View Article Online

Paper
RSC

Kemajuan RSC
View Article
Open
PAP Online
View Journal | View
Acces
s ER Issue

Articl
e. Identifikasi potensi inhibitor
Publis
hed on Kutip ini: RSC Adv., 2017, 7, 38479
polimerisasi tubulin oleh 3D-QSAR,
07 docking molekul dan dinamika
Augus
t
molekul †
2017.
Tian Chi Wang,‡ Li Ping Cheng, ‡* Xin Ying Huang, Lei
Down Zhao dan Wan Pang*
loaded
on Combretastatin A-4 (CA-4) adalah salah satu penghambat
14/08/ polimerisasi tubulin yang paling kuat. Dalam tulisan
2017 ini,pengidentifikasianbeberapa baru CA-4 analog sebagai
09:08: potensi inhibitor polimerisasi tubulin dilakukan oleh kombinasi
35. teknik pemodelan molekul termasuk 3D-QSAR, docking
molekuler dan dinamika molekul (MD) simulasi. Model 3D-
hisMenerima 17 April 2017 Diterima 5 Juli 2017 QSAR yang dibangun menunjukkan signifikualitas statistik tidak
article bisa dan kemampuan prediktif yang sangat baik. Korelasi
DOI: 10.1039 / c7ra04314g
is persegi koefisienFFIsien(r2)dan cross-divalidasi kuadrat
rsc.li/rsc-advances
license koefisien korelasiFFIsien(q2)dari CoMFA adalah 0,974 dan
d 0,724; r2 dan q2 dari CoMSIA adalah 0,976 dan 0,710, masing-
under masing. Untuk lebih jauh memverifikasi keandalan model,
a aktivitas penghambatan analog CA-4 sintetik kami dengan
Creati polimerisasi tubulin dievaluasi dan diperkirakan. Sangat menarik
ve untuk find bahwa nilai prediksi dari model 3D-QSAR berada
Comm dalam perjanjian baik dengan nilai-nilai eksperimental.
ons Beberapa inhibitor baru dirancang dan diprediksi. Docking
Attrib molekuler menjelaskan konformasi senyawa dan residu asam
amino utama di situs aktif protein tubulin. 30 ns simulasi MD
berhasil dilakukan untuk confirm modus mengikat rinci dan
menghitung energi bebas mengikat. Beberapa baru CA-4
analog yangdiidentifikasisebagai baik potensi inhibitor
polimerisasi tubulin.

Pendahuluan antara combretastatin, CA-4 (Gbr. 1), diisolasi dari pohon

Afrika Selatan, Combretum caffrum,8 sangat menghambat
Mikrotubulus, yang dibentuk oleh polimerisasi ab-hetero- polimerisasi tubulin dengan mengikat ke situs colchicine. Seperti
dimertubulin, merupakan komponen penting dari struktur sel dan yang terlihat dari Gambar. 1, fitur farmakologi CA-4 terdiri dari
terlibat dalam banyak proses seluler penting termasuk mitosis, 3,4,5-trimetoksi substitusi di ring A,kelompok 4-metoksi pada
morfogenesis, pengangkutan dan sekresi intraseluler. 1 Salah satu peran cincin B dan cis-conftgurasiantara cincin A dan B.CA-4
paling penting untuk agen antivaskular adalah merusak tubulin- menunjukkan sitotoksisitas yang kuat terhadap berbagai sel kanker,
dinamika mikrotubulus, menginduksi penangkapan mitosis dan termasuk garis sel kanker multi-obat. Itu juga telah
menyebabkan kematian sel.2 Jadi protein tubulin juga termasuk di
menjadi target utama untuk penemuan obat antikanker di masa lalu
dekade.3,4 Agen antimitotik memainkan peran penting dalam obat
antikanker saat ini.
Ada tiga situs pengikatan molekul kecil yang berbeda dalam
tubulin, yaitu situs pengikatan taxane, situs pengikatan vinca, dan
situs pengikatan colchicine.5 Taksan dan alkaloid vinca telah berhasil
digunakan dalam terapi klinis untuk kanker. 6 Sementara colchicine, View Article Online

senyawa
RSC ampuh, telah tertahan oleh toksisitas pada jaringan normal
pada effkonsentrasi obat efektif. Tetapi keluarga combretastatin dari
agen situs pengikat colchicine sedang mengalami kemajuan melalui
uji klinis untuk perawatan kanker.2,7

Sekolah Teknik Kimia dan Lingkungan, Institut Teknologi Shanghai, Shanghai 201418,
Cina. E-mail: chengliping@sit.edu.cn; pangwan@sit.edu.cn
† Elektronik tambahan informasi (ESI) yang tersedia.Lihat DOI:
10,1039 / c7ra04314g Gambar. 1 Struktur CA-4 dan CA-4P, dan beberapa analog CA-4 yang
‡ Kedua penulis (Tian Chi Wang dan Li Ping Cheng) kontribusi sama untuk pekerjaan ini disintesis.
dan harus dianggap sebagaicoftpenulispertama.

