SPEKTROSKOPI NMR DAN PENENTUAN STRUKTUR PROTEIN : APLIKASI UNTUK PENEMUAN

DAN PENGEMBANGAN OBAT

Abstrak: Kemajuan teknologi terbaru dalam metode dan instrumentasi NMR memiliki dampak yang
signifikan dalam biologi struktural. Inovasi-inovasi ini juga berdampak pada bioteknologi farmasi karena
sekarang mungkin untuk menggunakan spektroskopi NMR untuk secara cepat mengkarakterisasi jumlah
obat protein prospektif dan target obat protein yang terus bertambah. Ulasan ini memberikan ringkasan
umum tentang bagaimana negara solusi NMR dapat digunakan untuk menentukan struktur protein. Ini juga
berfokus pada mengeksplorasi bagaimana kemajuan dalam negara solusi NMR mengubah cara di mana
struktur protein dapat ditentukan dan interaksi protein-ligan dapat dikarakterisasi. Inovasi terbaru dalam
persiapan sampel protein, dalam instrumentasi dan pengumpulan data, dalam tugas spektral dan dalam
pembuatan struktur disoroti. Dampak NMR solusi-negara pada bioteknologi farmasi juga dibahas, dengan
penekanan khusus pada menggambarkan bagaimana NMR telah digunakan untuk mempelajari sejumlah
protein penting secara farmasi dan bagaimana NMR saat ini digunakan untuk cepat layar dan untuk
memetakan situs pengikatan molekul kecil ke berbagai target protein.
PENGANTAR
Selama 20 tahun terakhir, kemajuan dalam biologi struktural telah sangat mengubah cara di mana obat
dirancang dan ditemukan. Saat ini, daripada mengobati target protein sebagai kotak hitam sederhana,
ilmuwan farmasi sekarang memperlakukan mereka sebagai entitas molekuler kompleks yang memiliki
struktur yang terdefinisi dengan baik dengan situs aktif yang dapat diaktifkan secara rasional atau
dinonaktifkan dengan ligan molekul kecil. Inovasi dalam metode penentuan struktur bersama dengan
kemajuan pesat dalam alat visualisasi molekuler telah menyebabkan munculnya desain obat yang dibantu
struktur atau desain obat yang rasional sebagai bagian integral dari penemuan dan proses pengembangan
obat [1, 2]. Tentu saja, desain rasional dari setiap obat tergantung pada pengetahuan yang tepat dari struktur
3D dari target protein. Sampai saat ini, teknik yang paling menonjol untuk penentuan struktur 3D adalah
kristalografi sinar-X [3]. Tidak ada metode penentuan struktur lain yang dapat menyamai kapasitas
kristalografi sinar-X untuk menghasilkan struktur protein penting atau kompleks protein seperti polimerase,
proteosom, virus, dan ribosom. Namun, tidak semua protein kondusif untuk kristalisasi dan tidak semua
protein berperilaku atau terlihat sama dalam keadaan kristal seperti yang mereka lakukan di lingkungan
seluler [4]. Dalam hal ini, spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR) telah muncul sebagai alternatif
penting untuk kristalografi X-ray karena memungkinkan struktur protein untuk ditentukan dalam kondisi
yang sangat dekat dengan keadaan fisiologis (yaitu dalam larutan). Terlebih lagi, spektroskopi NMR
memberikan kesempatan kepada biolog struktural untuk mengukur peristiwa atau proses yang tidak mudah
dilihat atau dikuantifikasi oleh kristalografi sinar-X, seperti kinetika protein, dinamika atau termodinamika
Ulasan ini berkaitan dengan menjelaskan bagaimana spektroskopi NMR solusi-negara dapat digunakan
untuk menentukan struktur peptida, protein dan kompleks protein-ligan dari minat farmasi. Selain
memberikan gambaran dasar metode NMR protein, artikel ini juga akan menjelaskan beberapa metode yang
muncul atau lebih inovatif yang membuat spektroskopi NMR dan penentuan struktur berbasis NMR jauh
lebih cepat dan jauh lebih kuat. Contoh-contoh juga akan diberikan untuk mengilustrasikan bagaimana NMR
dapat digunakan untuk menyaring target protein dengan pustaka obat, mengkarakterisasi kompleks ikatan-
ligan yang mengikat secara lemah dan memperoleh informasi dinamis atau termodinamika yang berguna.
Tujuan utama dari tinjauan ini adalah untuk memberikan pengenalan dasar untuk protein negara solusi-
NMR dan untuk menggambarkan bagaimana protein NMR dapat dan harus menjadi bagian penting dari
penemuan dan pengembangan obat.
DASAR-DASAR NMR
Spektroskopi NMR adalah teknik spektroskopi yang mengukur absorbansi radiasi frekuensi radio (RF) yang
terjadi ketika beberapa jenis inti atom (1H, 13C, 15N) ditempatkan di bawah medan magnet yang kuat.
Posisi frekuensi absorpsi atau "resonansi" yang dapat dideteksi disebut pergeseran kimia. Pergeseran kimia
sangat sensitif terhadap lingkungan elektronik di sekitar setiap nukleus dan dapat memberikan banyak
informasi tentang struktur kovalen dan non-kovalen molekul [7, 8]. Banyak resonansi NMR juga
menampilkan struktur halus yang ditandai oleh puncak terpisah (doublet atau kembar tiga) yang timbul dari
kopling magnet antara nuklei yang bersebelahan atau berikatan kovalen. Fenomena pemisahan puncak ini
disebut spin-spin atau J coupling dan itu juga dapat digunakan untuk menyimpulkan pengetahuan tentang
molekul kovalen molekul [8]. Selain itu, inti juga dapat mentransfer energi atau magnetisasi satu sama lain,
baik melalui ikatan dan melalui ruang (untuk jarak pendek). Proses transfer ini disebut efek Overhauser
nuklir atau NOE [9]. Itu Intensitas resonansi NOE berbanding terbalik dengan kekuatan keenam jarak antar
inti. Ketergantungan jarak ini berarti fenomena NOE sering dieksploitasi untuk menentukan geometri
molekul [10].
Sehubungan dengan sebagian besar jenis spektroskopi lainnya, NMR unik dalam tingkat resolusi (ketajaman
puncak) yang ditawarkannya. Puncak sempit dalam NMR sebenarnya merupakan konsekuensi dari
tergulingnya molekuler cepat yang terjadi dalam larutan. Kemunduran acak ini memperlambat waktu
relaksasi magnetik (T1 dan T2) dan mempertajam transisi energi. Resolusi spektral luar biasa ini membuat
NMR jauh lebih baik daripada UV, fluoresensi atau spektroskopi IR untuk mengekstraksi informasi atomik
atau molekuler terperinci dari senyawa kimia. Selanjutnya, perilaku nuklei di bawah semua jenis kondisi
eksitasi RF sangat luar biasa dapat diprediksi membuat NMR sangat cocok untuk eksperimen yang
dirancang khusus yang memungkinkan magnetisasi dimanipulasi dan ditransfer sekitar molekul hampir
sesuka hati. Eksperimen "urutan pulsa" atau manipulasi RF ini terletak di jantung spektroskopi NMR
modern [11].
Menggunakan informasi tentang pergeseran kimia yang khas, dikenal J-coupling, diukur lebar garis dan
diamati NOE adalah mungkin untuk menentukan banyak tentang struktur kovalen molekul kecil. Memang,
NMR telah digunakan sebagai metode utama untuk menentukan atau mengkonfirmasi struktur kimia organik
selama lebih dari 40 tahun [12, 13]. Karena protein pada dasarnya adalah polimer dari molekul-molekul
kecil, banyak dari prinsip-prinsip NMR yang sama yang digunakan dalam molekul kimia kecil dapat
diterapkan pada protein. Namun, protein memiliki lebih banyak inti dan menampilkan lebih banyak
resonansi daripada molekul organik kecil. Ini membuat spektra NMR mereka sangat sulit ditafsirkan.
