ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan

Waktu penelitian akan dilakukan selama 6 (enam) bulan. Penelitian ini

dilakukan di Instalasi Pusat Bioamterial dan Bank Jaringan Rumah Sakit Umum

Dr. Soetomo Surabaya dan Laboratorium Fisika Material Fakultas Sains dan

Teknologi Universitas Airlangga Surabaya. Pengujian FTIR kolagen dan

komposit dilakukan di Laboratorium Farmasi Ubaya. Pengujian FTIR

hidroksiapatit dilakukan di Laboratorium Bersama UNESA. Pengujian toksisitas

dilakukan di Pusat Veterinaria Farma (PUSVETMA) Surabaya.

3.2 Bahan dan Alat Penelitian

3.2.1 Bahan penelitian

Bahan yang digunakan untuk pembuatan sampel adalah 37% asam klorida

(HCl), 40 gram NaOH, asam fosfat, 1M NH4OH, 5% asam asetat (CH3COOH),

1M Na2HPO4.2H2O, akuades, 70 gram tendon sapi, serta 10 gram hidroksiapatit

tulang sapi bubuk. Untuk karakterisasi sampel, bahan yang diperlukan antara lain

sel fibroblast, larutan PBS, EMS 5%, tripsin 0,25%, pewarna MTT, DMSO,

serum sapi 10%.

3.2.2 Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam untuk pembuatan sampel adalah lemari es,

freezer suhu - 80ºC, serta lypolizer. Untuk karakterisasi, alat yang digunakan

adalah FTIR ( Fourier Transform Infra Red ) Jasco – 4200 dan FTIR Freezer -

85°C, botol nunc, botol roux, microplate 96 well, serta elisa reader.

33
Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
34

3.3 Prosedur Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan 3 tahap penelitian, yaitu persiapan,

pembuatan sampel dan karakterisasi sampel. Pada tahap pembuatan sampel, ada 2

proses yaitu ekstraksi kolagen dari tendon sapi dan pembuatan komposit kolagen-

hidroksiapatit. Bagan prosedur penelitian ditunjukkan pada Gambar 3.1.

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
35

Mulai

Persiapan bahan

\
Pembuatan larutan
reaktan

Proses ekstraksi kolagen dari tendon

sapi (Bos sondaicus)

Karakterisasi sampel kolagen dengan

FTIR

Proses pembuatan komposit kolagen -

hidroksiapatit

Karakterisasi sampel komposit

dengan FTIR

Karakterisasi sampel komposit dengan

metode MTT Assay

Hasil dan pembahasan

Selesai

Gambar 3.1 Bagan prosedur penelitian

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
36

3.3.1 Persiapan Bahan

Tendon sapi yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari rumah

potong hewan (RPH) Pegirikan Surabaya. Langkah pertama proses sintesis

kolagen adalah mencuci bersih tendon sapi dengan air mengalir. Kemudian

tendon dipotong kecil dan dihancurkan. Pemotongan dan penghancuran tendon

berguna untuk memperluas permukaan tendon sehingga mengoptimalkan interaksi

molekul – molekul kolagen dengan larutan pada saat perendaman maupun

ekstraksi. Tendon yang sudah hancur ditimbang sebanyak 70 gram. Kemudian

disiapkan larutan reaktan untuk proses pembuatan sampel.

3.3.2 Pembuatan larutan reaktan

Pembuatan Larutan HCl 5% dilakukan dengan cara mengambil 270 ml

HCl 37%dan diencerkan dengan akuades kedalam gelas beaker hingga volume

larutan mencapai 2000 ml dengan ketentuan akuades dimasukkan terlebih dahulu

kedalam gelas beaker kemudian ditambahkan HCl. Larutan 1 M NaOH untuk

proses ekstraksi kolagen dan proses pelarutan kolagen dibuat dengan cara

menimbang 40 gram NaOH kemudian ditambahkan akuades perlahan lahan

sampai volume mencapai 1000 ml.

Larutan 5% CH3COOH untuk proses pelarutan kolagen dibuat dengan

cara menngambil 25 ml CH3COOH kedalam gelas beaker, kemudian ditambahkan

akuades hingga volume mencapai 500 ml. Pembuatan larutan 1 M NH4OH untuk

proses pelarutan hidroksiapatit dilakukan dengan cara melarutkan 106 ml NH3

dengan 894 ml akuades. Pencampuran dilakukan dengan cara mengaduk perlahan

NH3 kedalam akuades.