Paper
ditunjukkan untuk mengerahkan sangat selektifeffEctsdi berkembang
biak sel endotel.9 Namun, CA-4 suffers dari kelarutan miskin air,
bioavailabilitas rendah, dan pendek biologis paruh. 10 Untuk mengatasi
keterbatasan ini, air yang larut prodrug fosfat dari combretastatin A4
Open (CA-4P, Gambar. 1) telah dieksplorasi dan saat ini sedang dalam uji
Acces klinis untuk pengobatan tumor padat.11
s Karena aktivitasnya yang kuat sebagai kandidat antikanker yang
Articl potensial, sejumlah analog CA-4 telah dirancang dan disintesis. Hall
e. et al.12 telah dirancang dan disintesis delapan triuorinated
Publis mengandung nitrogen analog combretastatin dan dilakukan evaluasi
hed on biokimia dan biologi awal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa (Z)
07 -2- (40-metoksi-30-aminophenyl) -1- (3,4,5-triuorophenyl) etana
Augus ditemukan sebagai penghambat potensial rakitan tubulin (IC 50) ¼ 2,9
t mM). Pinney et al.13 telah menyiapkan dua analog aryl azide CA-4
2017. baru, yang keduanya berinteraksi dengan tubulin. Analog CA-4 aryl
Down azide ini juga menghambat pengikatan colchicine ke tubulin, seperti
loaded halnya induk CA-4. Alloatti et al.14 telah dilakukan sintesis dan
on evaluasi biologis dari serangkaian analog combretastatin uorinated
14/08/ dengan memperkenalkan atom F ke dalam ikatan ganda dari cis-
2017 stilbene bagian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa posisi atom
09:08: uorine pada ikatan ganda mungkin sebuahffect penghambatan
35. polimerisasi tubulin dan aktivitas sitotoksik. Dalam perjalanan
mencari obat antitumor sintetis baru, penting kami telah difokuskan
hispada modiftkation untuk B cincindari CA-4. Sebagai contoh, kami
baru-baru ini merancang dan mensintesis serangkaian analog CA-4
article
is baru.15 Hasil menunjukkan bahwa beberapa senyawa, seperti sit-1, sit-
2, sit-4, dan sit-8 (Gbr. 1), memiliki aktivitas anti-proliferatif yang
license
d kuat terhadap beberapa garis sel kanker. Keberhasilan ini menerangi
kami untuk merancang dan mensintesis turunan antikanker CA-4 yang
under
a lebih kuat. Di sisi lain, sebagai yang disebutkan di atas, pengenalan F
atom ke analog combretastatin adalah effmetodeefektif untuk
Creati
ve merancang dan mensintesis inhibitor tubulin baru. Pada penelitian ini,
kami ingin lebih memodifikasi struktur CA-4 dengan pengenalan atom
Comm
onsF atau uorine- mengandung gugus dan berharap untuk memberikan
dasar bagi ment mengembangkan- dari ampuh inhibitor polimerisasi
Attrib
tubulin baru.
Seperti dijelaskan di atas, untuk mendapatkan inhibitor tubulin
baru, besar effort telah dibuat dalam penelitian eksperimental. Namun,
studi teoritis tentang mekanisme senyawa ini menuju tubulin serta
faktor struktural yang bertanggung jawab atas sitotoksisitas tetap
terbatas. Sebuah studi pemodelan molekul menggunakan Comparative
Molecular Field Analysis (CoMFA) dilakukan untuk mengembangkan
model prediktif untuk analog combretastatin. 16 Model dibangun secara
akurat dapat memprediksi IC50 untuk polimerisasi tubulin dengan r2
0,88(n ¼ 6) dan orang-orang[3H] colchicine perpindahan dengan r2
0,80(n ¼ 7). Penelitian ini merupakan ftpertama model prediktif untuk
colchicine situs mengikat atas serangkaian 23 analog combretastatin.
Metode Docking dan CoMFA secara sintetis diterapkan untuk
mempelajari serangkaian 32 CA-4 analog sebagai penghambat tubulin
di situs pengikatan colchicine.17 Dalam tulisan ini, orientasi pengikatan
yang sesuai dan konformasi senyawa yang berinteraksi dengan tubulin
diungkapkan oleh studi docking; dan model 3D-QSAR dengan
signifikanfttidak bisa kualitas statistik dan pabrik satis- kemampuan
prediksi didirikan. ab-Tubulin colchicine inhibitor site (CSIs) dari
empat scafftua dimodelkan untuk lebih memahamiefeknyapada
mikrotubulus.18 Studi ini
View Article Online
berhasil memecahkan masalah bagaimana menangani RSCstruktur
target resolusi rendah. Zhang et al. telah melakukan studi 3D-
19
QSAR tentang analog combretastatin A-4 menggunakan metode
CoMFA berdasarkan docking molekuler. Model QSAR yang
dibangun secara statistik signifikanfttidak bisa dan memiliki
prediktabilitas yang tinggi. Hasilnya dapat memfasilitasi desain
inhibitor tubulin baru dengan keanekaragaman kimia yang baik.
Dibandingkan dengan studi sebelumnya yang luar biasa, pekerjaan
kami lebih komprehensif dan meyakinkan. Dalam karya
ini,identifikasiftdari beberapa baru CA-4 analog sebagai poten-
esensial polimerisasi tubulin inhibitor dilakukan oleh gabungan
3D-QSAR, docking molekular, dan teknik simulasi MD. 3D-QSAR
melibatkan teknik seperti CoMFA dan CoMSIA digunakan untuk
mengidentifikasi faktor-faktor struktural utama dipengaruh pada
aktivitas penghambatan. Dibandingkan dengan CoMFA, CoM-SIA
dikenal sebagai salah satu metode 3D-QSAR yang lebih baru.
Nique tech- ini paling sering digunakan dalam penemuan obat
untuk kakind fitur-fitur umum yang penting dalam mengikat
reseptor biologis yang relevan. Keandalan dari model yang
dibangun telahveri lanjutfted oleh hasil eksperimen. Docking
molekuler telah dilakukan untuk mempelajari mode pengikatan
inhibitor menggunakan struktur kristal tubulin di situs pengikatan
colchicine. Simulasi MD telah dilakukan untuk menghitung energi
bebas yang mengikat melalui MM / GBSA dan MM / PBSA.
Simulasi MD dan perhitungan energi bebas mengikat telah terbukti
sangat berguna dan berhasil dalam merancang molekul obat baru
yang potensial. Hasil teoritis akan membantu tim peneliti kami dan
lainnya untuk merancang dan mensintesis analog CA-4 yang lebih
kuat.
Bahan dan metode
Optimasi molekul dan penyelarasan basis data
Pemodelan molekul dan studi 3D-QSAR dilakukan dengan
menggunakan paket pemodelan molekul SYBYL-X 2.1 (Tripos,
Inc., USA). Semua struktur yang diminimalkan oleh BFGS 20
dengan kekuatan MMFF94 ftlapangan dan MMFF94 biaya.21 Iterasi
maksimum untuk minimalisasi ditetapkan ke 1 000 000.
Minimalisasi diakhiri ketika kriteria konvergensi gradien energi
0,005 kkal mol-1 A-1 tercapai. Untuk mendapatkan perataan yang
konsisten, metode perataan basis data dilakukan.
Pemodelan CoMFA dan CoMSIA Model
3D-QSAR melibatkan teknik seperti CoMFA dan CoMSIA untuk
mengkorelasikan aktivitas biologis dengan struktur senyawa 3D.
Nilai CoMFA dilakukan menggunakan deskriptor sterik dan
elektrostatik. Nilai-nilai CoMSIA dilakukan dengan menggunakan
deskriptor akseptor ikatan hidrogen, sterik, elektrostatik,
hidrofobik, donor, dan deskriptor akseptor ikatan hidrogen.partial
least square (PLS)22 Analisisdigunakan untuk mendapatkan model
3D-QSAR. Dalam analisis PLS, dua variabel laten berdasarkan
pada deskriptor CoMFA digunakan dalam model PLS, dan enam
variabel laten berdasarkan deskriptor CoMSIA digunakan dalam
model PLS. Analisis regresi dilakukan dengan menggunakan
metode validasi silang leave-one-out (LOO). Semua 3D-QSAR
hasil peta kontur yang grafis diwakili dengan menggunakan
ftjenisbidang “STDEV*Coeff”.
 View Article Online

