Pengamatan Waktu Terekam Dapat Membatasi Akurasi Koefisien

Sedimentasi dalam Analisis Ultrasentrifugasi

Abstrak
Kami melaporkan besar ketidakakuratan dan sistematis pencatatan waktu yang telah dialakukan
dalam berkas data dari analisis ultrsentrifugasi , yang menyebabkan perkiraan yang terlalu
tinggi terhadap koefisien sedimentasi hingga mencapai 10 % . Ini jauh melebihi sebelumnya dan
dianggap faktor yang berkontribusi terhadap ketidakpastian dalam parameter ini , dan memiliki
konsekuensi yang signifikan untuk parameter asal , seperti bentuk hidrodinamik dan perkiraan
massa molar . Sumber kesalahan ini adalah pada ketidaktahuan saat ini, tapi kami menemukan
pebedaan yang konsisten secara kuantitatif di berbagai instrumen , meningkat dengan kecepatan
rotor . Selanjutnya, hal ini tampaknya berhubungan dengan penggunaan perangkat lunak akuisisi
data terbaru dari produsen , yang digunakan di beberapa laboratorium kami selama hampir
dua tahun . Banyak koefisien sedimentasi baru yang diterbitkan mungkin perlu dikaji ulang .
Masalah ini bisa dengan mudah dikenali dengan membandingkan berkas tanda waktu yang
disediakan oleh sistem operasi dengan waktu pemeriksaan yang telah dialakukan yang dicatat
dalam berkas data . Oleh karena itu kami menerapkan SEDFIT rutin yang secara otomatis dapat
memeriksa berkas data , mengingatkan pengguna untuk menggunakan perbedaan yang
signifikan, dan memperbaiki penyesuaian waktu pemeriksaan. Hal ini dapat menghilangkan
kesalahan dalam pembacaan waktu yang direkam .

Pendahuluan
Analisis ultrasentrifugasi ( AUC ) adalah teknik biofisik yang berdasarkan prinsip utamanya,
pada abad ke-20 , telah lama terlibat dalam pengembangan biologi sel , biokimia, dan biologi
molekuler [ 1-6 ] . Hal ini banyak diterapkan dan telah memberikan banyak kontribusi untuk
mempelajari interaksi makromolekul, protein membran , dan lain-lain [ 7 , 8 ] , dan juga
digunakan secara komersial untuk karakterisasi pharmaceutical protein [ 9 ] dan polimer [ 10 ] .
Kecepatan Sedimentasi analitis ultrasentrifugasi mempelajari redistribusi spasial partikel dalam
larutan dengan menggunakan medan sentrifugal tinggi . Profil konsentrasi radial diukur sebagai
fungsi waktu , dengan menggunakan absorbansi atau interferometri Rayleigh sistem deteksi
optik . Batas sedimentasi biasanya diamati , dan pergerakannya merupakan fungsi waktu ,

laporan parameter makromolekul yang berkaitan dengan ukuran, bentuk , dan daya apung ,
terutama dalam bentuk translasi difusi dan sedimentasi koefisien (nialai- s) .
Distribusi koefisien sedimentasi diperoleh dari metode analisis data yang modern yang dapat
spesies co-sedimentas dengan resolusi hidrodinamik yang tinggi, dan akurasi nilai- s biasanya
pada rentang satu atau beberapa persen [ 11 ] . Hal ini membuat data ini sangat cocok untuk
interpretasi bentuk makromolekul , baik oleh bentuk Informasi de novo dalam model
kesetimbangan ellipsoids [ 12 ] , atau penggalian informasi lebih rinci dalam konteks struktur
yang tersedia atau struktur domain [ 13,14 ] , atau sudut kecil X - ray atau hamburan data neutron
[ 15 ] . Kesetaraan luas adalah penggunaan koefisien sedimentasi untuk mendapatkan perkiraan
massa molar , baik dari hukum Stokes sebagai massa minimum dari partikel dengan berat jenis
yang dapat diukur nilai-s nya, atau sebagai massa molar atas dasar asumsi bentuk model atau
bentuk umum asimetri .
Dengan kemajuan pesat baik pemodelan komputasi hidrodinamika dan data

anlisis

ultracentrifugasi , kami telah memulai studi ekstensif untuk memastikan faktor-faktor

