PENUNTUN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
MIKROBIOLOGI UMUM
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
N
PURWOKERTO
2008
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2015
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, kami panjatkan rasa syukur kepada Allah SWT karena
hanya dengan taufiq dan hidayahNya sehingga penyusunan Penuntun Praktikum
Mikrobiologi ini telah terselesaikan dan kini dapat dipergunakan. Kami sangat
menyadari bahwa penuntun ini masih sangat jauh dari kesempurnaan, sehingga
kepada para pengguna/pembaca yang arif, sangat diharapkan saran-saran yang
konstruktif demi kesempurnaan tulisan berikutnya.
Penyelesaian penuntun ini tak lepas dari peran serta berbagai pihak.
Kepada pihak yang telah membantu proses penyusunan penuntun ini yang
kesemuanya tidak dapat disebutkan satu persatu, kami mengucapkan banyak
terimakasih. Semoga segenap aktivitas kita bernilai ibadah di sisiNya. Amin
Tim Penyusun
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Praktikan harus telah mengenakan jas lab saat memasuki laboratorium dan
bekerja dengan peralatan di laboratorium untuk menghindari kontaminasi
dan terkena khemikalia
Dilarang keras makan, merokok dan minum di laboratorium
Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan
desinfektan
Dilarang membuang biakan sisa atau habis pakai dan pewarna sisa
disembarang tempat. Bahan tersebut harus dibuang di tempat yang telah
disediakan oleh asisten.
Laporkan segera jika terjadi kecelakaan seperti kebakaran, biakan tumpah
ada yang menelan bahan kimia, atau biakan kepada asisten
Jika menggunakan jarum inokulum, ujung jarum dibakar sampai memijar
sesudah dan sebelum bekerja menggunakan alat ini
Sebelum meninggalkan laboratorium disarankan untuk mencuci tangan
dengan seksama.
ii
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ............................................................................................. i
TATA TERTIB PRAKTIKUM .............................................................................. ii
DAFTAR ISI..iii
PENGENALAN ALAT .......................................................................................... 1
MEDIA PERTUMBUHAN .................................................................................. 13
STERILISASI ....................................................................................................... 19
ISOLASI MIKROBA ........................................................................................... 30
MORFOLOGI MIKROBA ................................................................................... 37
FAKTOR LINGKUNGAN YANG BERPENGARUH........................................ 54
TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROORGANISME .................................... 54
ANALISA COLIFORM BERDASARKAN NILAI MPN ................................... 58
ANALISA Staphylococcus aureus PADA BAHAN PANGAN .......................... 63
UJI BIOKIMIA (UJI IMVIC) ............................................................................... 66
DAYA KERJA ANTIMIKROBA DAN OLIGODINAMIK ............................... 71
AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME ............................................. 75
PENGUKURAN KADAR PROTEIN MIKROBA .............................................. 82
ISOLASI BAKTERIOFAGE................................................................................ 83
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 84
LAMPIRAN .......................................................................................................... 85
iii
PENGENALAN ALAT
A. Kompetensi : mahasiswa mengenal dan mengetahui fungsi dari tiap-tiap alat
Berikut daftar alat-alat mikrobiologi yang perlu dikenal:
Alat-alat elektrik
Mikroskop cahaya
Mikroskop stereo
Autoklaf elektrik
Incubator
Hot plate & stirrer
Colony counter
Biological Safety Cabinet (BSC)
Mikropipet
Alat-alat gelas dan keramik
Cawan Petri
Pipet ukur
Pipet tetes
Tabung reaksi
Labu Erlenmeyer
Glass beads
Mortar & pestle
Beaker glass
Buncen burner
Gelas ukur
Batang L / Drugalsky
Tabung durham
Alat-alat non gelas
Jarum inokulum / ose
Pinset
Rubber bulb
pH meter universal
B. Dasar Teori
Mikroskop Cahaya (Brightfield Microscope)
Salah satu alat untuk melihat sel mikroorganisme adalah mikroskop
cahaya. Dengan mikroskop kita dapat mengamati sel bakteri yang tidak dapat
dilihat dengan mata telanjang. Pada umumnya mata tidak mampu membedakan
benda dengan diameter lebih kecil dari 0,1 mm. berikut merupakan uraian
tentang cara penggunaan bagian-bagiandan spesifikasi mikroskop cahaya merk
Olympus CH20 yang dimiliki Laboratorium Mikrobiologi.
Bagian-bagian Mikroskop:
1.
Eyepiece / oculars (lensa okuler)
Untuk memperbesar bayangan yang
dibentuk lensa objektif
2.
Revolving nosepiece (pemutar lensa objektif)
Untuk
memutar objektif
sehingga
mengubah perbesaran
3.
Observation tube (tabung pengamatan
/ tabung okuler)
4.
Stage (meja benda)
Spesimen diletakkan di sini
5.
Condenser (condenser)
Untuk mengumpulkan cahaya supaya
tertuju ke lensa objektif
6.
Objective lense (lensa objektif) Memperbesar
spesimen
7.
Brightness adjustment knob (pengatur kekuatan lampu)
Untuk memperbesar dan memperkecil cahaya lampu
8.
Main switch (tombol on-off)
9.
Diopter adjustmet ring (cincin pengatur diopter)
Untuk menyamakan focus antara mata kanan dan kiri
10. Interpupillar distance adjustment knob (pengatur jarak interpupillar)
11. Specimen holder (penjepit spesimen)
12. Illuminator (sumber cahaya)
13. Vertical feed knob (sekrup pengatur vertikal)
Untuk menaikkan atau menurunkan objectglass
14. Horizontal feed knob (sekrup pengatur horizontal) Untuk menggeser ke
kanan / kiri objek glas
15. Coarse focus knob (sekrup fokus kasar)
Menaik turunkan meja benda (untuk mencari fokus) secara kasar dan cepat
16.
17.
18.
Prosedur Operasi
1. Menyalakan lampu
a. tekan tombol on (8)
b. atur kekuatan lampu dengan memutar bagian (7)
2. Menempatkan spesimen pada meja benda
a. Letakan objek glas diatas meja benda (4) kemudian jepit dengan (11). Jika
meja benda belum turun, diturunkan dengan sekrup kasar (15)
b. Cari bagian dari objek glas yang terdapat preparat ulas (dicari dan
diperkirakan memiliki gambar yang jelas) dengan memutar sekrup
vertikal dan horizontal (13) dan (14)
3. Memfokuskan
a. Putar Revolving nosepiece (2) pada perbesaran objektif 4x
lalu putar sekrup kasar (15) sehingga meja benda bergerak
ke atas untuk mencari fokus
b. Setelah fokus perbesaran 4 x 10 didapatkan, maka putar (2)
pada perbesaran selanjutnya yaitu perbesaran objektif 10x.
kemudian putar sekrup halus (16) untuk mendapatkan
fokusnya
c. Lakukan hal yang sama jika menggunakan perbesaran yang lebih tinggi
Berikut adalah tabel yang menunjukan jarak antara spesimen dengan lensa
objektif jika okus telah didapatkan
Perbesaran objektif
4x
Jarak
29
A (mm)
10x
6,3
40x
60x
0,53
0,29
Catatan: Setelah mendapatkkan fokus pada perbesaran tetentu, misal 40x, dan
ingin memutar objektif ke perbesaran 100x, maka meja benda tidak perlu
diturunkan dan tidak perlu khawatir bahwa lensa objektif akan menggesek
cover glass karena terdapat sisa jarak A yang lebih kecil antara cover glass
dengan lensa objektif (lihat tabel diatas).