RSC
 View Article Online

Papervalidasi
Model
(diprediksi dibandingkan kegiatan yang diamati, atau RSCdiamati
Beberapa parameter statistik yang digunakan untuk analisis berdiri atau dibandingkan kegiatan diprediksi), yaitu R0 atau R02 harus dekat
2

jatuh dari model yang dibangun, termasuk klasik persegi korelasi yang dengan R2.(3) Setidaknya satu 0 kemiringan (k atau k0) dari garis
Open tion koefisienFFIsien(R2), Fnilai-nilai -statistic(F),dan standard error regresi melalui titik asal harus mendekati 1 (akan sesuai dengan
2
Acces dari estimasi (SEE). Namun, ini parameter statistik tidak suFFIefisien R0 atau R02 yang lebih dekat dengan 0 R2). Korelasi
2
s untuk memeriksa kemampuan prediksi model. Jadi, untuk koefisienFFIsien(R),lereng(k, k0), R0 dan R02 dihitung dengan 0

Articl menggunakan eqn 7-11, masing-masing.

selanjutnya memeriksa kemampuan (7)
e. X .
Publis prediktif model, validasi internal, eksternal, Y tes Y tes Ypred tes Y pred uji

hed on
dan keseluruhan dilakukan. Untuk R ¼ q FFI X Σ
ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi ð ðY—
YpredðtestÞ —Y
test Y
—predðtestÞ
07 internal validation of model, parameters such as predicted residual testÞ
ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi2ffiff Þ —
Augus sum of squares (PRESS), root mean square error of the X.ð Þ Σ
iffi X ðÞ
t ffiffiffiffiffiffiffi.ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiff
2017. iffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiff
Down iffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi Σ
loaded ffiffiffi2FFI
on
14/08/
2017
Yuji$Ypred tes
X. Σ (8) k¼
estimasi (RMSEE), dan lintas-
09:08: YpredðtesÞ 2

35.
divalidasi kuadrat koefisien
korelasiFFIsien(q2)yang digunakan.
The PRESS, RMSEE, dan q2 nilai
his
dihitung dengan menggunakan eqn
article
(1)-(3),23 masing-masing.
is
license
d
n
X X. Σ (9)
ð Yuji$YpredðtesÞ
under k0 ¼
a (1)
Creati 2

ve
Comm PRESS ¼ e X
ons i-1

Attrib

ð
Y
u
j
i

s ffiffiffiffiPffiffiffiRffiffiffiEffiffiffiSffiffiffiSffiffiffiffiffiffi X. Σ2
Y - k$Y

ntraining — 2

RMSEE ¼ (2) R2¼1-

predðtesÞ predðtesÞ
(10) XΣ
. predðtestÞ predðtestÞ
—2Y
predðtestÞ predðtestÞ Y
X
ðY —kY 0

q2 ¼ 1 TEKAN Þ 2
0 2
- P. (3)
Σ2 02

Y -Y
tes

uji
 (11) View Article Online

RSC obsðpelatihanÞ R0 ¼ 1 - X
pelatihan tes
ðY - Y ujiÞ

Dalam eqn (1), e(i) menunjukkan diffperbedaan-perbedaan antara Dalameqn 7-11, Yuji dan Y¯ uji mewakili eksperimental dan
diamati dan diprediksi Y-valuesdari training set. Dalam persamaan (2), rata-rata nilai aktivitas molekul tes, Ypred (test) merupakan nilai
npelatihan adalah jumlah molekul pelatihan. Yobs (pelatihan) dan Y¯ pelatihan aktivitas prediksi molekul tes.
repre- terkirim diamati dan rata-rata nilai aktivitas molekul pelatihan Untuk lebih memeriksa kemampuan prediksi model, kami telah
di eqn (3). Nilai q2 yang tinggi (q2 > 0,5) umumnya dianggap sebagai
menghitung beberapa metrik novel seperti rm (LOO)2, rmðLOOÞ2,dan
bukti kemampuan prediksi model yang tinggi.24,25
Untuk benar-benar memperkirakan kekuatan prediksi model, satu Drm (LOO)2 untuk validasi internal rm (test)2, rmðtesÞ2,dan Drm (test)2 untuk
set uji yang terdiri dari 10 molekul untuk validasi eksternal digunakan. validasi eksternal. rm(keseluruhan)2, rmðkeseluruhanÞ2, dan Drm (keseluruhan)2
untuk
validasi keseluruhan.28 The r 2
dan r02 dihitung dengan menggunakaneqn
akarmean square error dari prediksi m m
(RMSEP), diprediksi koefisien (12) dan (13), masing-masing.
korelasiFFIsien(rpred2)dan berarti mutlak .
q ffi.ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi.ffi Σ
kesalahan (MAE)
dihitung dengan menggunakan eqn (4)-
( 6),23,26 masing-masing.
sffiffiffirm ¼ r 1 -
2 2
.r2 - r02. (12)
(4)
ffiffiffiffi
RMSEP ¼ PRESS ffiffiffiffir02 ¼ r2.1 -
ntest
ffiffiffiffi r ffi.FFIrffiffi2ffiffiffi- (13) m0