eksperimental yang membatasi presisi anlisis ultrasentrifugasi ( R. Ghirlando dkk . , naskah
dalam persiapan ) , untuk mengurangi dampaknya dapat dengan meningkatkan rosedur kalibrasi .
Dalam pengamatan ini , setelah menghapus faktor pembaur lain, kita melihat penyimpangan
yang tak terduga pada koefisien sedimentasi 10 % dalam catatan waktu yang telah dilakukan
setelah dimulainya sentrifugasi seperti yang dilaporkan dalam data mentah . Jelas, kesalahan
dalam interval waktu ini diasumsikan terhadap posisi batas sedimentasi yang diamati akan
menerjemahkan secara proporsional ke dalam kesalahan dalam menghitung nilai- s . Kesalahan
ini tampaknya hanya terjadi pada instrumen yang mennggunakan software akuisisi data terbaru
yang diberikan oleh produsen , tapi bukan menggunakan versi sebelumnya . Karena kami
percaya temuan ini menjadi arti penting bagi interpretasi koefisien sedimentasi dalam literatur
terbaru yang diterbitkan, serta untuk saat ini banyak pengamatan di banyak laboratorium
ultrasentrifugasi, kami secara resmi berkomunikasi dan membuat catatan masalah ini. Selain
itu, kami menjelaskan secara rinci pendekatan sederhana untuk mendeteksi keberadaan
kesalahan dan untuk memperbaiki data yang tidak akurat untuk analisis selanjutnya .

Bahan dan Metode

Percobaan kecepatan sedimentasi ( SV ) dilakukan pada Beckman Coulter analisis
ultracentrifugasi (Indianapolis , IN ) menjalankan pabrikan akuisisi data perangkat lunak
ProteomeLabTM XL -I Grafis Pengguna Versi 5.8 dalam instrumen Interface A dan
ProteomeLabTM XL-A/XL-I Pengguna Antarmuka Grafis Versi 6.0 ( 0419111340 ) pada
instrumen

B.

Sampel

bovine

serum

albumin

BSA

disusun

oleh

terliofilisasikan bubuk ( katalog # 7030 , Sigma - Aldrich , St Louis , MO ) di buffer fosfat

garam untuk konsentrasi akhir 0,5 mg/ml. Percobaan SV dilakukan mengikuti standar
protokol [ 16 , 17 ] . Secara singkat , setelah memasukan 400 l sampel BSA dan penyangga ke
dalam sampel dan sektor referensi (pembanding), masing-masing, dari Epon pusat doublesektor, campuran

dimasukkan ke dalam rotor . Rotor itu kemudian

diatur

pada suhu

kesetimbangan dalam ruang rotor dengan suhu nominal 20 C , dan kemudian dipercepat
sampai 50.000 rpm . Kedua interperensi (pengganggu) Rayleigh dan data absorbansi UV yang
diakuisisi , yang terakhir dalam mode berkelanjutan dengan kenaikan radial nominal 0,003 cm
dan satu akuisisi per scan . Sama halnya dengan sel AUC dengan BSA sampel dan PBS buffer
digunakan dalam semua eksperimen tanpa perubahan . Setiap percobaan SV , sampel remix
dengan perlahan membalikkan sel . Reprodusibilitas hasil eksperimen dikonfirmasi dari beberapa
replikasi

eksperimen

(data

tidak

ditampilkan

).

Data

dianalisis

di

SEDFIT

(sedfitsedphat.nibib.nih.gov / software ) menggunakan c ( s ) pendekatan distribusi koefisien

sedimentasi [ 18 ] , dan grafik disusun GUSSI ( biophysics.swmed.edu / MBR / software.html ) .

Hasil
Selama dua tahun terakhir , kami telah melakukan perbandingan data secara meluas terhadap
kecepatan sedimentasi antara 11 instrumen di laboratorium bersama kami . Seperti yang
dijelaskan secara rinci dalam ( R. Ghirlando dkk . , naskah dalam persiapan ) , kami telah
menemukan bahwa BSA cocok dan stabil untuk standar SV . Tipe kumpulan data SV
ditunjukkan pada Gambar 1 , dimana dapat dilihat bahwa ac ( s ) Analisis koefisien sedimentasi
memberikan hasil yang sangat baik . Spesies monomer BSA berasal dari oligomer , sehingga
memberikan tanda hasil yang tinggi untuk pengukuran kecepatan sedimentasi . Dalam
pengamatan ini , kami juga mengembangkan metode baru untuk mengendalikan suhu dan
kalibrasi

radial,

yang

akan

dijelaskan

dalam

pembahasan

selanjutnya

(R.