Bahkan, tidak sampai perkembangan spektroskopi 2D NMR pada tahun 1970-an bahwa protein NMR dapat
ditangani dengan sungguh-sungguh [14, 15]. Dalam spektroskopi 2D, resonansi NMR dipisahkan tidak pada
satu sumbu frekuensi tetapi pada dua frekuensi (atau kimia
pergeseran) sumbu. Spektroskopi 2D adalah setara konseptual dari gel elektroforesis 2D, di mana bintik-
bintik protein pertama kali dipisahkan secara elektroforetik sesuai dengan titik isoelektrik mereka dan
kemudian menurut massa mereka. Pemisahan 2D memungkinkan titik-titik tersembunyi muncul dan lebih
banyak puncak untuk diidentifikasi secara positif. Seperti yang akan kita lihat sebentar lagi, spektroskopi 2D
NMR dapat dengan mudah diperluas ke tiga dimensi atau bahkan empat dimensi [16, 17]. Dalam kasus 3D
NMR, puncak tidak ditampilkan dalam bidang, tetapi dalam kubus (Gambar 1).
Struktur protein NMR pertama (peptida) ditentukan pada tahun 1981 menggunakan protokol dan teknik
yang sebagian besar dikembangkan oleh Kurt Wuthrich dan rekan kerja [18]. Pekerjaan ini diakui pada
tahun 2002 ketika ia dianugerahi Hadiah Nobel dalam bidang kimia. Struktur awal ini sangat kasar (setara
dengan resolusi 3,5 Å struktur X-ray) dan terbatas pada sangat kecil (<70 residu), protein berperilaku baik
[14]. Pada hari-hari awal, struktur protein membutuhkan waktu berbulan-bulan atau bahkan bertahun-tahun
untuk menghasilkan. Sejak itu, langkah besar dalam teknologi dan teknik telah dilakukan. Meningkatkan
kekuatan medan magnet hingga 900 MHz [19], meningkatkan sensitivitas probe menggunakan probe
cryogenic super-cooled [20], perangkat keras yang lebih canggih [21], komputer yang lebih cepat, skema
pelabelan isotop yang lebih baik [22], sistem ekspresi yang menghasilkan lebih tinggi [23] ], parameter
spektral yang baru terukur [24, 25], dan sangat meningkatkan urutan pulsa [25, 26] sekarang memungkinkan
protein yang lebih besar untuk dicirikan lebih cepat dan dengan presisi yang jauh lebih besar. Protein
sebanyak 723 residu telah sepenuhnya ditetapkan [27] dan kompleks protein sebesar 900.000 dalton telah
dianalisis [28]. Sampai saat ini, spektroskopi NMR telah digunakan untuk memecahkan lebih dari 3000
peptida dan struktur protein, banyak yang tersedia dari Protein Data Bank [3]. NMR telah dengan jelas
muncul sebagai teknik penentuan struktur. Ini juga telah berkembang menjadi alat vital yang dapat
mengungkapkan banyak tentang interaksi, gerakan, kinetika dan termo-dinamika protein dan ligan mereka.
protein struktur oleh nmr - sebuah ringkasan protein nmr tuntutan sebuah luas rentang dari keterampilan,
dari mole- cular biologi dan protein pemurnian untuk kuantum kimia dan pemrograman komputer. masing-
masing dari ini keterampilan adalah bekas di berbeda kali, dengan bervariasi derajat dari intensitas. fortu-
nately, itu proses adalah menjadi makin mudah sebanyak aspek dari protein nmr yang menjadi lebih
otomatis atau "resep" berorientasi [4, 25, 29]. sebagai sebuah umum aturan, protein struktur penentuan
melalui nmr dapat terbagi ke empat tangga: 1) contoh persiapan; 2) data koleksi; 3) berurutan tugas dan
spektral pengesahan; dan akhirnya 4) struktur generasi dan pengesahan. kita akan membahas masing-masing
dari ini tangga dan beberapa dari mereka lebih baru inovasi di lebih perincian, tapi sebelum melakukan jadi,
ini adalah mungkin bermanfaat untuk menyediakan sebuah singkat ikhtisar dari seluruh yang proses
sehingga kemudian diskusi akan lebih bermakna. protein sampel mungkin salah satu berlabel (1h hanya)
atau berlabel dengan tertentu nmr peka isotop (i.e. 13c dan 15n). karena 1h (kami akan penggunaan itu
istilah proton dari di sini di) adalah sebuah tentu saja terjadi dan sangat sensitif nmr inti, banyak lebih kecil
peptida dan protein perlu tidak menjadi isotopically berlabel. sebenarnya, untuk itu pertama 10 tahun protein
nmr, paling protein adalah tidak berlabel [14]. saya t memiliki hanya telah dengan itu kedatangan dari lebih
baik nmr perangkat keras dan nmr nadi urutan bahwa itu kecenderungan menuju isotopically berlabel
sampel memiliki diambil dari [4, 25, 26]. untuk lebih besar protein (> 10 kd) atau dalam pengejaran dari
kualitas yang lebih tinggi struktur, paling nmr spectroscopists seperti bekerja dengan isotopically berlabel
protein. ini disusun oleh pertumbuhan sel dan mengekspresikan itu protein di didefinisikan minimal media
bahwa memiliki telah diperkaya dengan 13c dan / atau 15n berlabel substrat. sekali sebuah protein contoh
siap untuk nmr (berlabel atau berlabel) dan cocok solusi syarat-syarat ditemukan, ini adalah kemudian
tunduk pada sebuah serangkaian 2d atau 3d nmr eksperimen. itu maksud dari ini eksperimen adalah
mengumpulkan cukup spektral data sehingga setiap nmr puncak (atau resonansi) dapat ditugaskan untuk
setiap nmr terdeteksi atom (atau inti) dalam protein [5, 14]. ini proses disebut berurutan tugas. untuk
berlabel peptida dan protein, itu tugas proses adalah relatif mudah. dua jenis dari 2d nmr experi- ments
adalah dikumpulkan. sebuah tocsy (total korelasi spectro- scopy) eksperimen adalah pertama dikumpulkan
yang memungkinkan individu asam amino menjadi diidentifikasi oleh itu berbeda pola dari mereka kimia
pergeseran [30]. sebuah noesy (nuklir overhauser peningkatan spektroskopi) eksperimen adalah kemudian
dikumpulkan yang hasil sebuah spektrum bahwa terlihat hampir identik dengan tocsy spektrum [31]. tetapi,
dalam noesy eksperimen ada ekstra puncak (sering 100's, bahkan 1000's). ini ekstra "semu" puncak atau
menyeberang puncak, yang datang antara pasangan dari tocsy puncak, sesuai dengan interaksi di mana dekat
proton adalah dalam 5 sebuah dari satu sama lain. itu lebih kuat itu menyeberang puncak, itu lebih dekat itu
dua proton (atau asam amino) adalah. menggunakan noesy data, di kombinasi dengan itu tocsy data, ini
adalah mungkin untuk menentukan yang asam amino adalah berurutan proksimal untuk satu sama lain [32].
di cara ini masing-masing set dari puncak dalam tocsy spektrum dapat ditugaskan sebuah atom nama dan
sebuah residu nomor. sekali semua tocsy puncak telah ditugaskan sebuah atom nama dan sebuah residu
nomor, itu berurutan tugas proses adalah lengkap. catatan bahwa karena hanya satu jenis dari inti (1h) adalah
makhluk dianalisis, ini metode disebut homonuclear nmr. kapan kerja dengan isotopically berlabel protein
(biasanya 13c / 15n atau dua kali lipat-berlabel), itu berurutan tugas proses melakukan tidak tergantung pada
noesy data sama sekali. agak, ini adalah mungkin menggunakan sebuah serangkaian j-ditambah 3d nmr
eksperimen untuk mengenali individu asam amino jenis dan untuk mengenali yang pasangan dari asam
amino adalah berurutan proksimal untuk satu sama lain. ini 3d nmr eksperimen diberi nama untuk itu jenis
dari inti mereka mengukur. karenanya sebuah hnca eksperimen [33] tindakan itu 1h amida perubahan dari
sebuah residu di satu sumbu ("h"), itu 15n amida perubahan di lain sumbu ("n") dan itu 13cα perubahan
pada ketiga sumbu ("ca"). melihat ara. (2) untuk sebuah ilustrasi dari beberapa umum 3d heteronuclar nmr
eksperimen. sebagai contoh, jika kita melakukan sebuah eksperimen bernama itu hncacb [34] ini adalah
mungkin untuk mencari sangat baik-didefinisikan pola untuk menentukan itu amida 1h perubahan, itu amida
15n perubahan, itu 13cα perubahan dan itu 13cβ perubahan untuk masing-masing asam amino residu dalam
protein. itu hncacb spektrum juga hasil itu 13cα dan 13cβ pergeseran untuk sebelumnya residu (ara. 2).