ffiffiffiffiffirFFI0FFI2ffif

fi...ffi Σ

rpred 2 PRESS
(5) Dalam persamaan di atas, r2, r02,
¼1- SD dan r02 adalah penentuan 0
obsðtestÞ
MAE
- YpredðtestÞ . koefisienhubun
n (6)
1 ganlinier antara
¼ nilai yang
diamati dan yang
X. diperkirakan dari
Y
pelatihan atau
senyawa uji.
Perhitungan
untuk nilai r2,
r02, dan r02
sesuai dengan
metode
0
Dalam persamaan (4), nuji adalah jumlah molekul uji. Dalam disediakan oleh kelompok Roy.28 Nilai r 2 dan r02 (dihitung
persamaan (5), SD
m m
berarti jumlah deviasi kuadrat antara aktivitas eksperimental senyawa dengan menukar sumbu) harus dekat. rm2 (rata-rata r 2 m
dalam set tes dan aktivitas rata-rata dan r02)nilai harus lebih besar dari 0,5 untuk diterima
2) m
dari molekul pelatihan. Untuk model QSAR Model. The diffselisih antara rm2 dan r02 (Dr harus menjadi m
m
prediksi rpred2
nilai harus lebih tinggi dari 0,5,24,25 dan nilai MAE harus memenuhi lebih rendah dari 0,2.
MAE # 0,1 × pelatihan berbagai set.26 Golbraikh A dan Tropsha A27
telah merumuskan kriteria berikut untuk mengukur kemampuan
validasi eksternal model: (1) nilai tinggi dari cross-valided R2(q2). (2) Docking molekuler Docking
Korelasi koefisienFFIefisien R antara kegiatan diprediksi dan diamati molekuler dilakukan menggunakanSurmodulex-Dock di
senyawa dari tes eksternal diatur dekat dengan 1. Setidaknya satu (tapi SYBYL-X 2.0. Struktur kristal kompleks tubulin diambil dari
lebih baik keduanya) darikoefisien korelasiFFIkoefisienuntuk regresi RCSB Protein Data Bank (PDB ID: 3UT5 (ref. 29)). Kompleks
melalui asal dengan pembentukan colchicine oleh rantai C dan D dari
 View Article Online

