Enhancer dan Silencers yang memodulasi Transkripsi pada Eukariot

Gen Eukariot diregulasi oleh elemen promoter yang terletak hanya di upstream
(5) dari lokasi inisiasi transkripsi dengan cara yang hampir sama dengan regulasi
gen prokariot. Pada kasus gen ubx Drosophila, promotor eukariotik ini
kemungkinan sangat komplek dengan binding site untuk berbagai macam protein
regulator. Sebagai tambahan pada daerah dekat promoter, berbagai gen eukariotik
juga diregulasi oleh elemen cis-acting yang lebih jauh yang disebut enhancer dan
silencer. Enhancer meningkatkan transkripsi dan silencer menekan transkripsi gen
yang diregulasi.
Ciri utama enhancer yang membedakannya dari promoter sebagai berikut
1. Enhancer dapat bertindak dengan jarak relatif lebih luas, sampai beberapa

ribu pasangan nukleotida dari gen yang diregulasi.

2. Enhancer bebas berorientasi, fugsinya sama baiknya dengan salah satu
orientasi yaitu normal atau terbalik (berputar ujung ke ujung)
3. Enhancer bebas berposisi, berfungsi sama baik apakah terletak di ujung
(5) dari gen, ujung (3) dari gen, atau terletak dalam intron dari gen.
Enhancer merupakan elemen yang relaif besar, panjangnya sampai beberapa ribu
pasang nukleotida. Enhancer kadang-kadang mengandung sekuen yang terulang
yang memiliki sebagian aktivitas enhancer sendiri. Sebagian besar elemen
enhancer berfungsi pada cara jaringan-spesifik sempurna atau secara sebagian,
sering akan hanya meningkatkan transkripsi gen pada jaringan target spesifik
(jaringan dimana produk gen dibutuhkan).
Penelitian tentang enhancer dilakukan pada minikromosom pada simian virus 40
(SV40), virus kera yang dapat diteliti pada kultur sel. Enhancer SC40 lengkap
memiliki panjang 220 pasang nukleotida. Daerah minikromosom SV40 tidak
dibungkus kedalam nukleosom. Barangkali, enhancer SV40 dibungkus oleh
protein faktor transkripsi yang mencegah pembungkusan kedalam nukleosom oleh
histon. Enhancer SV40 mengandung dua ulangan langsung 72-nucleotide-pair dan
delesi dari ulangan keduanya menghilangkan ektivitas enhancer. Jika satu dari
ulangan langsung dihilangkan, enhancer masih fungsional. Eksperimen awal
menunjukkan bahwa enhancer SV40 dapat berpindah ke lokasi lain pada
minikromosom SV40 tanpa kehilangan akivitasnya. Lebih lanjut, dapat
dihilangkan dari kromosom enhancer SV40 dan disisipkan kembali pada orientasi
yang sebaliknya tanpa kehilangan fungsi. Ketika enhancer SV40 ditempatkan
pada salah satu sisi beberapa gen eukariotik berbeda (misalnya gen -globin
manusia), secara tejam meningkatkan laju transkripsi dari gen tersebut. Secara in
vivo, penyisipan enhancer SV40 kedalam beberapa ribu pasangan nukleotida gen
structural dapat meningkatkan laju transkripsi sebanyak 100 fold.
Banyak enhancer dikarakteristikkan berperan dalam regulasi ekspresi gen. ciri
yang menarik dari karakteristik enhancer adalah menunjukkan kekhususan
jaringan. Enhancer terletak di dalam intron dari komplek gen heavy-chain. Pada