Tambahan
a.
Jika perlu interpupillar distance adjustment knob (10) dapat digeser, hal ini
akan mengubah dua bayangan yang akan diterima oleh 2 mata menjadi
gambar yang tunggal sehingga sangat membantu dalam mengatasi kelelahan
mata
b.
c.
Jika perlu diopter adjustment knob (9) dapat diatur untuk memperoleh
bayangan focus yang seimbang antara mata kanan dan kiri
Pengaturan condenser (5) akan memperjelas bayangan yang tampak dengan
mensetting pada posisi tertinggi (cahaya penuh)
Perbesaran total
Ukuran specimen yang diamati dapat diperoleh dengan mengalikan
perbesaran lensa okuler dengan lensa objektif. Misal = Okuler (10x) x Objektif
(40x) = 400x
Penggunaan minyak imersi
Semakin kecil nilai daya pisah, akan semakin kuat kemampuan lensa
untuk memisahkan dua titikyang berdekatan pada preparat sehingga struktur
benda terlihat lebih jelas. Daya pisah dapat diperkuat dengan memperbesarkan
indeks bias atau menggunakan cahaya yang memiliki panjang gelombang ()
pendek. Biasanya dapat digunakan minyak imersi untuk meningkatkan indeks
bias pada perbesaran 10 x 100
a. Jika fokus pada perbesaran 10 x 40 telah didapatkan maka putar ke
perbesaran objektif 100x
b. tetesi minyak imersi 1 2 tetes dari sisi lensa
c. Jika telah selesai menggunakan mikroskop, bersihkan lensa objektif 100x
dengan kertas lensa yang dibasahi xilol
Objektif
total
0,67 x
6,7 x
0,9 x
9x
1x
10 x
2x
20 x
4x
40 x
10 x
Autoklaf (Autoclave)
Diagram autoklaf vertical
1.
Tombol
pengaturwaktu
mundur (timer)
2.
Katup pengeluaran uap
3.
pengukur tekanan
4.
kelep pengaman
5.
Tombol on-off
6.
Termometer
7.
Lempeng sumber panas
8.
Aquades (dH2O)
9.
Sekrup pengaman
10.
batas penambahan air
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan
yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan
suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi
yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.
Cara Penggunaan :
Mikropipet
tip
Cara Penggunaan :
1. Sebelum digunakan Thumb Knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk
memastikan lancarnya mikropipet.
2. Masukkan Tip bersih ke dalam Nozzle / ujung mikropipet.
3. Tekan Thumb Knob sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan
lebih ke dalam lagi.
4. Masukkan tip ke dalam cairan sedalam 3-4 mm.
5. Tahan pipet dalam posisi vertikal kemudian lepaskan tekanan dari Thumb
Knob maka cairan akan masuk ke tip.
6. Pindahkan ujung tip ke tempat penampung yang diinginkan.
7. Tekan Thumb Knob sampai hambatan kedua / second stop atau tekan
semaksimal mungkin maka semua cairan akan keluar dari ujung tip.
8. Jika ingin melepas tip putar Thumb Knob searah jarum jam dan ditekan
maka tip akan terdorong keluar dengan sendirinya, atau menggunakan alat
tambahan yang berfungsi mendorong tip keluar.
Cawan Petri (Petri Dish)
Cawan petri berfungsi untuk membiakkan (kultivasi)
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian
bawah dan cawan bagian atas sebagai penutup. Cawan petri
tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan
yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media
sebanyak 15-20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm
kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml.
)
Batang L (L rod)
Batang L bermanfaat untuk menyebarkan cairan di permukaan agar supaya
bakteri yang tersuspensi dalam cairan tersebut tersebar merata. Alat ini juga
disebut spreader.
Beaker Glass
Beaker glass merupakan alat yang memiliki banyak
fungsi. Di dalam mikrobiologi, dapat digunakan untuk preparasi
media media, menampung akuades dll..
Pembakar Bunsen (Bunsen Burner)
Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi
yang steril adalah pembakar bunsen. Api yang menyala dapat
membuat aliran udara karena oksigen dikonsumsi dari bawah dan
diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola aliran udara
tersebut. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api
yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang
10
berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar
gas atau metanol
.
Glass Beads
GlassBeads adalah manik-manik gelas kecil yang digunakan untuk
meratakan suspensi biakan dengan menyebarkan beberapa butir di atas permukaan
agar dan digoyang merata. Glass beads digunakan pada teknik spread plate yang
fungsinya sama dengan batang L atau Spreader.
Tabung Durham
Tabung durham berbentuk mirip dengan tabung reaksi namun ukurannya
lebih kecil dan berfungsi untuk menampung/menjebak gas yang terbentuk akibat
metabolisme pada bakteri yang diujikan. Penempatannya terbalik dalam tabung
reaksi dan harus terendam sempurna dalam media (jangan sampai ada sisa udara).
Jarum Inokulum
Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan
untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum
biasanya terbuat dari kawat nichrome atau platinum sehingga
dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat
berbentuk lingkaran (loop) dan disebut ose atau inoculating
loop/transfer loop, dan yang berbentuk lurus disebut inoculating
needle/Transfer needle. Inoculating loop cocok untuk melakukan
streak di permukaan agar, sedangkan inoculating needle cocok
digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (stab
inoculating). Jarum inokulum ini akan sangat bermanfaat saat
membelah agar untuk preprasi Heinrichs Slide Culture.
Pinset
Pinset memiliki banyak fungsi diantaranya adalah untuk mengambil benda
dengan menjepit misalnya saat memindahkan cakram antibiotik.
pH Indikator Universal
Berguna untuk mengukur/mengetahui pH suatu larutan. Hal ini
sangat penting dalam pembuatan media karena pH pada media
berpengaruh terhadap petumbuhan mikroba. Kertas pH indikator
dicelupkan sampai tidak ada perubahan warna kemudian strip warna
dicocokkan dengan skala warna acuan.
Pipet Filler / Rubber Bulb
Filler adalah alat untuk menyedot larutan yang dapat dipasang pada
pangkal pipet ukur. Karet sebagai bahan filler merupakan karet yang resisten
bahan kimia. Filler memiliki 3 saluran yang masing-masing saluran memiliki
katup. Katup yang bersimbol A (aspirate) berguna untuk mengeluarkan udara dari
gelembung. S (suction) merupakan katup yang jika ditekan maka cairan dari
11
12
MEDIA PERTUMBUHAN
A. Kompetensi : Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan Nutrient Agar
dan Potato Dextrose Agar
Media pertumbuhan :
a. Pengertian dan fungsi
b. Bahan-bahan media pertumbuhan
b.1 Bahan dasar
b.2 Nutrisi atau zat makanan
b.3 Bahan tambahan
b.4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
c. Macam-macam media pertumbuhan
c.1 Berdasarkan sifat fisik
c.2 Berdasarkan komposisi
c.3 Berdasarkan tujuan
d. Pembuatan NutrientAgar dan NutrientBroth
e. Pembuatan PotatoDextroseAgar
Dasar Teori
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan
juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Bahan-bahan media pertumbuhan
1.