Paperheterodimer dipertimbangkan untuk docking. Ligan merapat

tubulin
ke situs colchicine oleh fungsi penilaian empiris dan mesin pencari
yang dipatenkan. Protein disiapkan dengan menggunakan modul
biopolimer yang diimplementasikan di Sybyl. AMBER7 FF99
Open muatan30 ditugaskan untuk atom protein. Cara docking otomatis
Acces diterapkan.
s (PPB),ADMET_Alog Ppesawat98, dan kutub luas permukaan
Articl Simulasi Molecular Dynamics (MD) Simulasi
e.
Publis MD dilakukan oleh paket Amber 12.0. 31 The ff99SB kekuatan
hed on ftlapangan digunakan untuk protein, dan gaya AMBER umum
07 ftlapangan (gaff)digunakan untuk ligan. Semua simulasi MD
Augus mengikuti prosedur minimalisasi, pemanasan, kepadatan,
t keseimbangan, dan produksi. Pada awalnya, seluruh sistem suFFered
2017. dari minimisasi energi dalam
Down dualangkah berikut. Pertama, posisi atom dari semua spesies zat
loaded terlarut tertahan oleh gaya 100 kkal mol -1 A˚-2. Kedua, seluruh sistem
diminimalkan tanpapengekangan
on
syarat. Seluruh sistem diminimalkan dengan 1000 langkah metode
14/08/
penurunan curam diikuti oleh 4000 langkah metode gradien
2017
terkonjugasi. Kemudian sistem dipanaskan dalam NVT ansambel dari
09:08:
0 hingga 300 K lebih dari 20 ps, diikuti oleh kesetimbangan dalam
35.
ansambel NPT pada 300 K lebih dari 100 ps. Dalam proses ini,
algoritma SHAKE32 diterapkan pada semua ikatan yang melibatkan
his
atom hidrogen, dan dinamika Langevin digunakan untuk kontrol suhu.
article
Akhirnya, menjalankan produksi 30 ns dilakukan oleh ensemble NPT
is
pada 300 K dengan 1,0 atm. Lintasan koordinat dicatat setiap 2 ps
license
untuk seluruh proses MD. Visualisasi dan analisis dilakukan dengan
d menggunakan VMD.33 RMSD dan analisis cluster dilakukan untuk
under
senyawa yang dipilih menggunakan program Xmgrace.
a dan 1 mM 2-mercaptoethanol. Pada ftsikluspertama dari
Konformasi yang diperoleh dari simulasi MD digunakan untuk
Creati
perhitungan energi bebas mengikat berikut. Mekanika Molekul /
ve
Poisson-Boltzmann Area Permukaan (MM / PBSA) 34 dan Mekanika
Comm
Molekul / Area Permukaan Lahir Umum (MM / GBSA) 35 digunakan.
ons
Persamaan perhitungan yang sesuai tercantum sebagai berikut:
Attrib
DGmengikat ¼ DH - TDS z DGgas + DGsol - TDS;
DGgas ¼ DEele + DEvdw; DGsol ¼ DGPB / GB + DGSA
di mana DGgas adalah energi interaksi gas-fase antara protein dan
ligan, itu termasuk DEele (elektrostatik), dan DEVDW (van der Waals)
energi. DGsol adalah jumlah energi elektrostatik solvasi (kontribusi
polar), DGPB /GB,dan komponen solvasi nonelectrostatic (kontribusi
nonpolar), DGSA.Perubahan entropi konformasi(-TDS)pada ligan
mengikat diabaikan karena biaya komputasi mahal dan entropi yang
sama karena ligan mengikat protein yang sama. 36 Semua komponen
energi dihitung menggunakan 50 foto yang diekstraksi dari 28 hingga
30 ns.
Deskriptor utama dan properti ADMET Properti
absorpsi, distribusi, metabolisme, eliminasi, dan toksisitas (ADMET)
diprediksi menggunakan deskriptor ADMET. Modul ini menggunakan
enam model matematika untuk
mengukur karakteristik prediksi dengan seperangkat RSC aturan
ambang karakteristik ADMET berdasarkan informasi obat yang
tersedia. Parameter yang dimasukkan dalam analisis adalah
penyerapan usus manusia (HIA), kelarutan dalam air, penetrasi
sawar darah otak (BBB), penghambatan enzim sitokrom P450_2D6
(CYP2D6), hepatotoksisitas, pengikatan protein-protein
(PSA). Berdasarkan perhitungan ALOG P (ADMET_Alog P98)
dan luas permukaan kutub 2D (PSA_2D), model ini dikembangkan
menggunakan ftve senyawa. Kelarutan berair ADMET
memprediksi kelarutan masing-masing senyawa dalam air pada 25
○
C. Kelarutan berair memiliki tingkat 1 (tidak, sangat rendah tetapi
mungkin), 2 (ya, rendah), 3 (ya, bagus). Model penghalang otak
darah ADMET memprediksi penetrasi otak darah (sawar darah
otak, BBB) dari molekul setelahpemberianoral. Tingkat 0, 1, 2, 3,
dan 4 menunjukkan sangat tinggi, tinggi, sedang, rendah
danundeftned masing-masing. Model pengikatan protein plasma
ADMET memprediksi apakah senyawa tersebut mungkin sangat
terikat dengan protein pembawa dalam darah. Pengikatan
ADMET_CYP2D6 memprediksi penghambatan enzim sitokrom
P450_2D6 menggunakan struktur kimia 2D sebagai input. ADMET
hepatotoksisitas memprediksi berbagai potensi hepatotoksisitas
manusia dari beragam senyawa struktural.
Dalamtabungin vitro ujitubulin polimerisasi
protein mikrotubulus otak babi diisolasi oleh tiga siklus perakitan /
pembongkaran tergantung suhu menurut Shelanski et al.37 dalam
100 mM PIPA (pH 6.5), 1 mM MgSO4, 2 mM EGTA, 1 mM GTP
polimerisasi, gliserol dan phenylmethylsulfonyl
uoride ditambahkan ke 4 M dan 0,2 mM, masing-masing.
Tubulin homogen dibuat dari protein mikrotubulus dengan
kromatografi fosfoselulosa (P11). puriftProteineddisimpan di
○
aliquots di -70 proteinC. Tubulin dicampur
dengandiffkonsentrasierent dari YHHU0895 di PEM buffer (100
mM PIPA, 1 mMMgCl2,dan 1 mM EGTA) yang berisi 1 mM GTP
dan 5% gliserol. Polimerisasi mikrotubulus dimonitor pada 37 ○C
dengan hamburan cahaya pada 340 nm menggunakan
spektrofotometer SPECTRA MAX 190 (Molecular Device). Nilai
absorbansi dataran tinggi digunakan untuk perhitungan. Tingkat
polimerisasi setelahinkubasi20 menit ditentukan. Nilai IC50
ditentukan secara grafis oleh GraphPad Prism v5.0 jadiware.
Hasil dandiskusi
Datamenetapkan
Untuk membangun sebuah model 3D-QSAR prediksi global untuk
bition inhi- dari tubulin polimerisasi, berbagai CA-4 analog,
dengan jembatan kepala dua-atom, dikumpulkan dari
serangkaiandistudi erentff.12-14,38-45 Struktur dan aktivitas
penghambatan terhadap polimerisasi tubulin ditunjukkan pada ESI
(Tabel 1S †). Namun, masalah yang dihadapi bahwa data
daridiffsumber erentsulit untuk membandingkan dan menganalisis.
Selain itu, nilai-nilai aktivitas CA-4 tidak sama dalamdiff.studi
erent Untuk melenyapkan kesalahan data nate daridiff,sumber
erent metode normalisasi pengolahan data yang digunakan dalam
penelitian ini. Rinciannya sebagai
 View Article Online

RSC
 View Article Online

Paper
RSC
Tabel 1 hasil statistik untuk CoMFA dan CoMSIA model
parameter statistik CoMFA CoMSIA

q2 0,724 0,710
Open
ONC 6 7
Acces r2 0,974 0,976
s r 2 0,748 0,687
pred
Articl
e.
Publis
hed on
07
Augus
Gambar. 2 Distribusi kegiatan penghambatan training set dan senyawa
t uji set di Analisis 3D-QSAR.
2017. 0

Down
k0 0,851 0,874
loaded berikut: semua data dinormalisasi ke nilai eksperimental untuk 2
0,974 0,974
m(LOO)
on r
14/08/ r 0

2017 combretastatin A-4 dari kertas di mana data 2 0,974 0,976

mðLOOÞ
09:08: diambil.
35. Nilai aktif CA-4 diatur ke 1, terkoreksi IC50 (IC50c) ¼ IC50 rmðLOOÞ 2 0,974 0,976
(gabungan) / IC50 (CA-4). Jika satu senyawa memiliki aktivitas lebih Drm (LOO) 2
0,000 0,000
histinggi dari CA-4, IC50c-nya kurang dari 1, dan sebaliknya. Kemudian PRESS(LOO) 0,226 0.210
RMSEE 0,069 0,066
IC50c
article
is nilai yang dikonversi ke logaritma negatif dari nilai-nilai ini 2
0,698 0,620
m(test)
license
d
r
under
(Pic50nilaic), yang digunakan sebagai 2 0,514 0.390
mðtesÞ r
a variabel dependen dalam model 0
3D-QSAR. The CoMFA dan CoMSIA
Creati
ve deskriptor adalah
Comm rmðtesÞ 2 0,606 0,505
ons
Attrib