genom ayam, enhancer terletak diantara gen -hemoglobin dan gen -hemoglobin,
enhancer menstimulasi transkripsi dari gen -globin selama perkembangan
embrionik dan gen -globin saat dewasa. Pengkhususan jaringan enhancer
mengagumkan, akan tetapi kita tidak paham dasar molecular pengkhususannnya.
Kemampuan enhancer dan silencer untuk bertindak pada jarak 1000 pasangan
nukleotida atau lebih adalah menarik. Melalui mekanisme apa regulator cis-acting
ini mempengaruhi transkripsi dari promoter yang kemungkinan lebih dari kilobase
jauhnya? Kita tidak tahu jawabanya secara rinci. Akan tetapi satu poin yang
sangat jelas. Faktor berikatan pada sekuen enhancer dan sekuen promoter dapat
bertindak secara bekerja sama, salah satunya secara positif atau negatif. Hal ini
mengindikasikan bahwa protein ini mungkin bertemu, setelah beberapa waktu,
mengusulkan bahwa keterlibatan pelekukan atau peliatan DNA untuk
membolehkan kontak tersebut. Model tindakan enhancer dan silencer menyerupai
mekanisme regulasi operon ara pada E. coli, kecuali banyak protein regulator
hadir untuk terlibat pada eukariot yang lebih tinggi. Contoh kasus -hemoglobin
ayam, bukti yang ada bahwa implikasi ikatan sedikitnya lima protein berbeda ke
promoter dan sedikitnya lima protein berbeda pada enhancer. Sejak dua dari faktor
transkripsi yang sama berikatan dengan kedua elemen yaitu promoter dan
enhancer, data yang ada mengindikasikan bahwa sedikitnya delapan protein
berperan dalam transkripsi regulasi gen -globin ayam. Regulasi transkripsi pada
eukariot lebih tinggi adalah komplek.

Regulasi Tingkat Transkripsi oleh Metilasi DNA

Pada sebagian besar tumbuhan dan hewan, DNA sering dimodifikasi setelah
disintesis dengan pengubahan banyak basa sitosin menjadi basa 5-metilsitosin.
Berbagai macam metilasi dari spesies satu ke spesies yang lain, pada mamalia dari
2-7 persen sisa sitosin dimetilasi.
Grup metil pada atom karbon nomer 5 pirimidin menempati tempat terbuka dalam
lengkung utama molekul DNA dan memiliki potensi memainkan peran yang
berpengaruh dalam nteraksi DNA dengan protein spesifik. Faktanya, penelitian
pada ikatan repressor untuk lac operon E coli ke lac operator DNAmenunjukkan
bahwa penambahan atau penghilangan grup metil tunggal dapat mengubah secara
tajam afinitas repressor ke DNA. Peran regulator yang potensial dari grup 5-metil
pada basa pirimidin berkedudukan kuat.
Tidak ada bukti pasti peran metilasi pada regulasi ekspresi beberapa gen
eukariotik. Pendapat tentang keterlibatan metilasi dalam control ekspresi gen pada
eukariotik terutama berdasarkan 3 macam bukti tidak langsung.
1. Banyak penelitian menunjukkan hubungan antara level ekspresi gen dan
tingkat metilasi seperti
Metilasi yang rendah ekspresi gen tinggi

Metilasi yang tinggi ekspresi gen yang rendah

2. Pola metilasi spesifik pada jaringan, pada beberapa kasus.
3. Obat-obatan (analog basa) 5-azacytidine, yang tidak dapat dimetilasi
setelah disatukan ke DNA, menunjukkan hasil ekspresi gen pada jaringan
dimana secara normal tidak diekspresikan.
Aspek penting pola metilasi adalah mereka hadir clonally heritable. Lebih dari 90
persen metilasi pada DNA sebagian besar eukariot terjadi pada sekuen
dinukleotida CG, dan sekuen ini dimetilasi secara simetrik. Replikasi
semikonservatif pada sekuen yang dimetilasi secara simertik akan menghasilkan
sekuen two half-methylated.
Pada kehadiran DNA metilase yang spesifik untuk sekuen yang setengahdimetilasi, pola metilasi seperti itu akan clonally heritable, dimana sekali
terbentuk, pola akan melewati seluruh sel dari garis keturunan tersebut. Beberapa
metilasi pada bekteri tentu diketahui terutama berperan pada tempat setengahmetilasi, dan poin bukti pada adanya metilase pada eukariotik dengan komponen
yang mirip.
Keistimewaan pola metilasi DNA adalah sekali terbentuk. Langkah kunci pada
model untuk regulasi ekspresi gen pada diferensiasi sepanjang metilasi DNA
melibatkan pembentukan jaringan-spesifik pola metilasi. Hipotesis paling terkenal
yaitu pola terbentuk selama perkembangan oleh jaringan-spesifik demethylase,
yang memindahkan grup metil dari tempat genting pada gen yang dijadwalkan
diekspresikan pada tipe sel khusus. Ini merupakan model atraktif , kita harus
menekankan bahwa hanya itu: model. Tidak ada beberapa jaringan-spesifik
demethylase yang belum diidentifikasi. Metilasi-memblok 5-azacytidine telah
ditunjukkan pada hasil ekspresi (-hemoglobin) , pada tingkat yang lebih rendah
yaitu embrionik (-hemoglobin) -seperti gen hemoglobin dari baboon dewasa
yang menderita anemia dan manusia dewasa dengan -thalasemia berat
(pewarisan penyakit dikarakteristikkan dengan ketidakmampuan untuk
mensintesis rantai -hemoglobin dari hemoglobin dewasa) dan anemia sickle-cell.
Gen embrionik dan fetal secara normal tidak diekspresikan pada sel darah merah
untuk orang dewasa . salah satu dari penelitian ini, DNA pada bagian gen hemoglobin dan -hemoglobin menunjukkan mengandung lebih sedikit grup metil
(menjadi undermethylated atau hypomethylated) pada sel darah merah
individu setelah perlakuan. Hasil ini tidak hanya mendukung hipotesis bahwa
metilasi penting untuk regulasi ekspresi gen, tetapi juga mengusulkan pendekatan
yang mungkin untuk pengobatan bagi penderita penyakit yang diwariskan.