Ghirlando et al . , Naskah dalam persiapan ) . Namun, bahkan setelah penghapusan faktor-faktor

pembaur , kami masih tidak dapat mendapatkan perbedaan 10 % dalam pengukuran nilai-s
monomer BSA dari instrumen tertentu secara bebas dari sistem optik yang digunakan.
Oleh karena itu kami mempertanyakan asumsi dasar mengenai akuisisi data dan memeriksa
tanda waktu yang diciptakan oleh sistem operasi Windows pada modifikasi data , yang
memiliki akurasidetik. Meskipun sangat kecil, penundaan cukup konstan antara akuisisi aktual
dan penciptaanberkas data yang sesuai, perbedaan dari pembacaan tanda waktu, tOS ,
merupakan pengukuran yang independen antara interval waktu dan pembacaan . Hal ini dapat
dibandingkan dengan waktu setelah dimulainya sentrifugasi sebagaimana tercantum dalam
header dari isi file data aktual , dan perbedaan antara pembacaan , tAUC .
Misalnya, dalam kasus instrumen A kami menemukan rasio = tOS / tAUC menjadi 1,0029 ,
dan mendekati konstan selama proses akuisisi data. Perbedaan t = tOS - tAUC yang
dalam waktu kurang dari 10 detik dalam satu jam pertama dari akuisisi data , terus berkembang
dengan perbedaan 57 detik setelah 5,4 jam ( Tambahan Tabel T1 ) . Perbedaan yang kecil tidak
diketahui pada saat ini. Instrument A sedikit berbeda - nilai 1,0027 diperoleh dari analisis data
gangguan. Namun,mengakibatkan ketidakpastian di nilai-s 0,3 % berada dalam ketidakpastian
dari faktor instrumen lain, seperti sebagai kesalahan kalibrasi radial [ 19 ]. Sebaliknya , kami
terkejut menemukan bahwa untuk instrumen B , tOS dan tAUC menunjukkan perbedaan yang
signifikan, dengan t menjadi ~ 350 detik setelah satu jam , dan terus berkembang ke lag ~ 1,9
jam setelah waktu berjalan dari 21 jam ( Tambahan Tabel T2 ) , dengan perbandingan konstan
sepanjang pengukuran dari = 1,0994 ( bervariasi oleh sekitar 0,001 bergantung pada
pemilihan pembacaan) . Yang penting , kami menemukan Perbedaan serupa di semua set
instrumen kita yang menjalankan versi 6.0 dari data pabrikan perangkat lunak akuisisi
ProteomeLabTM XL-A/XL-I Graphical User Interface , tetapi tidak pada yang lain . Kemudian
waktu operasi scanning manual dan menegaskan bahwa tanda waktu yang diberikan oleh sistem
operasi menggambarkan antara waktu interval dengan pembacaan , dan melaporkan waktu
pembacaan yang telah dilakukan di header dari file pemindaian adalah salah.
Menariknya , kami mengamati bahwa hasil pembacaan waktu ditampilkan dengan tepat di
windows konsol centrifuge. Faktanya, pemindaian log - file yang dibuat oleh data akuisisi
perangkat lunak melaporan sistem waktu yang akurat untuk memulai dan berhenti pada proses

pemindaian , secara konsisten dalam waktu 1 - 2 detik dengan tanda waktu yang diberikan oleh
sistem operasi untuk membuat file. Dengan demikian, file tnda waktu benar menggambarkan
antara interval waktu dengan scan(pembacaan). Oleh karena itu kami menggunakan faktor
dilatasi sebagai koreksi untuk memasukan waktu pembacaan dan menghasilkan satu set
pembacaan (scan) baru dari file data yang benar. Nilai-s diturunkan untuk monomer BSA dari
data mentah asliSebuah instrumen adalah 4,317 S , sedangkan nilai yang diperoleh dari
instrumen B adalah 7,7 % lebih tinggi , atau 4,680 S( Tambahan Gambar 1 ) . Telah kami
periksa, terlepas dari prosedur kalibrasi , baik itu suhu dan kalibrasi radial ( R. Ghirlando dkk . ,
naskah dalam persiapan ) , dan menemukan kesalahan-kesalahan kecil antara dua instrumen ( 44
% berasal dari suhu rotor 19,66 C untuk A dan 19,48 Cuntuk B ) dan perbedaan dalam
kalibrasi