mengumpulkan data dari lain jenis dari eksperimen bernama sebuah hcch-tocsy [35] ini adalah mungkin
untuk mendapatkan kimia pergeseran untuk itu 13cα demikian juga sebagai itu sisi rantai 13c dan 1h atom
dari masing-masing residu dalam protein. dengan melihat pada ciri pergeseran dari 13cα, 13cβ dan sisi lain
rantai 13c's diperoleh oleh itu hncacb dan hcch-tocsy spektrum satu bisa jelas mengenali individu asam
amino jenis. demikian pula oleh melakukan itu hnco eksperimen [33], itu amida 1h perubahan dan itu amida
15n perubahan untuk satu residu dapat diidentifikasi bersama itu 13co perubahan dari sebelumnya residu.
oleh mengidentifikasi itu keterkaitan antara amida pergeseran dan sebelumnya 13co, 13cα dan 13cβ
pergeseran (dari hnco dan hncacb data) satu bisa berurutan menetapkan paling dari 1h, 13c dan 15n
resonansi di sebuah protein [17, 29]. ini proses disebut heteronuklir nmr sebagai beberapa berbeda jenis dari
inti (1h, 13c, 15n) digunakan dalam tugas proses. sekali itu berurutan tugas proses adalah selesai, ini adalah
mungkin memulai itu struktur penentuan proses. ini adalah diuraikan di ara. (3). kedua itu homonuclear dan
heteronu- jelas pendekatan tergantung pada mengumpulkan kelipatan noesy spektrum. oleh menggunakan
itu berurutan tugas sudah diperoleh, noesy menyeberang puncak diidentifikasi dan diukur. biasanya
beberapa noesy spektrum adalah dikumpulkan dengan berbeda parameter (percampuran kali) untuk
menentukan lebih tepatnya itu kekuatan dari noe interaksi dan untuk lebih baik menyesuaikan itu jarak
antara masing-masing noe-aktif pasangan dari proton. itu intensitas dari masing-masing noe puncak adalah
dikonversi untuk sebuah kira-kira berpasangan pemisahan (1.8-2.8, 1.8-4.0, 1.8-5.0 sebuah) antara sebanyak
hidrogen atom sebagai satu bisa mengukur [10, 14]. tambahan informasi tentang sekunder struktur (berasal
dari kimia pergeseran - [36, 37]), kopling konstanta [38], hidrogen ikatan, dan disulfida obligasi adalah juga
ditambahkan ke sebuah panjang daftar dari kira-kira kendala [10]. khas untuk sebuah protein dari 100 residu
satu ingin untuk mendapatkan 1500 untuk 2000 kendala (15-20 kendala per residu). itu experi- mental
berasal pembatas berkas adalah ditambah dengan cova- dipinjamkan geometri kendala tentang masing-
masing dari asam amino (obligasi panjang, obligasi sudut, asam amino planarity dan kiralitas informasi)
diketahui dari sebelumnya kecil molekul studi. itu bergabung pembatas berkas adalah kemudian dikirim ke
sebuah jarak geometri program [39] atau tiruan anil program untuk struktur generasi [40]. ini sangat
sophisti- cated geometri optimasi program upaya untuk menghasilkan sebuah
INOVASI SAMPEL PERSIAPAN
Hambatan terbesar untuk penentuan struktur protein, baik oleh NMR atau X-ray crystallography, adalah
sampel persiapan. Persiapan sampel hanyalah proses menyiapkan protein murni yang cukup, berperilaku
baik, dan larut untuk memulai studi struktural. Aspek dari proses penentuan struktur ini kadang-kadang
membutuhkan waktu bertahun-tahun untuk melakukan trial and error. Tidak ada metode tunggal yang
berfungsi untuk semua protein. Untungnya, karena upaya banyak proyek genomik struktural baru-baru ini
dan inovasi berkelanjutan yang muncul dari industri biotek, sejumlah perbaikan dalam teknik persiapan
sampel telah dibuat [4, 23]. Inovasi-inovasi ini membuat proses persiapan sampel agak lebih cepat dan jauh
lebih mudah.
Dalam spektroskopi NMR, seseorang biasanya mencoba untuk mendapatkan sampel protein yang murni (>
95%), sebagian besar terlipat, monomerik (atau paling buruk, dimer), larut untuk waktu yang lama (hari),
stabil hingga konsentrasi ~ 1 mM, dan diberi label yang tepat dengan 13C, 15N dan / atau 2H isotop.
Persyaratan untuk kedua kuantitas (10's of mg) dan pelabelan isotop biasanya berarti bahwa sampel protein
yang disiapkan dari NMR harus dikloning menjadi host mikroba ekspresi tinggi.
Sejumlah sistem ekspresi mikroba yang sangat baik telah dikembangkan dan telah terbukti memberikan
secara konsisten. Hasil yang sangat baik dari protein berlabel isotop. Di antara host bakteri, ada beberapa
strain protease (Lon-, OmpT-) E. coli (seperti BL21 [DE3]) yang memungkinkan berbagai protein
diekspresikan di dalam sel tanpa takut degradasi proteolitik. Ada juga sejumlah strain E. coli yang telah
secara khusus dikembangkan untuk memungkinkan pelabelan isotop khusus residu [44, 45]. Bakteri
auksotrofik ini memiliki gen kunci tertentu dalam jalur sintetis asam amino yang tersingkir, sehingga
mereka memerlukan suplemen asam amino spesifik dalam media pertumbuhannya. Pelabelan khusus residu
adalah pendekatan yang sangat kuat untuk menetapkan atau menganalisis protein yang sangat besar oleh
NMR karena sangat menyederhanakan spektrum mereka dan memungkinkan jenis asam amino individu
untuk diidentifikasi secara tidak ambigu.
Penggunaan Pichia pastoris, ragi metilotrofik, telah terbukti menghasilkan jumlah yang sangat tinggi (100's
mg / L) dari protein yang lebih besar yang tidak dapat diekspresikan pada bakteri [47, 48]. Alat lipat yang
lebih canggih, kontrol redoks yang lebih baik (untuk protein terikat disulfida) dan ekspor protein yang lebih
baik yang ditemukan di Pichia memungkinkan protein berlabel isotopik untuk diisolasi cukup sederhana dari
media pertumbuhan. Baru-baru ini, sistem mamalia dan baculovirus telah dikembangkan untuk
mengekspresikan protein berlabel untuk NMR [49, 50]. Sistem eukariotik ini membutuhkan media
pertumbuhan yang cukup canggih dan mahal, tetapi untuk protein yang tidak dapat diungkapkan dengan
cara lain, sistem eukariotik ini kadang-kadang merupakan satu-satunya pilihan.
Untuk memfasilitasi pencarian host yang tepat (berbagai strain bakteri, ragi, baculovirus, dll.)