Apakah Z-DNA berperan dalam regulator?

Salah satu penemuan yang paling menarik yaitu segmen DNA yang memiliki
sekuen dimana purin dan pirimidin berselang sepanjang masing-masing unting
dapat membentuk left-handed double helix. Menurut Watson-Crick, B-form DNA

adalah right-handed double helix. Bentukan left-handed double helix DNA

dinamakan Z-DNA untuk zigzagede paths dari rangka gula-fosfat dari molekul.
Secara normal Z-form dari sekuen DNA purin dan pirimidin yang berselang
terjadi hanya pada konsentrasi garam yang tinggi. Ketika beberapa basa dari
potensial sekuen Z-form dimetilasi, Z-formation stabil pada konsentrasi garam
yang lebih rendah. Susunan Z-DNA dari purin dan pirimidin yang berselang yang
mengandung basa yang dimetilasi kemungkinan stabil secara in vivo. Kestabilan
ditingkatkan oleh kation, termasuk polyamine seperti spermin, oleh negative
supercoiling dan oleh DNA binding protein spesifik untuk Z-DNA.
Faktanya, terdapat bukti bahwa Z-DNA terdapat pada daerah interband dari
kromosom kelenjar saliva raksasa Drosophila melanogaster dan molekul aktif
transkripsional dari protozoa bersiliata Stylonychia mytilus. A. Rich dan
koleganya telah mempersiapkan entibodi spesifik untuk Z-DNA dimana antibodi
ini tidak bereaksi dengan B-form DNA. Z-DNA antibody spesifik berikatan di
daerah interband dari kromosom polytene D. melanogaster. Apakah sekuen
interband tersebut mengontrol ekspresi gen (menggembungkan) yang terletak
pada bannd yang berdekatan?
Petunjuk lain dari keterlibatan yang mungkin dari Z-DNA meregulasi ekspresi gen
adalah struktur dari beberapa protein regulator yang diusulkan bahwa mereka
dapat berikatan pada lekukan utama left-handed double helix, tetapi bukan righthanded double helix. Faktanya, D.B. McKay dan T.A. Steitz telah mengusulkan
katabolit protein activator menstabilkan CAP-binding sequence pada konformasi
left-handed. Usulan lebih lanjut bahwa transisi right-handed ke left-handed pada
double helix melepaskan promoter atau RNA polymerase binding site yang
bersebelahan kemudian mengaktivasi teranskripsi dari gen structural yang
berdekatan. Protein repressor bisa jadi berperan pada arah yang berlawanan yaitu
menstabilkan sekuen regulator pada right-handed B-form dan mencegah
transkripsi. Fungsinya masih belum diketahui, Z-DNA-spesifik binding protein
telah diisolasi dari Drosohila. Ketika sekuen purin-pirimidin yang berseling
membentuk komplek dengan histon, sekuen ini tidak menampilkan transisi BDNA ke Z-DNA. Observasi ini dan lainnya mengusulkan bahwa sekuen Z-DNA
harus distabilkan oleh Z-DNA spesifik binding protein, dan sekuen Z-DNA tidak
dapat ditemukan di nukleosom. Indikasi sensitivitas nuklease B-DNA ke Z-DNA
junction dispekulasikan bahwa junction kemungkinan berhubungan dengan
tempat yang sensitive terhadap nuklease dekat daerah promoter dari gen yang
aktif melakukan transkripsi.
Transisi dari sekuen DNA di pada B-conformation menjadi sekuen dengan Zconformation telah ditunjukkan pada plasmid individual, arti biologis dari transisi
tersebut masih belum diketahui. Eksperimen dirancang untuk menguji
kemungkinan
1. Transisi dari B-form dan Z-form pada DNA melibatkan regulasi ekspresi
gen