Bahan dasar
air (H2O) sebagai pelarut
agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar
sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada
suhu 45 C.
gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah
polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya
adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya
dibanding agar.
Silicagel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga
sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan
media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2.
Nutrisi atau zat makanan
13
14
3.
15
16
17
Setelah
semua larut, ekstrak kentang
dan
agardekstrosa dicampur dan dihomogenkan. Atur pH media menjadi
5-6 dengan meneteskan HCl/NaOH.
Media
dituang
ke
dalam Erlenmeyer atau ke
tabung reaksi kemudian siap untuk disterilisasi.
18
STERILISASI
Kompetensi : mahasiswa mengetahui sterilisasi dengan autoklaf, filtrasi,
tyndalisasi mahasiswa dapat melakukan kerja aseptis
Sterilisasi :
1. Pengertian sterilisasi
2. Macam-macam sterilisasi
a. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)
b. Sterilisasi secara fisik
Pemanasan
- Dengan api langsung
- Panas kering
- Uap air panas
- Uap air panas bertekanan
Penyinaran UV
c. Sterilisasi secara kimia dengan larutan disinfektan
3. Prosedur/Teknik aseptis
a. Mensterilkan meja kerja
b. Memindahkan biakan (streak)
c. Menuang media
d. Pipetting
4. Prinsip cara kerja autoklaf
5. Sterilisasi dengan cara penyaringan
6. Tyndalisasi
7. Sterilisasi dengan udara panas
8. Prinsip kerja Biological Safety Cabinet
Dasar Teori
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau
benda dari semua bentuk kehidupan.
Macam-macam sterilisasi
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara
mekanik, fisik dan kimiawi.
1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang
berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) sehingga mikroba
tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan
yang peka panas, misal nya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
Pemanasan
19
20
21
22
23
24
25
26
Spin filters
- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml
Tyndalisasi
Konsep kerja metode ini merip dengan mengukus. Bahan yang
mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan
dengan metode ini. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan
mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan
pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.
27
Cara kerja :
Bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer atau botol dan ditutup rapat
dengan sumbat atau aluminium foil.
Erlenmeyer/botol lalu dimasukkan kedalam alat sterilisasi (alat standar
menggunakan Arnold Steam Sterilizen atau dandang).
Nyalakan sumber panas dan tunggu hingga termometer menunjukkan suhu
1000C kemudian hitung waktu mundur hingga 30 menit (uap panas yang
terbentuk akan mematikan mikroba).
Setelah selesai alat sterilisasi dimatikan dan bahan yang steril dikeluarkan.
Setelah 24 jam, bahan tersebut di sterilkan lagi dengan cara yang sama,
sedang waktu ini dimaksudkan untuk memberi kesempatan spora atau sel
vegetatif yang belum mati untuk tumbuh sehingga mudah dibunuh.
28
29
ISOLASI MIKROBA
Kompetensi: mahasiswa dapat memisahkan mikroba dari campurannya sehingga
didapat kultur murni.
Isolasi Mikroorganisme:
a. Pengertian
b. Teknik Pengambilan sample
c. Isolasi dengan cara pengenceran
1) Teknik preparasi suspensi
Swab
Rinse
Maserasi
2) Teknik pengenceran bertingkat
3) Teknik penanaman
Dari suspensi (spread dan pour plate)
Dengan goresan (streak dan quadrant streak inoculation)
d. Prosedur isolasi bakteri dari sampel
e. Prosedur isolasi jamur dari sampel
A. Dasar Teori
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi
terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri
inidapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat
dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
B. Alat dan Bahan
Tabung reaksi
Cawan Petri
Oven
Inkubator
Vortex
Tanah gembur
Air sungai/Air danau/Air kanal
Media NA
Media PDA
Aqauades
Streptomicyn/penicillin/kloramfenikol
30
C. Cara Kerja
Teknik Pengambilan Sampel
Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan
sampel.
Berikut merupakan prosedur pengambilan sampel.
1.
Sampel tanah
Jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam
tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan.
Misal jika yang diinginkan mikroorganisma rhizosfer maka sampel diambil dari
sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran..
2.
Sampel air
Pengambilan sampel air bergantung kepada keadaan air itu sendiri. Jika
beerasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir
botol melawan arus air. Bila pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang,
botol dapat dicelupkan dengan tali, jika ingin mengambil sampel dari air keran
maka sebelumya keran dialirkan dulu beberapa saat dan mulut kran dibakar.
31
perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti,
artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika
memindahkan cairan dari sumber yang sama.
3. Teknik Penanaman
a.
Teknik penanaman dari suspensi
Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat.
Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya
untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung
pengenceran terakhir.
a.1. Spread Plate (agar tabur ulas)
Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi
bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni. Adapun prosedur kerja yang
dapat dilakukan adalah sebagai berikut :
Ambil suspensi cairan senamyak 0,1 ml dengan pipet ukur kemudian
teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. Batang L atau batang
drugal diambil kemudian disemprot alkohol dan dibakar diatas bunsen
beberapa saat, kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa detik.
Kemudian disebarkan dengan menggosokannya pada permukaan agar
supaya tetesan suspensi merata, penyebaran akan lebih efektif bila cawan
ikut diputar.
Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang terlalu panas dapat
menyebabkan sel-sel mikroorganisme dapat mati karena panas.
33
b.
b.2 Goresan T
Cara kerja :
35
36
1. Preparasi Sampel
Sampel alga yang telah dikumpulkan kemudian dibersihkan dari kotoran yang
menempel dan disimpan dalam cool box. Selanjutnya sampel disegarkan
dalam media Nutrient Broth.
a. Bagian permukaan alga
Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 mL NaCl fisiologis.
Selanjutnya air bilasan dimasukkan ke dalam 30 mL media nutrient
broth lalu dikocok menggunakan shaker pada suhu kamar selama 24-48
jam.
b. Bagian dalam alga
Sebanyak 15 gram sampel alga dibilas dengan 30 mL NaCl fisiologis.
Selanjutnya, alga yang telah dibilas dihaluskan dengan menggunakan
blender dan ditambahkan NaCl fisiologis. Suspensi kemudian
dimasukkan ke dalam 30 mL media nutrient broth lalu dikocok
menggunakan shaker pada suhu kamar selama 24-48 jam.
Masing-masing sampel pada bagian permukaan dan bagian dalam
alga diambil sebanyak 1 mL dan dilakukan pengenceran bertingkat untuk
memperoleh pengenceran yang sesuai. Selanjutnya sebanyak 0,1 mL dari
pengenceran tersebut disebarkan ke dalam medium agar dan ditumbuhkan
selama 24 jam. Pemurnian bakteri dilakukan dengan menumbuhkan koloni
bakteri yang berbeda-beda dari kultur sebelumnya ke dalam cawan petri yang
mengandung media selektif M-9 produksi L Aspraginase yang telah
dimodifikasi dengan komposisi KH2PO4 0,75 g/L, L Asparagin 10 g/L,
NaCl 0,5 /L, MgSO4.7H2O 1,0 g/L, CaCl2.2H2O 1,0 g/L, gukosa 3 g/L, agar
20 g/L, dan indikator fenol merah 0,05 g/L. (Moorthy, 2010, dan Ghasemi,
2008). Larutan stok fenol merah dibuat 2,5 % dalam etanol pH 7 lalu
ditambahkan ke dalam medium. Medium disterilkan dalam autoclave selama
15 menit pada suhu 1210C tekanan 1 atm. Diinkubasi selama 24 jam pada
suhu 37 oC. Pada medium ini L Asparagin digunakan sebagai sumber
nitrogen. Produksi L Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak
sehingga meningkatkan pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk
warna pink disekitar koloni yang memproduksi L Asparaginase (Gashemi,
dkk., 2008).