senyawa dipilih berdasarkan distribusibiolog-

2
r 0,948 0,943
2 m(overall)
ical data dan keanekaragaman struktural 0,906 0
0,891
mðkeseluruhanÞ 2
(Gbr. 2 dan Tabel 1S †). Model membantu Drm (keseluruhan) 0,042 r 0,052
kita memahami struktur-hubungan aktivitas
menjadi kelompok 0,289 0,359
MAEpelatihan 0,050 0,047 pelatihan 50 senyawa
MAEtes 0,149 0,152 (83,3%) dan satu set
0,1 × pelatihan set 0,174 tes 10
kisaran PRESS(tes)
MELIHAT 0,073 0,071 senyawa (16,7%), 0,170 0,189
F 270,623 244,906 masing-masing.
R 0,934 0,915 Pelatihan dan tes
0,8 0,8 menetapkan
R2 73 37 RMSEP
0,9 0,9
R02 dari kelas senyawa ini dan memfasilitasi desain inhibitor baru dengan
90 99
0,946 0,962 aktivitas yang baik. Dalam studi 3D-QSAR, aturan penyelarasan dan
R02 pemilihan konformasi biologis adalah dua faktor penting untuk
k 1,056 0,997
membangun model yang andal. Dalam penelitian ini, senyawa CA-4
digunakan sebagai 0,184 0,230 dipilih sebagai molekul templat. Gambar 1S (lihat ESI †) menjelaskan
variabel independen. substruktur umum untuk penyelarasan dan
Sampel secara acak
dibagi
Drm (tes)2
PRESS(keseluruhan) 0,515 0,568 View Article Online
penyelarasan
RSC molekuler dari set pelatihan.

CoMFA dan CoMSIA hasil statistik

Hasil statistik untuk ftnal CoMFA dan CoMSIA model dirangkum
dalam Tabel 1. Model CoMFA memberikan divalidasisilang q2 dari
0,724 dengan jumlah optimal komponen (ONC) 6 dan korelasi persegi
coeFFIsien r2 dari 0,974.
standar estimasi error (SEE)adalah 0,073 dan nilai F-statistic
Akseptor ftladang. Seperti yang tercantum dalam Tabel 1, nilai
CoMFA rpred2 adalah 0,748 dan nilai CoMSIA rpred2 adalah
0,687.MAEPelatihan (0,050 untuk CoMFA, 0,047 untuk CoMSIA)
danMAEtes (0,149 untuk CoMFA, 0,152 untuk CoMSIA) nilai
keduanya kurang dari kisaran 0,1 pelatihan yang ditetapkan
× R2 adalah
(0,174). Nilai CoMFA R2 adalah 0,873 dan nilai CoMSIA
0,837. Nilai R 2 (0,990 untuk CoMFA, 0,999 untuk CoMSIA) dan
nilai R02
0 0

adalah 270,623. Yang sesuai sterik dan elektrostatik (0,946 untuk CoMFA, 0,962 untuk CoMSIA) nilai-nilai keduanya
ftdeskriptorlapangan menjelaskan 38,7% dan 61,3% dari total varian, dekat dengan R2 nilai. Lereng k (1,056 untuk Nilai CoMFA, 0,997
masing-masing. Kontribusi utama dalam model ini adalah elektrostatik untuk CoMSIA) dan k0 (0,851 untuk CoMFA, 0,874 untuk
ftlapangan. Untuk model CoMSIA, fttelah descriptor ftmedan (sterik, CoMSIA) keduanya mendekati 1. Oleh karena itu, model yang
trostatic elektroforesis, hidrofobik, hidrogen ikatan-donor, dan dikembangkan memiliki kemampuan prediksi yang baik dan dapat
hidrogen digunakan untuk desain senyawa baru dengan
aktivitas yang ditingkatkan. nilai r 2 metrik,
akseptor ikatan) dipertimbangkan. Ini memberikan cross-divalidasi q2 dari 2 2 2 m

0,710 dengan ONC 7 dan persegi koefisien rm (test), rmðtesÞ2, rm (LOO), rmðLOOÞ2, rm (keseluruhan) dan rmðkeseluruhanÞ2
korelasiFFIefisien r2 semuanya lebih dari 0,5. Kebanyakan 2
dan r02 metrik,
diffperbedaan-perbedaan antara r
0,976. Standard error dari estimasi (SEE) nilai adalah 0,071 dan F- 2 2 2 m m

nilaistatistik adalah 244,906. The sterik, elektrostatik, hidrofobik, Drm (test), Drm (LOO),dan Drm (keseluruhan),kurang dari 0,2. Ini
donor H-obligasi, dan akseptor ftkontribusi bidang yang 11,5%, lebih lanjut menunjukkan kualitas prediktif yang baik dari model.
Sangat menarik bahwa nilai r2, r 2
, r02 ,r 2
25,3%, 19,7%, 19,3%, dan M(LOO) mðLOOÞ mðLOOÞ
2
24,2%, masing-masing. utama
kontribusi dalam model yang elektrostatik adalah sama, dan Drm (LOO) adalah 0,000 untuk kedua CoMFA dan
dan H-obligasi
 View Article Online

Paper
RSC

Lapangan kontribusi (%)

sterik 0.387 0.115
Elektrostatik 0,613 0,253
H-Akseptor - 0,242
Open
H-Donor - 0,193
Acces
Hidrofobik - 0,197
s
Articl
e.
Gambar. 3 Ploteksperimental versus nilai pICprediksi50nilaicuntuk
Publis
semua molekul berdasarkan pada model CoMFA (a) dan CoMSIA (b).
hed on
07
Augus
t Model CoMISA. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1,
2017. dibandingkan dengan kualitas statistik model CoMFA dan CoMSIA,
2
Down semakin tinggi nilai r ,
loaded
2 2
on r , r02 ,r menunjukkan prediktif internal
14/08/ m (LOO) mðLOOÞ mðLOOÞ 2