radial

sebesar

kesalahan

sebesar

1,05

Tambahan

Tabel

T3

),

menghasilkan koreksi nilai-s 4,328 S A dan 4,762 S B , atau perbedaan 10,03 % ( Gambar 2 ) .
Setelah penerapan dilatasi waktu koreksi faktor , nilai untuk instrumen B tereduksi menjadi
4,332 S (Gambar2 ). Terdapat perbedaan 0,09 % sesuai dengan tingkat akurasi yang diharapkan
dari nilai-s yang diukur untuk sampel yang sama dianalisis sisi demi sisi dalam jangka waktu
yang sama [ 11 ] . Data nilai-s adalah bukti lebih lanjut untuk kesalahan dalam nilai waktu yang
telah berlalu dalam file header , dan memvalidasi penggunaan dilatasi waktu koreksi dari tanda
waktu sistem operasi . Nilai yang sama untuk t dan ditemukan gangguan dan data
absorbansi , mengesampingkan kesalahan dari batas waktu dibutuhkan untuk melakukan scan
absorbansi tunggal. Seperti faktor kecil , itu sendiri adalah nilai-s tergantung [ 19 ] , SEDFIT
dapat diperhitungkan dengan komputasi. Parameter tambahan disimpan dalam file data yang
terkait dengan berlalunya waktu adalah nilai untuk integral 2dt . Sebagai migrasi dari
sedimentasi tergantung hanya pada nilai terpisahkan ini , parameter ini telah digunakan secara
konvensional untuk perhitungan berbagai kecepatan rotor , dan yang lebih penting fae percepatan
awal , yang membutuhkan waktu beberapa menit untuk kecepatan rotor akhir 50.000 rpm .
Sayangnya , waktu yang jelas berdasarkan 2dt nilai-nilai yang benar untuk deskripsi difusi.
Pemodelan langsung dengan persamaan Lamm dengan waktu - yang bervariasi untuk kecepatan
rotor diperkenalkan lebih dari satu dekade yang lalu , dan ini memungkinkan untuk simulasi
komputasi percepatan rotor yang tepat , sehingga pemodelan yang lebih akurat dari kedua
sedimentasi dan difusi [ 20 ] . Namun demikian , nilai-nilai 2dt telah dimanfaatkan dalam
SEDFIT sebagai sumber informasi yang mudah tentang durasi dari fase percepatan rotor [ 20 ].

Oleh karena itu, menarik untuk memeriksa akurasi 2dt pemasukan dalam file scan. Kami
menemukan parameter ini untuk sama-sama dipengaruhi oleh dilatasi waktu kesalahan :
perbedaan pembacaan waktu berdasarkan perbedaan entri 2DT berada dalam angka presisi
yang konsisten dengan waktu masuk dalam hitungan detik dan sama-sama salah. Dengan
demikian , analisis software

lain menggunakan pendekatan yang lama sedimentasi efektif

berdasarkan entri 2DT akan menguntungkan dari koreksi yang sama seperti yang diterapkan
di dalam SEDFIT. Selanjutnya, kami secara sistematis meneliti perbedaan waktu untuk data SV
diperoleh pada kecepatan rotor yang berbeda . Seperti ditunjukkan dalam Gambar 3 , ada
ketergantungan yang kuat terhadap kecepatan rotor, dengan peningkatan yang linier sampai
50.000 rpm dimana kesalahan maksimum ~ 10 % diamati . Sama pelakuan keceptan rotor
tergantung pada instrumen lain yang menjalankan versi 6.0 dari data pabrikan perangkat lunak
akuisisi ProteomeLabTM XL-A/XL-I Graphical User Interface. Akhirnya , dalam rangka
memfasilitasi pengakuan kesalahan ini , pemeriksaan tanda otomatis dilaksanakan di perangkat
lunak SEDFIT versi 14.0c ( tersedia dari sedfitsedphat.nibib.nih.gov ) yang membandingkan
dengan tOS tAUC dan alert pengguna untuk ditemukannya kesalahan ini . Karena kita tidak
tahu pasti tentang asal-usul t relatif kecil untuk data dari data akuisisi versi software
sebelumnya , kami menerapkan batasan yang ditetapkan pengguna untuk , secara default
awalnya sebesar 1.005 untuk saat ini . Jika melebihi ambang batas , SEDFIT menciptakan
sebuah data laporan dan meminta pengguna untuk menulis file data baru dengan waktu koreksi
dan 2dt waktu masuk , melalui perkalian kedua angka yang ada dengan , di pemindaian file
data baru untuk analisa lebih lanjut .