37
MORFOLOGI MIKROBA
Kompetensi : mahasiswa dapat mengenali bentuk dan morfologi sel dan koloni
mikroorganisme
a. Bakteri
a.1 mengamati morfologi koloni bakteri
a.1.1 pada media cawan
a.1.2 pada agar miring
a.1.3 pada agar tegak
a.1.4 pada media cair
a.2 mengamati morfologi sel bakteri
a.2.1 dengan pewarnaan sederhana
a.2.2 dengan pewarnaan negatif
a.2.3 dengan pewarnaan gram
a.2.4 dengan pewarnaan endospora
a.3 mengamati motilitas bakteri
a.3.1 pengamatan langsung
a.3.2 pengamatan tidak langsung
b. Yeast
b.1 mengamati morfologi koloni yeast (pada agar cawan)
b.2 mengamati morfologi sel yeast (dengan pewarnaan sederhana)
c. Kapang
c.1 mengamati morfologi koloni kapang (pada agar cawan)
c.2 mengamati morfologi sel kapang (dengan metode slideculture)
A. Dasar Teori
Pengamatan Morfologi mikroba merupakan tindakan pertama kali jika
ingin mempelajari suatu jenis bakteri lebih lanjut, khususnya untuk tujuan
identifikasi. Setelah mendapatkan kultur murni maka biakan yang diinginkan
ditumbuhkan ke berbagai bentuk media untuk dikenali ciri koloninya. Ciri koloni
yang diamati berupa ukuran, pigmentasi, bentuk tepi, elevasi dan pertumbuhan
pada media cair.
B. Alat dan Bahan
Isolat Bakteri
Media Nutrient Agar miring dan tegak
Media Nutrient Broth
Reagen Pewarnaan Gram
Malachite Green
Mikroskop
Jarum Inokulas
Kaca Preparat
Pipet Tetes
38
C. Prosedur Kerja
1. Pengamatan Morfologi koloni Bakteri
Cara Kerja :
Tumbuhkan biakan pada media NA cawan dengan streak kuadran
Tumbuhkan biakan pada media NA miring dengan pola inokulasi yang
tegak lurus
Tumbuhkan biakan pada media NA tegak dengan stabinoculation
Tumbuhkan biakan pada media NB
Amati ciri-ciri pertumbuhan koloni yang tumbuh.
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :
Pertumbuhan pada Cawan Petri
Ukuran:
pinpoint/punctiform (titik)
Small (kecil)
Moderate (sedang)
Large (besar)
Flat
Irregular
Raised
Spindle
Convex
Filamentous
Umbonate
Rhizoid
39
Permukaan :
Halus mengkilap
Kasar
Berkerut
Kering seperti bubuk
Margin
koloni berdasar
O2
Ciri
Pertumbuhan
padakebutuhan
Agar Tegak
dengan
needle
40
pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel
bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna
dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan
sekelilingnya ditingkatkan.
Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa,
bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan
mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada
permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue,
Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara
lain Eosin, Congo Red dll.
Pewarnaan
Pewarnaan sederhana
pewarnaan positif
pewarnaan negatif
Pewarnaan diferensial
Pewarnaa Gram
pewarnaan acid fast dll.
Pewarnaan khusus
pewarnaan endospora
pewarnaan flagella dll.
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif)
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass
yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu
padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat
mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri
dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya.
Cara Kerja :
Bersihkan object glass dengan kapas
Jika perlu tulislah kode atau nama bakteri pada sudut object glass
Bila menggunakan biakan cair maka pindahkan setetes biakan dengan
pipet tetes atau dapat juga dipindahkan dengan jarum inokulum. Jangan
lupa biakan dikocok terlebih dahulu. Jika digunakan biakan padat, maka
biakan dipindahkan dengan jarum inokulum, satu ulasan saja kemudian
diberi akuades dan disebarkan supaya sel merata.
Keringkan ulasan tersebut sambil memfiksasinya dengan api bunsen
(lewatkan di atas api 2-3 kali)
42
Pewarnaan Negatif
Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat
dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar
belakang hitam.
Cara Kerja:
Ambil dua object glass, teteskan nigrosin atau tinta cina di ujung kanan
salah satu object glass
Biakan diambil lalu diulaskan atau diteteskan dalam tetesan nigrosin tadi,
lalu dicampurkan
Tempelkan sisi object glass yang lain kemudian gesekkan ke samping kiri
Biarkan preparat mengering di udara, jangan difiksasi atau dipanaskan di
atas api.
43
Contoh jenis
Coccus (sphere)
Coccobacilli
Moraxella, Acinetobacter
Vibrio (curved)
Bacillus
Helical (spirillum)
Diplococcus
Neisseria, Moraxela
Streptococcus
Streptococcus
Streptobacillus
Bacillus, Mycobacterium
Staphylococcus
Staphylococcus
Tetrad (Gaffkya)
Sarcina (cuboidpackets)
Sarcina
44
Pewarnaan Gram
Adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak
digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif
mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.Berikut
merupakan prosedur pewarnaan Gram:
Cara Kerja :
Dampak/Hasil
1.Buat preparat ulas (smear) yang telah Sel bakteri tertempel pada permukaan kaca
difiksasi dari bakteri gram positif (object glas)
misal Bacillus subtilis dan gram
negatif misal Escherichia coli
2.Teteskan kristal violet sebagai Kristal ungu akan mewarnai seluruh permukaan
pewarna utama pada kedua preparat , sel bakteri gram positif dan negatif
usahakan semua ulasan terwarnai dan
tunggu selama 1 menit
3.Cuci dengan akuades mengalir
4.Teteskan mordant (lugol,s iodine) Adanya lugols iodine menyebabkan adanya
ikatan CV dengan iodine yang akan
lalu tunggu 1 menit
meningkatkan afinitas pengikatan zat warna
oleh bakteri. Pada gram
positif dapat terbentuk CV iodinribonukleat
pada dinding sel
5.Cuci dengan akuades mengalir
45
Penetesan
etanol
absolut
menyebabkan
terbentuknya pori-pori pada gram negatif yang
memiliki banyak lapisn lemak (lipid larut dalam
etanol), sehingga komplek CV-iodine akan lepas
dari permukaan sel gram negatif, sedangkan
pada gram positif CV-iodine tetap menempel di
dinding sel, sel gram negatif menjadi bening
46
Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi
yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan
sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga
sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai
terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak
akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif
seperti gram positif.
Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda
yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada
kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram
positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel,
sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel
seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora
Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah
bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat
inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering,
dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora
adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya
tampak jelas.
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa
pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun
jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan
inklusi (keduaduanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan
teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan prosedur pewarnaan endospora
dengan metode Schaeffer-Fulton.