Pengembangan metode ligasi independen ligasi (LIC) seperti sistem Gateway Invitrogen telah membuat
proses lebih mudah dan lebih cepat. LIC memungkinkan preparasi vektor ekspresi secara serentak dan
lancar untuk berbagai host yang berbeda, dengan berbagai label afinitas yang berbeda [51]. Terlalu sering,
ahli biologi struktural membuat kesalahan dengan bekerja hanya dengan satu host untuk menyelidiki
optimasi ekspresi. Laboratorium biologi struktural yang lebih sukses secara rutin mencoba setengah lusin
atau lebih host bersama dengan beberapa jenis vektor ekspresi yang mengandung tanda afinitas atau
kelarutan yang berbeda. utama inovasi di protein ekspresi dan pemurnian memiliki telah itu dekat-universal
adopsi dari afinitas dan / atau kelarutan tag [52]. sebelumnya dengan penampilan dari protein atau peptida
fusi tag, paling protein pemurnian protokol memiliki menjadi bekerja dan dioptimalkan sendiri-sendiri. ini
sering memimpin untuk panjang, membosankan, multi--langkah protokol dengan sangat rendah hasil.
dengan afinitas tag, pemurnian adalah sering hanya sebuah tunggal langkah dan hasil bisa pendekatan 90%.
itu paling terkenal afinitas label adalah itu polyhistidine atau his6 label, yang mungkin terlampir salah satu
dengan n atau c ujung penghabisan dari protein dari bunga. his6 ditag protein dapat dimurnikan segera dan
mudah menggunakan sebuah nikel-egta kolom [53]. biasanya sebuah cleavable linker adalah diperkenalkan
antara itu protein urutan dan itu his6 label, meski pembelahan adalah biasanya tidak perlu untuk nmr studi.
lain peptida afinitas tag bisa digunakan seperti glutathione transferase (gst), maltosa mengikat protein (mbp)
dan selulosa mengikat protein (cbp), meski karena mereka ukuran ini tag umumnya harus menjadi melekang
sebelum melakukan nmr studi. kadang-kadang itu pilihan (atau tempat) dari sebuah afinitas label bisa
substansial mempengaruhi itu hasil, fungsi atau stabilitas dari menyatakan protein. oleh karena itu ini adalah
selalu sebuah baik ide untuk mencoba beberapa berbeda tag atau label orientasi [52, 53]. tambahan lagi
untuk ini afinitas pemurnian tag, struktural ahli biologi adalah juga menyelidiki itu penggunaan dari
kelarutan peningkatan tag atau set ini. set tag dirancang meningkatkan protein kelarutan untuk kurang baik
berperilaku protein - yang mana sangat penting untuk nmr. misalnya, poli-lisin ekor atau sebuah n-parah
tergabung protein g (b1 domain) telah biasanya baik efek [54]. protein perlu tidak disuarakan di hidup
menjamu. baru-baru ini, itu penggunaan dari in vitro atau sel-gratis protein perpaduan sistem memiliki telah
menunjukkan menjadi sangat efektif di memproduksi besar jumlah dari murni, mudah dimurnikan dan
sepenuhnya berlabel protein [23, 55]. ini sistem adalah berdasarkan menggunakan salah satu e. coli atau
gandum embrio turunan / terjemahan mesin-mesin bahwa memiliki telah terpencil dan ditempatkan ke
khususnya dirancang microtitre piring [55, 56]. itu ribosom, trnas dan rna polimerase adalah kemudian
disediakan dengan itu gen dari bunga bersama yang sesuai persediaan dari nucletotide trifosfat, asam amino
dan lain elemen. kadang-kadang chaperonins, disulfida isomerases dan lain protein lipat fasilitator mungkin
menambahkan dengan campuran. hasil dari ini in vitro sistem bisa pendekatan sebuah mengherankan 6 mg /
ml [23]. residu spesifik dan seragam isotop pelabelan adalah mudah dicapai dengan sel-gratis sistem [57]. in
vitro atau sel-gratis sistem adalah sangat cost- efektif (tinggi hasil per satuan dari berlabel asam amino) dan
membutuhkan minimal contoh penanganan. tetapi, mereka melakukan tidak kerja untuk semua protein.
tambahan lagi untuk lebih baik ekspresi dan pemurnian sistem, nmr spectroscopists memiliki juga datang
dengan banyak lebih baik isotop pelabelan metode. oleh mengeksploitasi kami luas paham dari asam amino
metabolisme, sebuah variasi dari skema telah maju untuk memungkinkan selektif pelabelan dari asam amino
atau bagian dari asam amino (i.e. metil kelompok) dengan salah satu 13c atau 2h isotop [46, 58]. oleh
menghilangkan besar nomor dari sinyal dan mengurangi dipolar pelebaran efek, ini selektif pelabelan skema
memiliki diizinkan sangat besar protein menjadi ditugaskan dan dipecahkan oleh nmr [27, 59]. mereka
memiliki juga diizinkan sangat rinci dinamis studi menjadi dilakukan. juga itu pengembangan dari lebih
canggih (kaya) media, itu penggunaan dari ringan panas-syok atau lebih baik pemilihan waktu dalam
pengenalan dari berlabel isotop ke itu pertumbuhan media memiliki sangat ditingkatkan protein hasil atau
substansial memotong pelabelan biaya [60, 61]. lain inovasi di isotop pelabelan adalah itu konsep dari
segmental pelabelan melalui trans-splicing atau intein-berdasarkan kimia ligasi [62]. segmental pelabelan
memungkinkan berbeda protein segmen atau domain menjadi berlabel, dengan demikian sangat
menyederhanakan itu nmr spektrum dari lebih besar protein. inteins adalah itu protein setara dari intron.
mereka adalah insersional urutan di protein bahwa sambatan diri mereka di luar setelah terjemahan. selama
itu splicing proses, itu intein adalah dihapus dan itu protein potongan-potongan mendahului dan berikut itu
intein adalah bergabung [63]. oleh mempersiapkan sebuah isotopically berlabel domain dengan sebuah
intein urutan pada c-ujung penghabisan dan menambahkan sebuah kedua, berlabel domain dengan sebuah
sistein pada n ujung penghabisan, itu splicing reaksi bisa dimulai terkemuka untuk sebuah hibrida atau
chimeric protein dengan satu bagian dari protein berlabel dan itu lain bagian tidak [62, 64]. bahkan setelah
sebuah protein memiliki telah dimurnikan, tepat berlabel dan ditempatkan di sebuah nmr tabung, banyak
tantangan masih ada. sering, di bawah tampaknya jinak syarat-syarat, protein akan mengendapkan atau
bentuk besar multimers setelah sebuah pendek periode waktu. ini jelas mencegah baik kualitas nmr
spektrum dari menjadi dikumpulkan. biasanya nmr spectroscopists harus menghabiskan sebuah baik
transaksi dari waktu temuan optimal solusi syarat-syarat untuk mereka protein mengumpulkan yang
diperlukan spektrum. ini disebut contoh pendingin [65]. saya t tidak seperti itu contoh proses bahwa x-sinar
crystallographers penggunaan mencari kristal. di contoh pendingin satu mencoba untuk contoh sebuah besar
nomor dari ph, suhu dan garam syarat-syarat mencari itu optimal solusi syarat-syarat untuk mengumpulkan
nmr spektrum [66]. itu jadi-bernama tombol uji [67] memiliki telah maju untuk memudahkan ini proses. itu
tombol uji kegunaan sebuah microtitre piring dan dialisis film untuk memungkinkan besar nomor dari
contoh condi- tions untuk dievaluasi dan untuk pengendapan peristiwa untuk terdeteksi, menggunakan
sebuah minimal jumlah dari protein. tambahan lagi untuk mengubah ph atau garam syarat-syarat, kadang-
kadang itu tambahan dari lain cosolvents (trifluoroethanol, dimetilsulfoksida) atau deterjen bisa membantu
[68, 69]. baru-baru ini, itu penggunaan dari terbalik misel di rendah kelekatan pelarut memiliki telah
ditampilkan untuk menghasilkan beberapa menjanjikan hasil di penanggulangan sulit protein [70]. juga,
terbatas proteolitik pencernaan dari longgar, hidrofobik ekor bisa kadang-kadang menuju ke sebuah lebih
stabil protein bahwa berperilaku banyak lebih baik dalam nmr tabung [65, 71].