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
37

3.3.3 Proses ekstrasi kolagen dari tendon sapi (Bos sondaicus)

Tendon yang sudah dipotong, dihancurkan dan ditimbang seberat 70

gram, kemudian direndam dalam 5% HCl dengan perbandingan berat tendon dan

volume HCl adalah 1 : 20 agar tendon terendam sempurna. Tendon sebanyak 70

gram direndam dalam 1400 ml HCl 5% selama 24 jam pada suhu 4ºC.

Perendaman ini bertujuan untuk memisahkan serat kolagen dari tendon. Sifat

kolagen adalah mudah meregang ( melunak ) apabila berada dilingkungan dengan

pH rendah di bawah 4 (Prayitno, 2007). Proses perendaman juga mengakibatkan

penggebungan ( swelling ) yang dapat membuang material yang tidak diinginkan,

seperti lemak dan protein non–kolagen pada bahan dengan kehilangan kolagen

yang minimum (Zhou dalam Marsaid et al, 2010). Suhu dijaga untuk tidak lebih

dari 4ºC agar kolagen tidak rusak.

Setelah mencapai 24 jam waktu perendaman, cairan dipisah melalui

penyaringan dengan kain. Filtrat (cairan) ditambahkan dengan larutan NaOH 1 N

sampai pH mencapai 7 ( netral ). Ketika pH netral, terbentuk gumpalan putih yang

berkumpul ditengah filtrat, kemudian didiamkan selama 30 menit hingga

gumpalan putih tersebut mengendap dan selanjutnya disaring dengan

menggunakan kertas saring. Penambahan NaOH bertujuan untuk menggumpalkan

kolagen yang terikat asam pada pH netral. Reaksi yang terjadi pada proses ini

dituliskan sebagai berikut :

HCl + NaOH NaCl + H2O (3.1)

Bagan proses ekstraksi kolagen secara dapat dilihat pada Gambar 3.2.

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
38

Menyediakan tendon
sapi seberat 70 gram

Perendaman tendon dalam 5%

HCl pada suhu 4ºC selama 24 jam

Pemisahan rendaman dengan

penyaringan

Penambahan 1 M NaOH kedalam

filtrat hasil perendaman

Kolagen basah

Gambar 3.2. Bagan prosedur pembuatan kolagen tendon sapi

3.3.4 Karakterisasi sampel kolagen dengan FTIR

Karakterisasi kolagen basah dengan FTIR digunakan untuk membuktikan

kesesuaian gugus kolagen yang terbentuk dengan karakter kolagen murni. Hasil

dari FTIR adalah berupa grafik spektrum dari sampel kolagen. Karakterisasi

kolagen menggunakan alat FTIR Jasco – 4200 seperti pada Gambar 3.3.

Preparasi sampel kolagen basah untuk FTIR adalah dengan cara meneteskan

sedikit cairan sampel (bebas air) yang akan diukur pada satu bagian window KBr,

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
39

kemudian dipasangkan satu bagian window KBr lagi sehingga cairan merata pada

permukaan window. Setelah sampel siap, window KBr pada holder dimasukkan

kedalam alat untuk selanjutnya dilakukan proses pengukuran.

Gambar. 3.3 Alat FTIR Jasco - 4200

3.3.5 Proses pembuatan komposit kolagen – hidroksiapatit

Pembuatan komposit kolagen – hidriksiapatit menggunakan metode

kimiawi sesuai dengan metode Wenpo et al, 2009 dengan beberapa modifikasi.

Kolagen dan hidroksipapatit yang akan dibuat komposit, terlebih dahulu

dilarutkan dalam pelarut. Bila dua buah bahan digabungkan dalam bentuk larutan,

maka akan terjadi ikatan kimia. Penelitian ini menggunakan 5 variasi komposisi

kolagen – hidroksiapatit seperti pada tabel 3.1.

Kolagen basah dicampur dengan asam asetat 5 % dan Na2HPO4.H2O

dengan perbandingan b/v/b adalah 1/1/1. Semua bahan diaduk sempurna.

Penambahan asam asetat dimaksudkan untuk melarutkan kolagen. Kolagen larut

dengan baik dalam asam asetat, namun kolagen sebenarnya dapat larut dengan air

dengan tingkat kelarutan yang rendah (Paranginangin et al, 2008). Sedangkan

penambahan Na2HPO4.H2O bertujuan untuk mengkondisikan sampel pada

keadaan setimbang cairan tubuh. Na2HPO4.H2O merupakan cairan PBS (Phospate

Buffer Saline) yang komposisisnya mirip cairan tubuh. Setelah sampel tercampur

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
40

rata, ditambahkan 1 M NaOH sampai pH netral untuk mengendapkan cairan

kolagen.