47
Cara Kerja :
Dampak/Hasil
1.Buat preparat ulas dari Bacillus subtilis Sel bakteri menempel pada permukaan
lalu tutup dengan kertas merang
objectglass
2.Tetesi ulasan pada object glass dengan
Malachite green di atas kertas merang.
Letakan di atas air yang mendidih.
Biarkan 5 menit. Dijaga jangan sampai
kering. Jika bagian pinggir mulai
mengering, tambahkan lagi Malachite
Green.
3.Setelah dingin, bilas object glass dengan Air digunakan sebagai agen dekolorasi sel.
akuades mengalir
Setelah perlakuan di atas Malachite green
tidak melekat kuat dengan sel vegetatif.
Pembilasan dengan akuades akan
melunturkan Malachite green pada sel
vegetatif
4.Tetesi dengan safranin sebagai
counter stain, diamkan selama + 45
detik
48
Penambahan safranin
49
Yeast / Khamir
A. Dasar Teori
Yeast merupakan fungi mikroskopik uniseluler, tidak membentuk hifa
(beberapa spesies dapat membentuk pseudohifa). Bentuk selnya bervariasi dapat
berbentuk bulat, bulat telur, bulat memanjang dengan ukuran 1-9x20 m.
Beberapa spesies yeast memiliki sifat dimorfisme yaitu bentuk sel tunggal dan
bentuk hifa atau pseudohifa. Pseudohifa adalah hifa yeast yang terbentuk dari
rangkaian sel hasil pembelahan aseksual secara budding, tetapi tidak melepaskan
diri dari induk. Morfologi internal sel mudah dilihat dan terdiri dari inti dan
organel seperti mitkondria, grannula lemak dan glikogen.
50
Kapang / Jamur
Jamur merupakan mikroba dengan struktur talus berupa benang-benang
(hifa) yang terjalin seperti jala (myselium). Hifa dapat berekat (septat) dengan
inti tunggal/ lebih dan hifa tidak bersekat (aseptat). Penampakan morfologi
koloni pada umumnya seperti benang (filamentous) yang pertumbuhannya
membentuk lingkaran. Morfologi koloninya dapat dengan mudah dibedakan
dengan bakteri walaupun ada beberapa jenis bakteri yang koloninya mirip
jamur, seperti dari kelompok Actinomycetes atau Bacillus mycoides. Koloni
kapang memiliki keragaman warna yang muncul dari sporanya.
51
52
B. 2 Metode Riddel
cara kerja :
Persiapan sama seperti di atas
Setelah semua steril, potong media Saboraud Dextrose Agar steril
berbentuk kubus dan letakkan di atas object glass.
Inokulasikan spora jamur pada bagian atau potongan agar.
Tutup potongan agar dengan cover glass.
Inkubasi pada suhu kamar selama 3x24 jam.
Ambil preparat dan diamati di bawah mikroskop.
53
54
a.
b.
c.
d.
Faktor lingkungan :
pengaruh suhu terhadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh tekanan osmotik terhadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh sinar ultraviolet tehadap pertumbuhan mikroorganisme
pengaruh pH terhadap pertumbuhan mikroorganisme
Tabung reaksi
Inkubator
C. Cara Kerja :
8x2 tabung yang berisi Nutrient Broth untuk suhu inkubasi 50C, 250C,
370C, dan 500C dan mikroorganisma yang berbeda (E.coli dan Bacillus
sp.) diberi label . Setelah diinokulasi dengan bekteri yang berbeda,
diinkubasi sesuai suhu yang tertera
setelah ditumbuhkan selama 48 jam, bandingkan derajat kekeruhannya.
55
Tabung reaksi
Inkubator
C.Cara Kerja:
Buat 4 buah cawan NutrientAgar
yang mengandung NaCl 0,5%, 3%,
5% dan 15%.
Setiap konsentrasi, cawan dibagi
menjadi 2 dengan spidol kemudian
labeli dengan bakteri E.coli dan
Bacillus sp.
Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp.
dengan streak kontinyu
Gunakan kontrol untuk masingmasing biakan dengan media yang
tidak ditambahi NaCl.
Inkubasi selama 48 jam dan amati
pertumbuhannya
Lampu UV
Inkubator
56
C. Cara Kerja:
Inokulasikan Aspergillus sp., E.coli dan Bacillus sp. pada 3 cawan NA.
Dedahkan ketiga cawan tersebut pada sinar UV dengan panjang 254 nm
selama 1 menit, 5 menit, dan 15 menit (ingat tutup cawan dibuka dan
diusahakan lingkungan sekitar steril). Jarak antar UV dan cawan sekitar 12
inchi
Gunakan kontrol untuk masing-masing biakan dengan tidak memaparkan
pada sinar UV
Inkubasi selama 48 jam dan amati pertumbuhan koloninya
57
58
A. Dasar teori
MPN (Most Probable Number) atau angka perkiraan terdekat merupakan suatu cara
untuk menganalisa bakteri golongan coli yang memiliki kemampuan memfermentasi
laktosa dan menghasilkan gas, yang merupakan parameter pencemaran suatu sampel air.
Analisisi MPN coliform berlangsung dalam tiga tahap utama, yaitu uji penduga
(Presumtive Test), uji penguat (Corfirmed Test) dan uji kepastian atau pelengkap
(Complete Test).
Uji penduga dilakukan untuk mendeteksi bakteri koliform yang teramat kecil
porsinya dalam air terutama untuk air minum kemasan maupun bahan pangan lainnya.
Nilai MPN yang ditunjukkan berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif tersebut
tidak menunjukkan konsentrasi yang sebenarnya, namun berlaku sebagai penunjuk angka
bakteri koliform dengan derajat kepercayaan (level of significant) dalam arti statistik
sebesar 95%.
Uji penguat atau penegas dilakukan agar uji positif pada uji penduga dapat lebih
tegas menunjukkan bahwa bakteri yang mengkontaminasi sampel air merupakan bakteri
coli fekal atau bakteri coli yang berasal dari tinja. Penentuan nilai MPN juga ditunjukkan
berdasarkan kombinasi tabung positif dan negatif yang dicocokkan dengan tabel MPN.
Tabung positif pada uji penguat, kemudian dilanjutkan dengan uji pelengkap atau
kepastian yaitu dengan menggunakan medium Mic Concey Agar (MCA). Uji ini bertujuan
untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan Escherichia coli. Dapat pula
langsung dilakukan dengan pengamatan bentuk sel, pengecatan spora pengecatan gram
pada bakteri yang tersebut.
Sampel air (air minum kantin, air isi ulang dan air mineral)
9 tabung berisi LB @ 10 ml + tabung durham
BTB (Bromtimol Blue) 10%.
Spoit 10 ml
Bunsen
Rak tabung
Kapas
Inkubator
59
b. Cara kerja :
1) Siapkan medium LB steril + BTB di dalam 9 tabung reaksi yang masing-masing telah
dimasukkan tabung durham.
2) Buat pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 dari sampel.
3) Masukkan masing-masing 1 ml dari setiap seri pengenceran ke dalam medium LB
(sudah ditetesi larutan indikator BTB).
4) Kocok dengan hati-hati hingga sampel homogen dan tutup mulut tabung reaksi dengan
kapas.