INOVASI DALAM INSTRUMENTASI DAN KOLEKSI DATA
Kemajuan dalam instrumentasi dan desain urutan pulsa mungkin merupakan alasan utama mengapa
spektroskopi NMR telah tumbuh begitu spektakuler selama dekade terakhir. Tentunya, peningkatan
kecepatan komputer dan kapasitas penyimpanan data telah sangat membantu dalam semua bidang
spektroskopi (dan sains). Namun, jenis inovasi instrumental lainnya mungkin memiliki lebih banyak dampak
dalam NMR. Instrumen ultra high field (900 MHz) adalah salah satu contohnya [19, 21]. Dalam NMR,
medan magnet yang lebih tinggi menghasilkan resolusi yang lebih baik karena dispersi pergeseran kimia
meningkat secara linier dengan kekuatan medan sementara lebar garis dasarnya tetap sama. Resolusi yang
lebih baik berarti bahwa protein yang lebih besar dapat dipelajari dan bahwa lebih banyak detail spektral
dapat dikumpulkan pada protein yang lebih kecil. Magnet yang lebih kuat juga menghasilkan signal-to-noise
yang lebih baik, meningkatkan kira-kira sebagai itu 7/4 daya dari medan gaya. oleh karena itu, lebih baik
spektrum bisa dikumpulkan di kurang waktu atau dengan kurang bahan. meningkat kekuatan medan juga
memungkinkan tertentu fenomena berhubungan dengan kimia perubahan anisotropi (csa) dan dipolar
kopling menjadi dieksploitasi, terkemuka untuk sebuah baru-ditemukan kemampuan mengumpulkan
spektrum dengan sangat sempit baris (itu trosy eksperimen). tambahan lagi untuk meningkat kekuatan
medan, lebih dan lebih nmr magnet adalah makhluk terbuat dengan aktif perisai. aktif perisai mengurangi itu
nyasar bidang (itu lima gauss baris) di luar itu magnet, dengan demikian memungkinkan nmr instrumen
menjadi bertempat di lebih kecil kamar. aktif perisai juga memungkinkan lain instru- ments (massa
spektrometer (ms), cair kromatografi peralatan (lc), robot contoh changer) menjadi membawa ke lebih dekat
kedekatan. oleh memungkinkan ini seperti instrumentasi lebih dekat dengan nmr magnet, baru jenis dari
hibrida nmr teknik adalah makhluk maju, termasuk lc-nmr dan lc- ms-nmr [72]. ini hibrida metode
mengizinkan nmr spectro- scopists (dan obat kimiawan) untuk mencirikan ligan mengikat peristiwa atau
untuk layar senyawa perpustakaan terhadap baru protein sampel menggunakan itu bergabung kekuatan dari
nmr, massa spektrometri dan cair kromatografi. oleh kopling ini nmr sistem untuk mengalir-penyelidikan,
yang eliminasi itu perlu untuk kaca nmr tabung, nmr data koleksi bisa menjadi banyak lebih cepat dan jauh
lebih otomatis [21]. kriogenik didinginkan penyelidikan (penyelidikan yang memiliki memiliki mereka
elektronik didinginkan untuk dekat nol mutlak melalui cair helium) adalah lain penting instrumental inovasi
itu adalah sekarang menjadi biasa di protein nmr. oleh supercool- ing itu penyelidikan elektronik, panas
kebisingan adalah hampir dieliminasi dan itu sinyal-untuk-kebisingan dapat meningkat sebuah faktor dari
tiga atau lebih [20]. ini inovasi telah membuat saya t mungkin untuk inex- pensively mengubah sebuah
menurunkan bidang instrumen (mengatakan 500 mhz) dengan setara dari sebuah lebih tinggi bidang
(mengatakan 800 mhz) instrumen - sedikitnya di istilah dari kepekaan. lain penyelidikan desain innova-
tions adalah memungkinkan banyak lebih kecil contoh volume untuk digunakan, lebih besar toleransi dari
garam dan lebih besar batas di diijinkan suhu atau tekanan [21]. memacu di oleh ini baru instrumental
kemajuan, nmr spectroscopists telah sanggup untuk mengukur atau desain nadi urutan bahwa mengizinkan
mereka untuk mengukur baru jenis dari nmr parameter. relatif untuk lain jenis dari spektroskopi, nmr adalah
khususnya kaya spektroskopi diamati. kimia pergeseran, berputar kopling, dipolar kopling, relaksasi kali,
nuklir overhauser efek menyeberang-berkorelasi relaksasi tarif, kimia nilai tukar, kimia perubahan
anisotropi (csa), dan seterusnya bisa semua diukur (salah satu sendirian atau di combina- tion) untuk sebuah
variasi dari inti di bawah sebuah variasi dari syarat-syarat. masing-masing dari ini diamati, jika tepat diukur
dan dianalisis, bisa memberikan kuantitatif struktural atau dinamis informasi. antara itu paling menarik
"baru" parameter muncul di protein nmr telah sisa dipolar kopling atau rdc's [24, 73]. ini adalah berbeda dari
berputar-berputar atau j kopling di bahwa itu puncak pemisahan muncul kapan dua dekat nuklir dipol adalah
berbeda-beda berorientasi relatif dengan luar medan gaya. di solusi, ini dipolar kopling adalah biasanya rata-
rata untuk nol, jadi kita hanya mengamati j-kopling. di padatan, ini dipolar kopling adalah sangat besar dan
sebenarnya mendominasi itu spektrum. jika solusi syarat-syarat bisa ditemukan bahwa memberikan protein
sebuah sebagian atau sisa orientasi ini dipolar kopling, yang adalah relatif kecil (-20 untuk +20 hz) bisa
dilihat. oleh penyusunan penggunaan dari mencairkan solusi dari bicelles [20], berserabut fag partikel [74]
atau lain besar polimer yang sakitan mengikat protein, nmr spectroscopists memiliki ditemukan bahwa
protein dapat sakitan berorientasi untuk menghasilkan terukur sisa dipolar kopling. karena ini coupl- ings
tergantung pada orientasi dari protein relatif dengan luar medan gaya demikian juga sebagai itu orientasi
dari dipol pasangan dalam itu protein, rdcs bisa digunakan untuk mengekstrak jadi-bernama "panjang
rentang" informasi. di lain kata, rdc's bisa memberikan informasi tentang itu orientasi dari dua heliks relatif
untuk satu sama lain atau bahkan tentang itu orientasi dari dua domain relatif untuk satu sama lain [75]. itu
penggunaan dari rdc's memiliki menjadi makin lazim di protein struktur determi- bangsa dan perbaikan
sebagai ini lagi rentang kendala sangat memperbaiki itu kualitas dan ketelitian dari protein struc- tures [73].
baru-baru ini, protein struktur memiliki sebenarnya telah dihasilkan menggunakan hanya rdc data [76], yang
membuka itu menarik kemungkinan dari melakukan nmr tanpa noe's. sisa dipolar kopling adalah tidak satu-
satunya jenis dari kopling untuk telah "ditemukan". jenis lain dari berputar kopling memiliki baru-baru ini
telah diamati yang mengizinkan bahkan lebih geometris atau pembatas informasi menjadi berasal. ini
memasukkan itu pengukuran dari internuclear 3jnc 'coupl- ings timbul antara hidrogen obligasi [77], itu
pengukuran dari 3jhα-1n kopling, melalui hn (co) ca eksperimen, yang memberikan informasi di protein ψ
sudut [78] dan itu pengukuran dari 3jc'hα kopling, melalui hcanc' eksperimen, yang memberikan informasi
di tulang punggung φ sudut [79]. banyak lain j-kopling konstanta, yang memberikan sisi rantai χ1 sudut
informasi, adalah juga terukur menggunakan dimodifikasi 2d dan 3d heteronuklir eksperimen [80].
tambahan lagi untuk ini baru kopling konstan pengukuran, itu pengukuran dari cross- berkorelasi relaksasi
(itu diferensial relaksasi tarif timbul dari dua set dari dipol memiliki berbeda orientasi) memiliki telah
ditemukan untuk menyediakan sangat tepat penentuan dari back- tulang puntiran sudut [81]. demikian pula
itu pengukuran dari karbonil karbon csa-dimediasi menyeberang-berkorelasi relaksasi dalam lebih kecil,
seragam berlabel protein memiliki telah ditemukan untuk menghasilkan sungguh tepat nilai-nilai untuk
tulang punggung ψ sudut [82, 83]. ini adalah penting untuk ingat bahwa itu pengukuran dari baru nmr
parameter membutuhkan itu pengembangan dan implementa- tion dari baru nadi urutan. ini nadi urutan
mengizinkan itu proses mengisikan maknit di sebuah protein sistem menjadi bergerak di sekitar dan untuk
itu berbagai kopling / relaksasi fenomena untuk berkembang dan transfer untuk lain inti. inovasi di nadi
urutan mengizinkan berbeda kombinasi dari kimia pergeseran, kopling dan relaksasi kali menjadi
ditampilkan, terpilih atau terdeteksi - salah satu sepanjang berbeda sumbu atau dengan berbeda intensitas.
misalnya, itu pengembangan dari nadi urutan untuk memungkinkan 3d dan 4d nmr memiliki diizinkan jauh
lebih spektral informasi menjadi ditampilkan dan berkorelasi di sebuah tunggal spektrum [16, 17], itu
penemuan dari hnha nadi urutan memiliki diizinkan jauh lebih tepat 3jhnhα kopling konstanta untuk diukur
[80], itu pengembangan dari musik nadi urutan memiliki diizinkan individu asam amino jenis menjadi
diidentifikasi - tanpa itu perlu untuk residu-spesifik pelabelan [84], sementara itu penggunaan dari
berdenyut-bidang gradien memiliki ditingkatkan itu kepekaan dari banyak nmr eksperimen oleh sebuah
faktor dari dua atau lebih [85].
