn yang diketahui dapai digr.rnakan sebagai acuan.

15

dari

15