5) Inkubasi semua tabung pada suhu 37oC.
6) Pada 1 x 24 pertama, amati perubahan yang terjadi yaitu reaksi positif bila warna
medium berubah dari hijau menjadi kuning dan ada gas dalam tabung durham. Jika
belum terjadi perubahan inkubasi dilanjutkan sampai maksimal 2 x 24 jam.
didapatkan kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform
adalah 150 sel/100 ml = 1,5 x 102 sel/ml
60
61
b. Cara kerja :
1) Siapkan medium EMBA atau ENDO Agar lempeng pada cawan petri (kondisi
steril).
2) Dari tabung yang memberi reaksi positif pada uji penduga di inokulasikan atau
digores dengan cara goresan kuadran pada medium EMBA atau ENDO Agar yang
telah disiapkan di atas.
3) Inkubasi pada suhu 37oC selama 1 x 24 jam.
4) Uji positif bila terdapat koloni hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni
pada medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar.
5) Koloni bakteri pada medium lempeng tersebut kemudian dimurnikan dan disimpan
di medium agar miring.
b. Cara kerja :
1) Koloni yang berwarna hijau metalik dengan titik hitam ditengah koloni pada
medium EMBA atau koloni merah hitam metalik pada medium ENDO Agar di
inokulasikan dan disuspensikan dengan cara menginokulasikan 3 ose ke dalam 10
ml aquades steril kemudian dihomogenkan dengan dikocok perlahan.
2) Bersihkan gelas objek dengn alkohol 70 % agar bebas lemak.
3) Ambil secara aseptis 1 ose suspensi bakteri dan ratakan diatas gelas objek seluas +
1 cm2.
4) Biarkan mengering di udara, lalu fiksasi di atas api spritus.
5) Teteskan larutan Gram A sebanyak 2 tetes dan biarakan selama 2 menit.
6) Cuci dengan air mengalir, keringkan dengan kertas isap secara hati-hati.
62
63
Alat:
1. Autoclave
7. Gelas Ukur
2. Colony Counter
8. Gelas Preparat
3. Neraca analitik
9. Inkubator
4. Botol pengencer
10. Pipet
11.Water Bath
6. Cawan Petri
Bahan:
1. Ikan segar, nugget dan ayam
goreng krispi
2. Baird Parker Agar
3. Buffer Posfat
4. Brain Heart Infusion Broth
5. Parafin oil steril
6. Pereaksi katalase
7. Pereaksi pewarnaan Gram
8. Purple
Carbohydrate
(masing-masing
Broth
mengandung
64
B. Uji Koagulase
2. Pindahkan 0,2 ml 0,3 ml inokulum tersebut ke dalam tabung steril dan tambahkan
0,5 ml koagulasi plasma kemudian aduk. inkubasi dan amati setiap jam untuk 4 jam
pertama dan lanjutkan hingga 24 jam untuk melihat terbentuknya koagulan.
3. Koagulan yang terbentuk secara padat/solid an tidak jatuh apabila tabung dibalik
dinyatkan positif (reaksi 4+) Staphylococcus aureus. Koagulan yang menunjukkan
reaksi 2+ dan 3+ harus dilakukan uji tambahan.
65
C. Uji tambahan
a. Uji Katalase
1.
ambil 1 ose inokulum dari BHi broth goreskan ke dalam media TSA miring dan
inkubasi selama 18 jam 24 jam.
2.
Stelah diinkubasi ambil 1 ose inokulum dan letakkan di atas gelas preparat, tetesi
dengan H2O2 untuk melihat pembentukan gelembung-gelembung gas.
d.
66
A. Dasar Teori
Uji IMVIC merupakan cara untuk membedakan sesama mikroba yang termasuk dalam
kelompok enterobacteriaceae, dengan sasarannya adalah Escherichia coli. Pembedaan
anggota kelompok tersebut didasarkan proses biokimia dan reaksi enzimatis dari bakteri yang
menghasilkan
suatu
substrat
spesifik.
Sebagai
contoh
E.
coli
sebagai
anggota
Tryptophan
Tryptopha
Indol + asam piruvat + NH3
nase
b
ut
Uji Methyl Red dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri untuk memfermentasi
glukosa menghasilkan asam yang dapat dideteksi dengan penambahan pereaksi methyl Red
sehingga warna biakan menjadi merah. E.coli bersifat dapat memfermentasi glukosa.
Uji Voges-Proskauer dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi glukosa dengan hasil akhir berupa senyawa non asam atau senyawa netral
misalnya asetil metil karbinol. Senyawa ini, dengan penambahan KOH 40% dan larutan naftol sebagai katalisator akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna merah muda
67
(menunjukkan reaksi positif). E.coli tidak mampu menghansilkan senyawa tersebut, sehingga
hasil reaksinya negatif.
Uji Citrat dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri memanfaatkan citrat sebagai
sumber karbon tanpa adanya glukosa maupun laktosa. E.coli tidak dapat tumbuh pada media
ini, karena tidak mampu menggunakan citrat sebagai sumber karbon, sehingga warna media
tidak berubah.
A. Uji Indol
1. Tujuan: Untuk menunjukkan ada tidaknya senyawa indol yang dihasilkan oleh suatu
biakan bakteri .
2. Alat dan Bahan
a. Jarum ose
b. Biakan E.coli dan Staphylococcus
c. Medium sim (sulfit indol motility) atau tripton 1% broth
d. Reagen kovacs
3. Prosedur kerja :
a. Inokulasikan secara tusuk tegak(stab) biakan bakteri pada medium sim atau 1 ose pada
medium tripton 1% broth.
b. Biarkan satu tabung tidak diinokulasikan dan gunakan sebagai kontrol.
c. Inkubasikan pada suhu 37oc selama 48 jam.
d. Tambahkan 5 tetes (1 ml) reagen kovacs kedalam setiap tabung termasuk kontrol.
e. Kocoklah perlahan-lahan dan biarkan tabung berada dalam posisi tegak.
f. Amati permukaan medium. Terbentuknya cincin merah tua pada permukaan medium
menunjukkan indol positif. Bandingkan dengan kontrol.
68
glukosa.
2. Alat dan bahan :
a. Jarum ose
b. Biakan E.coli dan Staphylococcus
c. Medium MR-VP
d. Biakan
3. Cara kerja:
69
C. Uji Voges-proskauer
1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menghasilkan senyawa
acetyl carbinol atau 2,3 butandiol.
2. Alat dan bahan
a. Jarum ose
b. Medium MR-VP
c. Biakan E.coli dan Staphylococcus
d. Reagen barrit (-naftol 50% dan KOH 40%)
3. Cara kerja :
70
D. Uji Citrat
1. Tujuan : Untuk mengetahui kemampuan mikroba memanfaatkan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon.
a. Jarum ose
b. Media Simon Citrate Agar (SCA)
c. Biakan E.coli dan Staphylococcus
3. Cara kerja :
71
Erythromycine
Sulfadrugs
Polymyxin B
Quinolone
Tetracycline
Antifungi :
Nystatin
Azoles
Mekanisme kerja antibiotik antara lain :
Menghambat sintesis dinding sel
Merusak permeabilitas membran sel.
Menghambat sintesis RNA (proses transkripsi)
Menghambat sintesis protein (proses translasi).