2017 m
09:08: kemampuan tentang CoMSIA sedikit lebih kuat; tetapi lebih rendah r m, r02, rm2
35. nilai untuk prediksi eksternal dan prediksi keseluruhan
puncak-Catekualitas statistik yang lebih miskin. Selain itu, r02 nilai
his(0.390) dari CoMSIA kurang dari 0,5, dan mðtesÞ

article Drm (test)2 nilai(0.230)

is lebih dari 0,2. Oleh karena itu, kami pikir kualitas statistik pICdiprediksi50c yanguntuk sit-1, sit-2, sit-4, dan sit-8 masingadalah
keseluruhan CoMFA lebih unggul dari CoMSIA. PIC
license -masing-0,333, -0,336, -0,421, dan -0,097. corre-
d eksperimental50c, prediksi pIC50c, dan residu antara nilai prediksi dan Nilai-nilaisponding CoMSIAadalah -0,399, -0,399, -0.568, dan
eksperimental ditunjukkan pada ESI (Tabel 2S †). Ploteksperimental
under -0,304, masing-masing. Dari hasil yang diprediksi meskipun ada
a versus pICprediksi50nilaicuntuk pelatihan dan set tes ditunjukkan pada sedikit perbedaan antara nilai yang diamati dan yang diperkirakan,
Gambar. 3a dan b untuk model CoMFA dan CoMSIA, masing-masing.
Creati urutan aktivitas untuk senyawa ini pada dasarnya konsisten kecuali
ve
Nilai pICdiprediksi50c yangmendekati nilai eksperimental dan untuk sit-8, dan kesalahan dapat diterima secara keseluruhan.
sebagian besar titik terletak pada garis diagonal, yang menunjukkan
Comm Perbedaan untuk sit-8 relatif lebih besar. Alasan yang mungkin
ons
bahwa nilai pICdiprediksi50c yangsesuai dengan nilai eksperimental dihasilkan dari senyawa ini adalah fosfat CA-4, sedangkan model
pIC c.
Attrib 50 dibangun berdasarkan turunan netral.

Model validasi eksperimental

Untuk lebih jauh memverifikasi keandalan dan kemampuan prediksi
model, aktivitas penghambatan yang sebelumnya kami sintesiskan
empat CA-4 analog, sit-1, sit-2, sit-4 dan sit-8, hingga polimerisasi
tubulin dicoba untuk dilakukan. mengevaluasi dan memprediksi dalam
penelitian ini. Plot dari tubulin percobaan enzim inhi- bition IC 50 hasil
ditunjukkan pada Gambar. 4. Sebagai perbandingan, CA-4 dievaluasi
sebagai senyawa referensi. Nilai ICeksperimental 50 untuk sit-1, sit-2,
sit-4, dan sit-8 masing-masing adalah 9,5 mM, 14,2 mM,
20,3 mM, dan 54,5 mM. Nilai ICsesuai50 yang untuk CA-4 adalah 2,9
mM. Nilai eksperimental pIC50c untuk sit-1, sit-2, sit-4, dan sit-8
adalah -0,515, -0,690, -0,845, dan -1,274 masing-masing. Di antara
keempat analog CA-4 ini, sit-1 memiliki aktivitas penghambatan
tertinggi. Sebagai perbandingan, aktivitas penghambatan mereka telah
diprediksi oleh model 3D-QSAR yang dibangun. Nilai CoMFA

RSC
Gambar. 4 Plotinhibisi enzim tubulin eksperimental IC50 hasilhasil.
Peta kontur CoMFA dan CoMSIA
Gambar. 5 dan 6 menunjukkan peta kontur sterik dan elektrostatik
dari CoMFA dan CoMSIA. Nilai default ftELD disukai dan tidak
disukai proporsi 80% dan 20% kontribusi tingkat. Hal ini dapat
diamati bahwa ftbidang dampak pada aktivitas penghambatan
polimerisasi tubulin dari peta kontur. Seperti ditunjukkan pada
Gambar. 5, faktor sterik diuencing pada aktivitasView dinyatakan
Article Online
dengan peta kontur hijau dan kuning. Kontur hijau (bulky
substitusi menguntungkan) dan kuning (bulky substitusi tidak
menguntungkan) masing-masing mewakili kontribusi tingkat 80
dan 20%. Wilayah hijau di dekat B-ring mengungkapkan bahwa
kelompok besar yang diperkenalkan pada posisi ini sangat
membantu untuk meningkatkan aktivitas. Sebagai contoh, pada C 3
posisidari B-cincin,urutan aktivitas penghambatan dari beberapa
senyawa adalah: 1 (-OH)> 2 (-H), 22 (-NO2)> 20 (-OH), 31 (-
TIDAK2)
> 30 (-H).Pada C4 posisidari B-cincin,aktivitas penghambatan
.Gambar 5 petaKontur dari CoMFA (a) dan CoMSIA (b) berdasarkan 22. sterik
medan:disukai (hijau) dan tidak disukai (kuning).
 View Article Online