2. Protein regulator mungkin bertindak dengan berikatan dan menstabilkan

satu atau yang lain dari konformasi ini mungkin memimpin beberapa
perkembangan yang menggembirakan selama beberapa tahun kedepan.

Struktur kromatin: tempat sensitif nuklease yang berdekatan dengan gen aktif
Penelitian nuclease digestion gen aktif transkripsional dan kromatin
menunjukkan bahwa gen yang ditranskrip dibungkus kedalam nucleosome
menampilkan frekuensi dan jarak yang sama sebagai nucleosome yang
mengandung DNA yang gennya tidak akan ditranskripsikan. Akan tetapi,
struktur nucleosome yang mengandung gen aktif tidak identic dengan
nucleosome yang mengandung gen inaktif. Hal tersebut ditunjukkan dengan
peningkatan sensitivitas nuklease dari gen aktif transkripsional.
Pada tahun 1976, M.Groudine dan H. Wintraub menunjukkan bahwa gen
hemoglobin terdapat dalam kromatin dari sel darah merah ayam berusia 18
hari lebih sensitive untuk degradasi oleh pancreatic deoxyriboniclease I
(DNase I) dibandingkan gen ovalbumin (tidak diekspresikan pada sel darah
merah) pada kromatin dari sel yang sama atau gen hemoglobin pada kromatin
yang diisolasi dari fibroblast atau sel otak dari ayam yang sama. Eksperimen
ini selesai dengan menggunkaan globin dan ovalbumin cDNAs (sekuen DNA
yang disintesis secara in vitro dengan reverse transcriptase menggunkaan
mRNAs globin dan ovalbumin yang dimurnikan sebagai template, sebagai
penyelidikan hibridisasi untuk mengukur kuantitas sekuen gen globin dan
ovalbumin pada kromatin yang diisolasi sebelum dan setelah partial digestion
dengan DNase. Pada eksperimen ini, lebih dari 50 persen sekuen DNA dari
gen aktif transkripsional telah didegradasi saat hanya 10 persen dari DNA total
telah dihidrolisis oleh DNase I.
Penelitian yang selanjutnya mendemonstrasikan sensitivitas nuklease dari gen
aktif transkripsional pada beberapa organisme lain. Aensitivitas nukease dari
gen aktif transkripsional telah ditemukan tergantung kehadiran protein
kromosomal nonhiston yang disebut HMG14 dan HMG17 (HMG untuk grup
dengan mobilitas tinggi, yaitu protein kecil dengan mobilitas tinggi selama
polyacrylamide gel electrophoresis). Ketika protein ini dihilangkan dari
kromatin aktif, sensitivitas nuklease hilang. Ketika ditambahkan kembali,
sensitivitasnya kembali.
Ketika kromatin yang diisolasi mengandung gen aktif transkripsional
diperlakukan dengan konsentrasi sangat rendah DNase I, molekul DNA
membelah pada beberapa tempat spesifik. Beberapa tempat yang
hypersensitive ditunjukkan berada upstream (berdekatan dengan ujung gen
homolog ke ujung 5 mRNA) dari gen aktif transkripsional. Pada beberapa
kasus, tempat hypersensitive ini ditunjukkan terletak dikanan ujung upstream
dari promoter gen yang ditranskrip. Pada kasus lain, tempat hypersensitive
nampaknya teletak pada enhancer.

Pada kasus gen globin ayam yang aktif, tempat hypersensitive dipecah oleh S1
nuclease yang merupakan endonuclease (diisolasi dari Aspergillus) yang
spesifik untuk DNA unting tunggal. Hal ini mengusulkan bahwa DNA
pasangan basa yang tepat atau memiliki beberapa modifikasi structural lain
(B-DNA ke Z-DNA junction?) pada temat hypersensitive ini, sangat mungkin
pada penyiapan pengikatan RNA polymerase pada promoter.