Menghambat replikasi DNA.
72
Cara kerja:
Inokulasikan biakan pada Mueller-Hinton Agar dengan metode sebar
Biarkan cawan selama 5 menit
Kertas cakram dicelupkan dalam larutan antibiotik dengan konsentrasi tertentu.
Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas cakram pada
permukaan agar.
73
Cara menginterpretasikan :
Ukur diameter zona hambat (zona jernih)
Misal didapatkan zona hambat suatu bakteri berdiameter 26 mm untuk
Eryhtromycin.
Maka interpretasinya adalah bakteri tersebut peka terhadap antibiotik
Eryhtromycin.
Resistent : tahan
Intermediate : medium
Susceptible : peka
Pengujian Pengaruh Daya Oligodinamik
Logam-logam berat seperti Hg, Cu, Ag dan Pb bersifat racun terhadap sel
meskipun hanya dalam kadar rendah. Logam mengalami ionisasi dan ion-ion tersebut
bereaksi dengan bagian sulfihidril pada protein sel sehingga menyebabkan denaturasi.
Daya hambat atau mematikan dari logam dengan konsentrasi yang rendah disebut
daya oligodinamik.
Alat dan Bahan
Cawan petri
Biakan E.coli dan Staphylococcus
Kertas cakram
Media Nutrient Agar(NA)
Lempeng logam tembaga dan seng
2.
74
Cara Kerja :
Inokulasikan E.coli dan Bacillus sp. pada cawan NA dengan streak kontinyu
Letakan koin tembaga dan seng ke dalam cawan dengan pinset
Inkubasi 370C selama 48 jam
Hitung zona hambat yang terbentuk dengan mengukur diameter daerah yang jernih atau
tidak ada pertumbuhan
75
76
C. Cara Kerja :
A. Dasar Teori
Lipid misalnya trigliserida merupakan sumber energi bagi sejumlah mikroorganisma.
Untuk mendapatkan energi dari lipid, mikroba menghasilkan enzim lipase dan esterase yang
memecah ikatan ester menghasilkan gliserol dan asam lemak.
Terdapat berbagai macam prosedur untuk mengetahui aktivitas lipase diantaranya adalah
dengan menggunakan media TrybutirinAgar, RodhamineAgar dan SpiritBlueAgar. Pada
prinsipnya metode-metode di atas menggunakan indikator yang mampu mendeteksi
keberadaan asam lemak yang terbentuk akibat hidrolisis lemak.
C. Cara Kerja :
Inokulasikan Staphylococcus sp. dan E. coli pada mediaTributyrin Agar dengan indikator
neutral red
Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
77
Reaksi positif ditandai oleh bercak-bercak kuning disekeliling koloni, sedangkan reaksi
negatif ditandai oleh bercak-bercak yang tetap berwarna merah.
3. Uji proteolitik
A. Dasar Teori
Uji proteolitik ditujukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
menghasilkan enzim protease. Pada praktikum ini protein yang digunakan dalam bentuk
kasein susu. Hidrolisis kasein secara bertahap akan menghasilkan monomernya berupa asam
amino. Proses ini disebut peptonisasi atau proteolysis.
C. Cara Kerja
Inkubasi
Inokulasikan Staphylococcus sp. Dan E. coli pada Skim Milk Agar (SMA)
o
pada suhu 37 C selama 48 jam.
Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih di sekeliling koloni.
78
4. Uji Oksidase
A. Dasar Teori
Enzim oksidase memegang peranan penting dalam transport elektron selama respirasi
aerobik. Sitokrom oksidase mengkatalisis oksidasi dan reduksi sitokrom oleh molekul
oksigen. Enzim oksidase dihasilkan oleh bakteri aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofilik.
Mikroorganisme ini menggunakan oksigen, sebagai akseptor elektron terakhir selama
penguraian karbohidrat untuk menghsilkan energi. Kemampuan bakteri memproduksi
sitokrom oksidase dapat diketahui dari reaksi yang ditimbulkan setelah pemberian reagen
oksidase pada koloni bakteri. Enzim ini merupakan bagian dari kompleks enzim yang
berperan dalam proses fosforilasi oksidatif. Reagen yang digunakan adalah tetramethyl-Dphenylenediaminedihydrocloride. Reagen akan mendonorkan elektron terhadap enzim ini
sehingga akan teroksidasi membentuk senyawa yang berwarna biru kehitaman. Positif
tertunda (warna biru muncul antara 10-60 detik setelah ditetesi) menandakan bahwa bakteri
uji memiliki sedikit enzim. Tidak adanya perubahan warna mengindikasikan bahwa uji yang
dilakukan negatif.
B. Alat dan Bahan
Biakan cair E.coli dan Staphylococcus sp
Objek gelas
C. Cara Kerja :
Koloni bakteri diambil satu tetes (sebaiknya dari biakan cair) secara aseptis dan
diinokulasikan pada Objectglass.
Diatas object glass diberi kertas merang yang sehingga tetesan tersebar pada kertas.
Tetesi dengan reagen, lalu lihat perubahan yang terjadi
Jika warna berubah menjadi biru marun maka hasil uji positif, sedangkan bila tidak terjadi
perubahan maka hasil uji negatif. Hasil uji positif tertunda jika warna biru
muncul antara 10 -60 detik setelah ditetesi.
79
5.
Uji katalase
A. Dasar Teori
Selama respirasi aerobik (proses fosforilasi oksidatif), mikroorganisme
menghasilkan hidrogen peroksida, bahkan ada yang menghasilkan superoksida yang
sangat beracun. Senyawa ini dalam jumlah besar akan menyebabkan kematian pada
mikroorganisme. Senyawa ini dihasilkan oleh mikroorganisme aerobik, fakultatif aerob
maupun mikroaerofilik yang menggunakan jalur respirasi aerobik.
80
Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan diinokulasikan pada
Dengan menggunakan pipet tetes, 3% H2O2 diteteskan pada Objectglass secukupnya.
Amati adanya gelembung untuk hasil positif dan tidak ada gelembung untuk hasil
negatif (hati-hati membedakan antara gelembung yang muncul dari sel dengan
kumpulan sel yang mengambang akibat ditambahi reagen).
6.
C. Cara kerja :
Inokulasikan biakan pada media TSIA dengan cara inokulasi tusuk kemudian
dilanjutkan dengan diulaskan lurus tegak pada agar miring (lihat gambar).
Inkubasi pada 37oC selama 24-48 jam.
Interpretasikan hasil dengan melihat keterangan dibawah ini.
81
= slant merah (alkali) sedangkan butt kuning (asam) dengan atau tanpa produksi gas
hanya terjadi fermentasi glukosa, sedangkan fermentasi laktosa dan sukrosa tidak
terjadi. Sel lebih memilih untuk mendegradasi glukosa terlebih dahulu karena
glukosa adalah monosakarida yang dapat langsung massuk ke dalam jalur
metabolisme (glikolisis). Media mengandung glukosa yang sangat sedikit (lebih
sedikit dibanding laktosa dan sukrosa) sehingga jumlah asam pada permukaan (slant)
hilang secara cepat menjadi basa, karena pada mulanya bagian slant telah menjadi
kuning tapi dalam waktu lebih dari 24 jam sel akan kehabisan glukosa dan memilih
untuk memanfaatkan protein sehingga media menjadi merah.