Diskusi
Hal yang tak terdugadalam kesalahan sistematis kami menemukan waktu awal sentrifugasi
yang menyebabkan terjadinya kelebihan dugaan koefisien sedimentasi dari biasanya hingga
mencapai ~ 10 % pada penggunaan kecepatan rotor yang tinggi . Tampaknya terkait dengan
akuisisi data pabrikan software versi 6.0 , yang dipasang pada instrumen yang dibuat pada
musim semi dan musim panas 2011 . Kami percaya bahwa software terinstal di fraksi yang
signifikan di laboratorium ultracentrifuge seluruh dunia. Kesalahan sistematis secara signifikan
lebih besar , sekitar 10 kali lipat , dibandingkan dengan akurasi biasanya eksperimental nilai-s,

dan sekitar 100 kali lipat lebih besar dari presisi statistik nilai-s yang diukur dalam jangka
waktu yang sama [ 11 ] . Kami telah menunjukkan bahwa hal itu dapat hampir dihindari dengan
penggunaan sistem operasi file data tanda waktu . Sedangkan versi sekarang dari perangkat
lunak analisis data SEDFIT memungkinkan seseorang untuk mendeteksi masalah ini,
kemungkinan kesalahan besar terjadi sebelumnya menimbulkan pertanyaan tentang integritas
yang terjadi pada data kecepatan sedimentasi yang telah diterbitkan selama dua tahun terakhir
(termasuk beberapa kita sendiri ) , beberapa yang mungkin harus dikaji ulang. Tentu saja,
kesalahan 10 %dalam nilai-s dapat menyebabkan salah tafsir kuantitatif dan kualitatif yang
signifikan pada berbagai tingkatan . Sebagai contoh, jika kita mempertimbangkan 30S subunit
ribosom 70S dari prokariota [ 21 ] , kondisi itu bisa muncul untuk dijalankan pada 33S , yang
harus ditafsirkan sebagai tambahan yang signifikan atau perubahan konformasi . Penerapan SV
untuk menentukan konsistensi persiapan protein , misalnya , dalam pharmaceutical protein , kan
memberikan hasil yang keliru

untuk dipelajari oleh versi data akuisisi perangkat lunak.

Selanjutnya , perhitungan 10 % nila -s terlalu tinggi bisa menimbulkan kesimpulan bias yang
signifikan dari pemodelan hidrodinamik . Misalnya, 65 kDa sedimentasi di 4.1 S memiliki rasio
gesekan 1,39 , sesuai dengan kesataraan luas yg tersebar hidrodinamis ellipsoid rasio aksial
4,82 , tetapi dengan nilai-s 10 % lebih tinggi nilai gesekan jelas akan 1.27, sesuai dengan luas
yg tersebar ellipsoid dengan rasio aksial 3.22 , yakni akan muncul menjadi 30 % terlalu
pendek

Secara umum, jika diasumsikan bentuk diketahui tetapi massa molar tidak , akan mecapai 10 %
over- estimate pada koefisien

sedimentasi , berdasarkan hukum

menyarankan overestimate 15 % untuk

kesalahan sistematis dalam

nilai-s

hidrodinamik partikel,

massa molar. Untungnya , untuk banyak aplikasi

konsekuensinya akan berkurang

. Pertama, setiap

kesimpulan dari percobaan kesetimbangan sedimentasi akan bervariasi. Demikian juga , ketika
menggunakan persamaan pemodelan Lamm untuk menentukan massa molar dari kombinasi
koefisien sedimentasi dan difusi ( atau rasio gesekan , masing-masing, seperti pada c ( s )
metode [ 22 ] ) , selama keduanya diambil dari data yang sama dari perubahan bentuk batas ,
kesalahan dalam batas waktu yang akan membatalkan ( seperti dapat dilihat dari pemeriksaan
Lamm dan Svedberg persamaan ( R. Ghirlando dkk . , naskah persiapan) ) . Demikian pula ,
konstanta mengikat berasal dari isoterm sinyal - tertimbang s- nilai (baik terpadu selama populasi
spesies , atas sistem sedimenting seluruh [ 23 ] , atau di atas batas reaksi [ 24 ] ) akan erpengaruh