INOVASI DALAM PENGALIHAN DAN VALIDASI SPEKTRAL
Penugasan spektral atau penugasan berurutan mengacu pada proses penetapan atom untuk resonansi NMR
individu atau pergeseran kimia. Ini barangkali merupakan langkah paling intensif dan rawan kesalahan pada
protein NMR. Fakta bahwa tidak ada transformasi matematis sederhana yang mengubah data eksperimental
menjadi struktur (seperti yang ada dengan kristalografi sinar-X) selalu menjadi sesuatu yang menyebabkan
Achilles to protein NMR. Akibatnya ada sejumlah upaya yang ditujukan untuk menyelesaikan semua
langkah ini [91, 92] atau sepenuhnya mengotomatiskan proses penugasan NMR [93].
Sejak awal 1990-an, beberapa laporan telah diterbitkan yang menunjukkan kemungkinan melewatkan
proses penugasan dan langsung dari data spektral mentah ke struktur 3D yang terpecahkan. Upaya pertama
dijelaskan oleh Per Kraulis [94] yang menunjukkan kelayakan menghasilkan struktur 3D dari dua protein
kecil (BPTI dan GAL4) menggunakan 13C / 15N data NOESY heteronuklir terpisah. Tentu saja dari
struktur yang terpecahkan itu adalah masalah sederhana dari pengambilan tugas secara otomatis. Baru-baru
ini, Grishaev dan Llinas [92] telah menggunakan pendekatan yang sedikit berbeda untuk menghasilkan
struktur 3D dari dua protein kecil (~ 70 residu) hanya menggunakan data NOESY homonuklir. Konsep dasar
melibatkan penggunaan dinamika molekuler dan simulasi annealing untuk memadatkan "gas" atom atom H
yang tidak terkoneksi dan tidak terhubung ke dalam distribusi proton terstruktur (cloud) menggunakan
hanya jarak internuclear (dari intensitas NOE) dan van der Waals sebagai hambatan. Urutan protein
kemudian dipetakan ke awan proton untuk menghasilkan struktur polipeptida terhubung yang lengkap.
Sekali lagi, tidak ada tugas yang diperlukan, namun algoritma ini sangat intensif secara komputasi dan
membutuhkan waktu CPU berhari-hari atau berminggu-minggu. Baru-baru ini Atkinson dan Saudek [91]
telah menunjukkan bahwa struktur 3D ubiquitin dapat dihasilkan independen dari setiap tugas spektral
sebelumnya. Proses ini didasarkan pada penggunaan sejumlah besar eksperimen heteronuklear 3D dan satu
percobaan NOOF Heterosida 4D tunggal. Setiap puncak (atau konstanta kopling) berfungsi sebagai batasan
jarak yang sangat kasar antara pasangan atom. Sebagai contoh, penampilan 75 puncak silang NH dalam
spektrum HSQC 15N memberikan batasan yang menunjukkan bahwa 75 pasang atom NH berada dalam
jarak berpasangan 1,0 - 1,1 Å. Dengan mengukur data eksperimen yang cukup dan menyediakan sejumlah
kendala yang cukup, struktur yang cukup baik dapat dihasilkan (dari mana penugasan dapat dengan mudah
disimpulkan). Metode ini tampaknya terbatas pada protein yang relatif kecil yang memiliki jumlah yang
sangat besar (> 10) dari spektrum heteronuklir 3D berkualitas tinggi yang dikumpulkan dan dianalisis.
Pendekatan lain untuk tugas protein adalah membiarkan komputer melakukan pekerjaan atau setidaknya
membantu pekerjaan. Ada sejumlah besar pendekatan otomatis dan semi-otomatis yang telah diterbitkan
atau dijelaskan termasuk AUTOASSIGN [95], GARANT [96], Smartnotebook [97], PASTA [98], CAMRA
[99] dan lainnya [93]. Beberapa dibatasi untuk menggunakan spektrum homonuklear 1H dan sangat
bergantung pada kualitas yang sangat baik dari data TOCSY dan NOESY. Lainnya lebih umum atau
menggunakan data eksperimen 2D dan 3D heteronuklear. Pendekatan ini tidak memerlukan data NOESY,
tetapi memang membutuhkan set standar enam hingga sembilan spektrum kualitas tinggi untuk
menyelesaikan proses penugasan.
Semua metode otomatis atau semi-otomatis dibatasi oleh aksioma spektroskopis NMR: "Sampah di =
Sampah habis". Dengan kata lain, jika spektra berkualitas buruk dan memiliki sinyal yang buruk terhadap
kebisingan, semua metode akan berkinerja buruk. Di sisi lain, jika spektrum sebagian besar bebas noise,
hampir semua metode otomatis dan semi-otomatis akan bekerja dengan sangat baik [93]. Dalam keadaan
yang ideal adalah mungkin untuk pergi dari satu set spektrum yang diproses secara tepat ke satu set tugas
lengkap hanya dalam 10 detik. Strategi penugasan otomatis biasanya dilakukan melalui lima langkah
termasuk: 1) pengambilan dan referensi puncak; 2) pengelompokan spektrum atau spin; 3) identifikasi
sistem spin; 4) spin menghubungkan berurutan dan 5) memetakan spin yang terhubung ke urutan protein. Itu
INOVASI DALAM GENERASI DAN VALIDASI STRUKTUR 3D
Pembentukan struktur dalam NMR adalah proses yang secara inheren komputer intensif. Namun, sebagian
besar data yang dibutuhkan untuk pembuatan struktur masih harus dimasukkan dan divalidasi secara
manual. Akibatnya, sebagian besar inovasi terbaru dalam struktur generasi NMR telah difokuskan untuk
mengurangi penekanan pada entri data manual [4, 25]. Selain itu, sejumlah parameter spektral baru telah
muncul (RDC's,
jenis baru dari J-coupling, data relaksasi paramagnetik) dan sejumlah parameter utama spektral telah terbukti
lebih tepat dihitung (pergeseran NOE dan kimia). Dimasukkannya kendala baru ini, bersama dengan potensi
database empiris [107], juga telah menjadi fokus utama dalam pembentukan struktur protein selama lima
tahun terakhir. Hal ini karena banyak dari batasan baru ini dapat secara signifikan meningkatkan kualitas
struktur protein yang dihasilkan NMR [73]. Menggunakan batasan-batasan baru ini dalam pembentukan
struktur, setidaknya dari perspektif pengguna, relatif tidak menimbulkan rasa sakit. Ini karena hampir semua
program pembentukan struktur protein berdasarkan NMR bergantung pada dinamika molekul atau "mesin"
minimisasi energi seperti CNS / XPLOR [40], AMBER [108], CHARMM [109] atau DYANA [110] dengan
set ekstensif panjang ikatan empiris dan potensi obligasi. Program-program ini terus diperbarui oleh tim
programmer untuk mengakomodasi serangkaian parameter NMR terukur terbaru, sehingga penting bagi
pengguna untuk tetap mengikuti rilis terbaru.