= slant dan butt kuning (asam) dengan atau tidak adanya gas
telah terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan atau sukrosa karena laktosa dan sukrosa
memiliki konsentrasi yang lebih tinggi sehingga dapat dimanfaatkan untuk substrat
fermentasi lanjutan (jika glukosa habis) menghasilkan asam yang ditandai warna
kuning setelah 24 jam.
82
A. Dasar Teori
Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur konsentrasi protein total dengan secara
kolorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford melibatkan pewarna Coomassie Brilliant Blue
(CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan
warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (LambertBeer) pada panjang gelombang
465595 nm (cahaya tampak).
B.
Biakan bakteri
C.
Cara Kerja
PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD
PembuatanReagen Bradford
Reagen Bradforddibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue (CBB) G250
yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu ditambahkan 10 ml asam fosfor 85%
(v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam
botol gelap dan suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum digunakan..
2. Pembuatan Larutan standar protein
Standar proteindibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum albumin) yang kemudian
dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000
ppm. Larutan stok dengan konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok
ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Dari larutan stok
tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90 dan 100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein dengan
menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen Bradford. Kemudian larutan divortex
dan di inkubasi pada suhu ruang selama 1060 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca
pada panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan didapatkan persamaan
matematik untuk larutan standar protein yang diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan
digunakan pada pengukuran kadar protein terlarut.
3. Pengukuran protein terlarut
1.
Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis. umur 18 jam dalam
larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca yang kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4C. diperoleh supernatant yang
kemudian disebut dengan ekstrak enzim kasar (EEK).
Pengukuran sampeldilakukan dengan cara menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml
reagen Bradford divortex dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1060 menit. Absorbansi Larutan
83
sampel protein dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva
standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan ekstrak enzim
kasar.
reagen
Lowry
(larutan
asam
phosphor-tungstic-phospho-
Dimasukkan ke dalam deret tabung reaksi : 0 (blanko); 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL protein
standar BSA.
d) Ditambahkan 1 mL pereaksi Lowry A ke dalam tabung reaksi yang telah berisi Lowry B,
dikocok merata dengan cepat sesudah penambahan.
e)
Dibiarkan selama 30 menit sampai warna biru terbentuk. Diukur pada gelombang maksimum
lalu dibuat kurva standarnya.
Penentuan Kadar Protein sampel :
a)
Dipipet 1 mL larutan enzim tiap fraksi kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
b) Diberi perlakuan yang sama dengan larutan standar dan blanko(Ahmad, A., Patta, A. M., and
Natsir, H., 2013).
84
ISOLASI BAKTERIOFAGE
Kompetensi: Mahasiswa mampu melakukan isolasi bakteriofaga dari limbah cair
A. Dasar Teori
Bakteriofage adalah virus yang menginfeksi bakteri dan dapat menghancurkan secara
langsung sel bakteri , atau memadukan DNA-nya ke dalam kromosom bakteri. DNA fage
yang terintegrasi ke dalam kromosom sel inang dan tinggal di dalamnya tanpa
membahayakan inang dinamakan siklus lisogeni. Disisi lain fage juga dapat melisis sel inang
setelah bereproduksi dan keluar dengan sejumlah progeni melalui siklus litik. fage umum
ditemukan di lingkungan, terutama pada sampel limbah cair. Limbah merupakan habitat
bakteri fekal (coliform) dan diduga di dalam limbah mengandung banyak galur fage bakteri
koliform yang beragam. Keberadaan fage pada media agar
dapat dilihat dengan terbentunya plak pada media tersebut.
Plak menandakan bakteri yang ada pada area tersebut
mengalami lisis.
B. Alat dan Bahan
Water bath
Limbah cair
Kultur cair E. coli umur 3-5 jam
Nutrient Agar semi padat (agar 0.7%)
Nutrient Agar
Buffer Salin
C. Cara Kerja
Lakukan pengenceran sampel limbah cair 10-1 dan 10-2 dengan menggunakan
buffer salin.
Siapkan media agar semi padat (suhu 50 C) dalam 4 tabung reaksi, beri label
masing-masing tabung dengan 1, 2, 3, dan4.
Inokulasikan 1 ml limbah cair yang tidak diencerkan dam 1 ml kultur E. coli pada
tabung 1. Tuang pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri
membentuk angka 8.
Inokulasikan 1 ml limbah cair yang telah diencerkan (10-1 dan 10-2) pada tabung 2
dan 3. Buat control pada tabung 4 dengan buffer salin tanpa limbah cair. Tuang
pada media NA dan sebar dengan cara memutar cawan petri membentuk angka 8.
Biarkan media memadat. Inkubasi selama 48 jam.
Hitung jumlah plak yang terbentuk pada setiap cawan, catat ukuran dan bentuk
plak.
.
85
DAFTAR PUSTAKA
86
LAMPIRAN
10-3
20
127
TNTC
10-4
5
10
195
SPC
2,3X104
1,3X105
2X106
Keterangan
28 dan 5 <30
650 >300
TNTC >300
Jumlah koloni yang dilaporkan terdiri dari 2 digit yaitu angka satuan dan
angka sepersepuluh yang dikalikan dengan kelipatan 10 (eksponensial),
missal 2,3 X 104, bukan 2,34 X 104. pembulatan keatas dilakukan pada angka
seperseratus yang sama atau lebih besar dari lima, missal 2,35 X 104 menjadi
2,4 X 104, atau 2,34 X 104 menjadi 2,3 X 104.
Bila diperoleh perhitungan < 30 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran terendah yang dilaporkan.
10-2
15
10-3
TNTC
325
SPC
1,5X103
Keterangan
Semua <30
10-4
358
18
SPC
3,6X106
3,3X105
Keterangan
Pngc.trtgg(10-4)
Pngc.trtgg(10-3)
Bila ada 2 cawan, masing-masing dari pengenceran rendah dan tinggi yang
berurutan dengan jumlah koloni 30-300 dan hasil bagi dari jumlah koloni
pengenceran tertinggi dan terendah 2, maka jumlah yang dilaporkan adalah
nilai rata-rata. Jika hasil bagi dari pengenceran tertinggi dan terendah > 2
maka jumlah yang dilaporkan adalah dari cawan dengan pengenceran
terendah.
10-2
295
140
10-4
0
Bila diperoleh perhitungan > 300 dari semua pengenceran, maka hanya dari
pengenceran tertinggi yang dilaporkan.
10-2
TNTC
TNTC
10-3
1
10-3
40
35
10-4
5
1
SPC
3,5X104
1,4X104
Keterangan
40.000/29.500<2
35.000/14.000>2
10-3
15
20
45
10-4
5
2
5
SPC
(17.500+20.800)/2
= 1,9X104
(13.500+16.500)/2
Keterangan
15 dan 20 <30
45.000/13.500>2
87
= 1,5X104
165
45
275
35
(27.500/35.000)/2=a
285
40
(28.500+40.000)/2=b
(a+b)/2 = 3,3X104
290
25
(29.000+30.000)/2 =
3X104
305
28
45.000/10.500>2
Dilap. Pengc.
terendah
27.500/35.000<2
28.500/40.000<2
Dilap. Hasil ratarata
25 dan 28 <30
meskipun
305>300
88