Hidroksiapatit bubuk dicampur dengan asam fosfat (H3PO4) dengan

perbandingan b/v adalah 1/4. Perbandingan ini bertujuan agar hidroksiapatit dapat

larut sempurna dalam asam fosfat. Kemudian ditambahkan NH4OH sampai pH

netral. Asam fosfat biasa digunakan dalam pembuatan hidroksiapatit sintetik.

Larutan kolagen dan hidroksiapatit dicampurkan dan diaduk. Kemudian

diinkubasi selama ± 6 jam dan diambil endapanya (Gambar 3.4).

Gambar 3.4 Pengendapan larutan komposit kolagen - hidroksiapatit

Sampel kemudian dliofilisasi dengan lypolizer (Gambar 3.6) agar

berbentuk bubuk. Setelah kering dan menjdi bubuk seperti yang ditunjukkan

Gambar 3.5.

Gambar 3.5 Bubuk komposit kolagen hidroksiapatit

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
41

Komposit kolagen – hidroksiapatit yang sudah diliopilisasi mempunyai

sifat yang sangat higroskopis, sehingga harus disimpan di tempat yang sejuk dan

kering. Jika dibiarkan dalam kondisi udara terbuka maka komposit akan basah,

lengket dan berubah warna menjadi kekuningan.

Tabel 3.1. Variasi Komposisi Kolagen-Hidroksiapatit

Variasi Komposisi

Nama Sampel Kolagen Hidroksiapatit

(%) (%)

Sampel A 100 0

Sampel B 0 100

Sampel C 30 70

Sampel D 40 60

Sampel E 50 50

Sampel F 60 40

Sampel G 70 30

Gambar 3.6 Lyophilizer

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
42

Proses pembuatan komposit kolagen dapat disajikan pada Gambar 3.7.

Mulai

Membuat larutan kolagen dengan Membuat larutan hidroksiapatit

5% CH3COOH dan 1M NH4OH dengan 1 M asam fosfat

Penetralan larutan kolagen Penetralan larutan hidroksiapatit

dengan 1 M NaOH dengan1 M NH4OH

Pencampuran sampel larutan

komposit kolagen - hidroksiapatit

Pengeringan sampel dengan

metode freeze dried

Selesai

Gambar 3.7 Bagan prosedur pembuatan komposit kolagen hidroksiapatit

3.3.6 Karakterisasi sampel komposit dengan FTIR

Sampel komposit yang terbentuk dikarakterisasi dengan menggunakan

FTIR untuk mengetahui gugus komposit sudah terbentuk dan sesuai. Hasil FTIR

sampel kolagen spektrum frekuensi dari sampel. Karakterisasi sampel komposit

kolagen – hidroksiapatit menggunakan FTIR Jasco – 4200 (Gambar 3.3).

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
43

Bubuk komposit kolagen – hidroksiapatit, seberat 1 – 10 miligram,

dicampur dengan 100 miligram bubuk KBr, kemudian dicetak menjadi cakram

tipis atau pelet. Kemudian sampel dimasukkan kedalam alat untuk diuji.

3.3.7 Karakterisasi sampel dengan uji toksisitas dengan metode MTT Assay

Kultur sel fibroblast dilakukan dengan mengambil sel BHK-21 (baby

hamster kidney). Uji menggunakan wadah microwell plate 96 seperti pada

Gambar 3.8. Satu baris plate diisi oleh kontrol media, satu baris lainya untuk

kontrol sel, dan sisanya untuk pengujian sampel. Kontrol sel dibuat dengan cara

menambahkan bovine serume da eagledalam satu baris plate. Kontrol media

dibuat dengan menambahkan eagle dan sel fibroblast dalam satu baris plate

lainya.

Gambar 3.8 Microwell plate 96

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit
 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga
44

Setelah sampel diteteskan kedalam plate dengan 8 kali perulangan, semua

sampel termasuk kontrol sel dan kontrol media diberi pewarna MTT stock

solution ((3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Jumlah

sel hidup kemudian dihitung dengan menggunakan Elisa Reader (Gambar 3.9).

Gambar 3.9 Elissa Reader

Skripsi Sintesis dan Karakterisasi Kolagen dari Tendon Sapi Agnes Krisanti Widyaning
(Bos sondaicus) sebagai Bahan Bone Filler Komposit
Kolagen –Hidroksiapatit