Karena pembentukan struktur protein oleh NMR masih sangat bergantung pada data NOE, perbaikan dalam
analisis NOE telah menjadi fokus utama. Untuk waktu yang lama telah diakui bahwa salah satu hambatan
utama dalam penentuan struktur protein adalah penugasan NOE. Dalam banyak kasus ada NOE rancu yang
muncul dari proton yang memiliki pergeseran kimia yang sama atau hampir identik. Untuk protein yang
lebih besar, ternyata sebagian besar puncak hampa NOESY ambigu. Sebuah program yang disebut ARIA
(Ambiguous Restraints for Iterative Assignment) baru-baru ini dikembangkan yang berhubungan dengan
NOE yang ambigu dan secara otomatis menghasilkan struktur protein hanya dengan menggunakan daftar
tugas pemindahan bahan kimia dan daftar une assigned atau partially unse cross peaks [111]. ARIA
menggunakan pendekatan iteratif dan mengoreksi diri untuk menangani tugas NOE yang salah atau tumpang
tindih NOE. Keberhasilan ARIA telah menyebabkan pengembangan program generasi pembentukan
otomatis berbasis NOE lainnya seperti ATNOS [112] dan NOAH [113]. Mengingat spektrum kualitas yang
baik (atau daftar puncak) yang sesuai, metode ini dapat secara otomatis menghasilkan struktur 3D
berkualitas baik hanya dalam 10 menit.
Selain metode bebas tugas untuk pembentukan struktur (dibahas sebelumnya), ada kecenderungan yang
berkembang untuk mempercepat proses pembentukan struktur dengan mengintegrasikan data NMR ke
dalam prediksi struktur kuat atau metode pengenalan lipat. Integrasi ini mengarah ke metode pembuatan
struktur 3D yang menggunakan sedikit atau tanpa informasi NOE. Beberapa kelompok telah menggunakan
gagasan menggunakan pergeseran kimia, yang memberikan informasi struktur sekunder khusus residu [114],
sebagai kendala eksperimental untuk algoritma threading protein [115, 116]. Protein threading adalah teknik
prediksi struktur protein yang bergantung pada pengujian apakah urutan protein baru (dan parameter terukur
yang terkait dengan urutan itu) kompatibel dengan struktur PDB yang ada [117]. Dimasukkannya data
eksperimental muncul untuk meningkatkan keandalan penyambungan benang dan karenanya identifikasi
lipatan protein. Baru-baru ini, konsep pengalihan gulungan kimia telah diperluas ke titik di mana pergeseran
kimia secara iteratif dihitung dan digunakan secara langsung dalam potensial penguliran. Sebuah program
baru, yang disebut THRIFTY [7], yang menggunakan chemical shift threading tampaknya mampu
menghasilkan struktur 3D berkualitas tinggi tanpa informasi NOE.
NMR PROTEIN PENTING SECARA FARMASI
Penting untuk diingat bahwa protein dapat berfungsi sebagai obat dan target obat. Tentunya mereka yang
berada di industri biofarmasi cenderung melihat banyak protein sebagai kemungkinan atau obat-obatan
potensial. Memang, FDA telah menyetujui lebih dari 100 protein dan obat peptida termasuk berbagai faktor
pertumbuhan, hormon, antibodi dan kemokin. Ratusan lebih diharapkan akan disetujui dalam dekade
berikutnya. Di sisi lain, mereka yang masuk
disiplin farmasi yang lebih tradisional cenderung melihat protein terutama sebagai target untuk molekul
kecil. Memang, dari ribuan obat molekul kecil yang disetujui oleh FDA, lebih dari 95% dari mereka
menargetkan protein atau peptida tertentu. Terlepas dari apakah suatu protein sedang dipelajari sebagai obat
atau sebagai target obat, mengetahui sesuatu tentang strukturnya dapat membantu kita memahami cara
kerjanya (jika ingin menjadi obat) atau bagaimana ia dapat diaktifkan / dinonaktifkan (jika adalah menjadi
target obat).
NMR dapat memainkan peran dalam kedua bidang penemuan obat berbasis protein. NMR tidak hanya
mengungkapkan informasi struktural yang penting, tetapi juga memungkinkan para ilmuwan untuk
menyelidiki dinamika, interaksi dan kejadian yang mengikat yang penting untuk memahami tindakan obat
atau menemukan petunjuk baru, obat molekul kecil. Karena keserbagunaannya, NMR telah menemukan
sejumlah ceruk yang berguna dalam penemuan dan pengembangan obat yang dibantu oleh struktur,
khususnya di area di mana kristalografi sinar-X terbukti tidak memadai. Ini termasuk karakterisasi: 1) lebih
kecil, hormon atau peptida fleksibel; 2) protein yang lebih kecil, lebih tidak teratur atau lebih fleksibel; 3)
domain atau modul protein; dan 4) interaksi protein-ligan [4, 42]
Untuk mendapatkan gagasan yang lebih baik tentang peran NMR yang semakin meningkat dalam penemuan
dan pengembangan obat, daftar parsial peptida dan protein yang secara farmasi sangat penting yang telah
dipecahkan oleh NMR diberikan pada Tabel 1. Daftar ini mencakup nama protein / peptida, koordinat PDB
(X -ray atau NMR, mana yang lebih baru) dan nomor akses BioMagResBank. Penting untuk menunjukkan
bahwa tabel ini hanya mencantumkan koordinat yang disimpan publik dan pergeseran NMR dan itu tidak
termasuk lusinan protein lain yang sedang dipelajari oleh industri farmasi. Demikian juga, karena
keterbatasan ruang, tidak semua protein dari bunga biomedis dapat dimasukkan di sini.
Pemeriksaan tabel ini mengungkapkan bahwa ada lima kelas umum protein di mana NMR paling sering
digunakan. Ini termasuk kemokin (interleukin dan interferon), faktor pertumbuhan atau hormon (TGF, EGF,
BFGF, HGH), peptida antimikroba (hepcidins, bacteriocins, tachystatins), protein imunitas (FK506,
cyclophilin, defensins) dan target viral (HIV dan heptatitis) virus). Ini mencerminkan kekuatan khusus NMR
dalam menentukan struktur protein dan peptida yang lebih kecil dan lebih fleksibel. Dengan kemajuan
terbaru dalam teknologi NMR, protein yang lebih besar sedang ditangani dan kemungkinan lebih banyak
enzim (kinase, fosfatase, protease, enzim metabolik) akan muncul dalam waktu dekat. Memang, banyak
protein yang dipelajari oleh industri farmasi saat ini termasuk dalam kategori ini. Sayangnya, masalah
kerahasiaan mencegah informasi (koordinat, pergeseran kimia) tentang target ini dari dirilis secara umum.
Studi struktural oleh NMR banyak kemokin dan faktor pertumbuhan telah mengungkapkan bahwa situs aktif
mereka atau loop yang mengikat cenderung cukup fleksibel, dengan struktur yang relatif sedikit
didefinisikan [124, 125]. Hal ini berbeda dengan struktur yang kaku dan terdefinisi dengan baik yang sering
disiratkan melalui kristalografi sinar-X dari protein yang sama atau serupa. Menariknya, struktur kaku
diamati melalui X-ray sekarang tampaknya artefak, sebagian besar karena efek pengepakan kristal. Dalam
hal ini, NMR telah mengungkapkan wawasan kunci ke dalam kemokin / pertumbuhan faktor fungsi dan
aktivitas bahwa bisa tidak telah diperoleh melalui kristalografi. ternyata, ini aktif-situs keluwesan muncul
menjadi vital untuk memfasilitasi atau akomodatif protein- protein atau protein-reseptor interaksi [124-126].