, meskipun nilai - s spesies masih akan tidak akurat . Kesalahan dalam tingkat konstanta kinetik
dari pemodelan persamaan eksplisit Lamm [ 25-27 ] akan lebih signifikan dibandingkan dengan
presisi dalam pendekatan ini . Kesimpulan dari penggunaan SV untuk mendeteksi perubahan
konformasi secara kualitatif , berdasarkan koefisien sedimentasi relatif [ 28 ] , sama akan
invarian. akhirnya , kesimpulan pada stoichiometries kompleks diambil dari penerapan
sedimentasi multi- sinyaldistribusi koefisien [ 29,30 ] akan terpengaruh karena mereka hanya
tergantung pada amplitudo sinyal . Terakhir, fakta bahwa kesalahan lebih besar ditemukan pada
set yang percobaannya menggunakan BSA sebagai sampel stabil untuk mengkaji akurasi
instrumen dan konsistensi ( R. Ghirlando dkk . naskah dalam persiapan ) melihat kebutuhan
untuk menjalankan secara berkala percobaan kontrol dalam analitis ultrasentrifugasi dengan
wellcharacterized sampel , meskipun kenyataanya diketahui bahwa ultrasentrifugasi analitis
adalah teknik biofisik dengan prinsip utama. , dalam penelitian itu kami juga telah mengamati
kesalahan yang sebelumnya tidak diketahui yaitu kesalahan kalibrasi suhu, meskipun hanya
adventitiously di salah satu dari 11 instrumen diperiksa . kami percaya bahwa , dalam
hubungannya dengan difusi - deconvoluted c ( s ) analisis , BSA sangat cocok untuk diamati,
karena sudah tersedia , waktu ke waktu yang stabil dan lama , dan menghasilkan puncak yang
tajam dalam distribusi koefisien sedimentasi , seperti yang akan dijelaskan selanjutnya
(R.Ghirlando et al . Naskah dalam persiapan ) .

Pemberitahuan
Karya ini didukung oleh Program Penelitian Intramural dari National Institute of Biomedical
Imaging dan Bioengineering, National Institute of Diabetes dan Pencernaan dan Penyakit Ginjal,
dan National Heart, Lung dan Darah Institute, National Institutes of Health.

Gambar Legends
Gambar 1 :
Puncak : scan data absorbansi kecepatan sedimentasi BSA disentrifugasi dalam instrumen A
( simbol , menunjukkan hanya setiap 3 Data titik setiap pemindaian 3 ) , dan Model batas
kecocokan dari c ( s ) analisis ( garis solid ) .
Tengah : Residu fit , dengan deviasi akar kuadrat rata-rata dari 0,0054 OD Bawah : Best- fit
sedimentasi koefisien distribusi c ( s ) .

Gambar 2 : Tampilan dari distribusi koefisien sedimentasi yang sama sampel BSA dari
sentrifugal A dan B. cyan garis utuh tebal adalah c ( s ) distribusi untuk instrumen A menjalankan
Dataperangkat lunak akuisisi versi 5.8 . C ( s ) distribusi dari instrumen B menggunakan
perangkat lunak akuisisi data versi 6.0 ditampilkan dalam warna ungu. Setelah koreksi waktu
scan , distribusi koefisien sedimentasi Instrumen B ditampilkan sebagai garis biru , hampir
tumpang tindih bahwa instrumen A. Terlihat distribusi suhu dan kalibrasi radial , karena plot
analog c ( s ) distribusi dikoreksi untuk radius dan kesalahan kalibrasi suhu , lihat Tambahan
Gambar 1 .
Gambar 3 : Ketergantungan scan faktor scan (pembacaan) dilatasi waktu sebagai fungsi dari
kecepatan rotor , untuk instrumen menggunakan data akuisisi perangkat lunak versi 6.0