memang, ini adalah sering mungkin untuk mengenali itu aktif situs dari protein melalui nmr oleh hanya
mencari hilang atau kurang baik diselesaikan puncak antara berurutan atau spasial proksimal residu. studi
dari aktif situs struktur dari pertumbuhan faktor dan kemokin memiliki juga memimpin dengan
pengembangan dari peptida / protein analog dan sebuah nomor dari berpotensi menarik kecil-molekul atau
minimal peptida obat memimpin [126-128]. didalam hal, itu struktural karakterisasi dari bakal protein obat-
obatan terlarang adalah memotivasi itu pengembangan dari bakal kecil-molekul obat analog. tentu saja tidak
semua protein dan peptida adalah potensi obat calon. memang itu luas mayoritas dari protein makhluk
belajar oleh itu industri farmasi adalah sebenarnya obat target - tidak obat memimpin. karena itu tujuan
adalah mengembangkan sebuah kecil molekul bahwa mengikat dengan protein, itu protein struktur (dan nmr
tugas) tidak sebuah akhir sendiri, tapi sebuah cara untuk sebuah akhir. di lain kata, protein-ligan interaksi
adalah apa banyak obat penemuan adalah tentang. nmr di obat penemuan - pemantauan ligan interaksi tidak
lain bentuk dari spektroskopi dan pasti tidak variasi dari x-sinar kristalografi bisa pertandingan nmr's hakiki
kemampuan untuk memantau dan menemukan protein-ligan interaksi. nmr adalah indah peka, berlaku
universal, kuantitatif, menerima untuk menganalisis kompleks campuran dan, sebagai kami telah terlihat
sudah, sanggup untuk menyediakan atom resolusi rincian dari ligand- protein mengikat [42, 129]. karena
dari besar sekali rentang dari konsentrasi di yang nmr sinyal bisa terdeteksi dan andal diukur (10-2 m untuk
10-6 m), nmr mampu untuk mendeteksi itu terlemah protein-ligan interaksi dari apa saja metode sejauh ini
diidentifikasi (i.e. millimolar mengikat konstanta). selanjutnya, karena nmr mendeteksi sebuah universal
berlimpah-limpah senyawa (proton), ini adalah mungkin untuk desain nmr-berdasarkan penyaringan
protokol tanpa apa saja sebelumnya pengetahuan dari sebuah protein fungsi, substrat atau substrat analog. di
lain kata, nmr eliminasi itu kebutuhan mengembangkan bioassay bahwa perlu khususnya dirancang
fluorophores, kromofor atau substrat analog. tambahan lagi untuk nya dekat-keuniversalan, nmr penawaran
hebat pendekatan untuk kuantitasnya ligan mengikat. itu kemampuan untuk menyelesaikan individu
resonansi selama sebuah nmr titrasi memungkinkan itu tepat penentuan dari mengikat konstanta, lepas tarif,
di tarif, alosterik interaksi dan banyak lain kineti- cally (dan termodinamika) penting parameter. further-
lebih, itu tingkat dari spektral resolusi ditawarkan oleh nmr cara bahwa puluhan senyawa bisa dipantau
serentak selama apa saja penyaringan atau titrasi proses. ini jelas memfasilitasi tinggi simpul lewatan
penyaringan dari ligan perpustakaan. sebaliknya, itu rendah spektral resolusi diberikan oleh uv, ir atau
fluoresensi berdasarkan metode cara bahwa hanya satu (atau paling banyak dua) senyawa dapat serentak
dianalisis selama mengikat tes. akhirnya, luar x-sinar kristalografi, nmr adalah satu-satunya spektroskopi
metode bahwa bisa memberikan tepat 3d struktural rincian tentang bagaimana dan di mana sebuah ligan
mengikat untuk sebuah protein. lebih itu lalu sepuluh tahun nmr peneliti, kedua dalam dan di luar itu industri
farmasi, memiliki terfokus sebuah besar transaksi dari usaha di pengilangan itu teknologi untuk mendeteksi
dan deconvolve protein-ligan interaksi. dasarnya dua dasar pendekatan memiliki muncul [129]. satu adalah
berdasarkan menggunakan nmr untuk mengamati perubahan dengan kecil molekul ligan (atau ligan) kapan
saya t mengikat dengan protein. ini disebut ligan-diamati penyaringan. itu lain pendekatan adalah
berdasarkan menggunakan nmr untuk mengamati perubahan dengan target protein kapan saya t mengikat
sebuah ligan (atau ligan). ini disebut target atau protein-diamati screen- ing. ini dua pendekatan memiliki
muncul untuk memudahkan itu penemuan dari memimpin senyawa, untuk peta itu mengikat situs dari
memimpin senyawa dan untuk memudahkan itu rasional desain dari lebih baik obat memimpin. ligan-
diamati penyaringan di ligan-diamati penyaringan, saya t tidak perlu untuk memiliki sebelumnya ditugaskan
itu protein target, maupun itu perlu untuk memiliki sebuah protein itu adalah khususnya menerima (kecil,
larut, stabil) untuk nmr studi. ini adalah karena itu resonansi bahwa adalah terdeteksi atau diukur adalah itu
dari ligan - tidak itu protein. di ligan-diamati penyaringan satu bergantung di mendeteksi nmr fenomena
bahwa adalah diperburuk oleh itu ukuran perbedaan antara itu besar protein target dan itu kecil molekul
ligan (ara. 5). khas, untuk ligan-berdasarkan studi bekerja itu disosiasi konstan (kd) harus menjadi antara 10-
7 dan 10-3 m dan itu massa perbedaan antara itu target protein dan bakal ligan harus menjadi lebih besar
dari 50 melipat. jika ini syarat-syarat adalah bertemu sebuah variasi dari khususnya dirancang nadi urutan ini
adalah mungkin untuk "filter" atau memilih untuk itu resonansi dari ligan bahwa pameran berbeda afinitas.
di cara ini ini adalah mungkin bekerja dengan campuran dari ligan, namun hanya melihat itu ligan dari
bunga dalam dihasilkan nmr spektrum [129, 130]. kapan kecil ligan transiently mengikat untuk sebuah
protein tiga hal terjadi. mereka difusi laju memperlambat, mereka baris lebar memperluas (cepat relaksasi)
dan mereka noe's bergeser dari positif untuk negatif (ara. 5). sebuah nomor dari anggun pendekatan telah
maju lebih itu lalu lima tahun yang mengeksploitasi itu pengukuran dari menurun difusi koefisien melalui
nmr. teknik seperti dosy (difusi memerintahkan spektroskopi - [130]), difusi termodulasi lereng nyaman
[131] atau diffu- sion-dikodekan tocsy [132] eksperimen telah developd yang mengizinkan molekul (dan
berputar) untuk berpisah oleh mereka difusi koefisien. bergantian, perubahan di linewidth (atau t2) atau lain
magnetik relaksasi tarif (t1 atau t1ρ) antara ligan resonansi bisa juga digunakan untuk mendeteksi sementara
mengikat [129]. di ini eksperimen itu difusi filter adalah diganti dengan sebuah relaksasi (berputar-gema
atau cpmg) filter. ini relaksasi metode khas tergantung pada mengurangkan "sebelum dan setelah" spektrum
di mana itu spektrum dari ligan sendirian adalah dikumpulkan pertama dan kemudian sebuah spektrum
dikumpulkan dengan itu protein menambahkan dengan ligan. kedua t1 dan t2 (baris lebar) berdasarkan
penyaringan metode telah diusulkan dan ditampilkan bekerja cukup baik [129]. lain rute untuk ukur ligan
interaksi adalah untuk mengeksploitasi itu perubahan di intramolekul proses mengisikan maknit transfer atau
ditransfer noe's [133]. ditransfer noe's (trnoe) membutuhkan agak khusus syarat-syarat di mana mengikat
konstanta adalah lemah dan lepas-tarif adalah cukup cepat. jika ini condi-
KESIMPULAN
Karena struktur protein kasar pertama ditentukan sekitar 20 tahun, NMR telah berevolusi dengan cepat
untuk menjadi pilar utama dalam biologi struktural. Tidak ada bentuk lain dari spektroskopi yang dapat
memberikan gambaran rinci struktur makro dan dinamika makro yang dapat ditawarkan oleh NMR. Namun
penting untuk diingat bahwa NMR dapat menjadi lebih dari sekedar alat elusidasi struktur protein. Memang,
menentukan struktur protein oleh NMR hanyalah langkah pertama dalam proses yang pada akhirnya dapat
mengarah pada penemuan dan pengembangan banyak produk atau gagasan yang secara farmasi penting.
Aplikasi potensial NMR di hampir semua aspek bioteknologi farmasi kemungkinan akan terus berkembang.
Mengingat cepatnya kemajuan teknologi dalam NMR dan kecenderungan yang semakin berkembang untuk
menyederhanakan banyak proses, kemungkinan NMR akan menjadi jauh lebih mudah diakses dan berguna
bagi komunitas peneliti farmasi yang jauh lebih besar.