Paper Bagian donor ikatan hidrogen harus meningkatkanRSC aktivitas

biologis. Sebuah ungu kecil di C 4 posisidari B-
cincinmenunjukkan bahwa substitusi oleh donor ikatan hidrogen
di lokasi mungkin menurunkan aktivitas penghambatan. Peta
Open kontur A-ring jauh dari kompleks, jadi kami tidak peduli.
Acces Seperti ditunjukkan pada Gambar. 7c, kontur magenta
s mewakili posisi di mana akseptor ikatan hidrogen akan
Articl beneftresmi untuk aktivitas penghambatan dan kontur merah
e. Gambar6 petaKontur dari CoMFA (a) dan CoMSIA (b) berdasarkan 22. menunjukkan bahwa kehadiran kelompok-kelompok akseptor di
Publis elektrostatik medan:.Elektropositif (biru) dan elektronegatif (merah). daerah ini harus menurunkan aktivitas penghambatan. A big
hed on magenta polyhedron near the B-ring suggests this region is
07 favored for hydrogen bond acceptor interactions. Another magenta
Augus contour map is at the bridged position near A-ring, suggesting that
t acceptor groups may increase activity. For example, the good
2017. activity of 22 appears to be partly dependent upon the presence of
Down acceptor group - F substituent at this site. A big red polyhedron
loaded covering the C4–C6 positions of A-ring indicates the presence of
on acceptor groups in this region will decrease inhibitory activity.
14/08/
2017
Molecular design of new inhibitors
09:08:
35. Based on the contour maps obtained from 3D-QSAR models and
the known synthesized CA-4 analogues, some new compounds
hisGambar. 7 peta kontur berdasarkan 22. (a) hidrofobik lapangan.(b) 22a–c were designed by introduction of various substituent
donor ikatan hidrogen lapangan.(c) Ikatan hidrogen akseptor lapangan.
article
groups into B ring of CA-4. The most active 22 was taken as
is
a template to design these new compounds. The structures and
license
order is: 48 (–NMe2) > 49 (–OCH3). The appearance of a large yellow the predicted pIC50c values of 22a–c based on CoMFA and
d
contour at C3 position of A-ring indicates that substitu- tion by bulky CoMSIA models are listed in Table 2. Table 2 shows that the pIC 50c
under
groups at this location will result in a lower inhibitory activity. For values of all designed new molecules are higher than those of CA-
a
example, at the C3 position of A-ring, the inhibitory activity order is: 4, suggesting their good inhibitory activity.
Creati
33 (–H) > 18 (–F) > 51 (–OCH3).
ve
As shown in Fig. 6, electrostatic factors inuencing on activity
were expressed with blue (electropositive groups are favorable to the MD simulations analysis
Comm
ons
activity) and red (electronegative groups are favorable to the activity) To clarify the dynamic interaction patterns between the inhib- itors
Attrib
contour maps. Fig. 6a and b show that the B-ring is partly covered by and tubulin, MD simulations were conducted for ftve
the red colored contour map. For instance, at the C 4 position of B-ring,
the order of inhibitory Table 2 The predicted pIC50c values of representative compounds
activity is: 47 (–Br) > 48 (–NMe2), 35 (–Cl) > 43 (–OCH3).
As shown in Fig. 7a, yellow and white Predicted pIC50c CoMFA CoMSIA
contours highlight areas where hydrophobic No. Structure
properties are favored and disfavored,
respectively. The appearance of white
contour at C3, C4, and C5 position of B-ring
indicates that substitution by hydrophilic

groups at these locations will result in a higher inhibitory activity. For near the B-ring indicate that introduction of
example, at the C3 position of B-ring, the order of inhibitory activity is:
31 (–NO2) > 30 (–H), 32 (–OH) > 30 (–H). At the C4 position of B-
ring, the order of inhibitory activity is: 41 (–Cl) > 39 (–OCH3). A small
white contour at the bridged posi- tion indicates that the position is
suitable for substitution with hydrophilic group. For example, at the
bridged position near A- ring, the order of inhibitory activity is: 38 (–
CONH2) > 43 (–CN), 38 (–CONH2) > 39 (–H). In addition, a yellow
contour at the C3 position of A-ring indicates that this position is
suitable to be substituted with hydrophobic group.
The CoMSIA contour maps of H-donor fteld are shown in Fig. 7b,
where the cyan and purple areas denote hydrogen bond donor are
favorable and unfavorable, respectively. Three pieces of cyan contours
1(CA-4) —0.189 —0.181 22b 0.115View Article 0.192
Online

RSC

22a 0.002 0.413

22c 0.066 0.194
 View Article Online

Paper
Open
Acces
s binding affinity seems stronger.
Articl
e.
Publis
hed on
Fig. 8 The superposition of the initial structure (green) and the
07
equilibrium structure (magenta) of 22c–3UT5 complexes.
Augus
t performs better than MM/GBSA in calculating binding free
2017.
Down
representative inhibitors, 1(CA-4), 22, 22a–22c. The binding free
loaded
energy calculations were performed for each tubulin–inhibitor
on
complex. The system stability and overall convergence of simulations
14/08/ were monitored in terms of root-mean-square deviation (RMSD) of
2017 tubulin–inhibitor backbone atoms (C, Ca, N, and O). The average
09:08: RMSD value of each step versus time is shown in Fig. 2S (see ESI†).
35. It can be seen that all complexes are stable aer 10 ns of simulation
time, and the uctuations in the average RMSD values during the
hiswhole simulation run are
article
between 1.5 A˚ and 2.7 A˚, indicating the complexes keep the
is proximate native state. The initial structure of 22c–3UT5 complex and
license
the equilibrium structure aer 30 ns MD simula- tion are
d superimposed in the Fig. 8. It can be recognized that the equilibrium
under
structure and the initial docked structure are docked into the same
a binding site. Except for a slight dri  and rotation of bonds, there
Creati
seems to be no signiftcant difference. This conftrms the reliability of
ve docking results.
CommRoot mean square uctuation (RMSF) may reect the mobility
onsof proteins trajectory MD simulation composite. Fig. 3S (see ESI†)
Attrib
shows a detailed analysis of the relationship between the RMSF and
the number of protein residues of the ftve complexes. It was observed
that the ftve inhibitor–protein complexes had similar uctuation
proftles and RMSF distribu- tions, indicating that these inhibitors have
similar binding mode with 3UT5. All the residues labeled in Fig. 3S†
are involved in hydrogen bonds, Gln11, Ala12, Asn101, Gly144,
Thr145, Val177, Tyr224, Gys241 and Lys254, show rigid behavior
with lower RMSF values, indicating that the compounds have stable
nature with the complex. Furthermore, the residues Ala12, Lys254
form two hydrogen bonds with 22a, the residues Asn101, Cys241
form two hydrogen bonds with 22b, the resi- dues Gln11, Val177,
Tyr224, Cys254 form six hydrogen bonds
with 22c, the residues Asn101, Cys241 form two hydrogen RSC bonds
with 22, and the residues Asn101, Gly144, Thr145 form four
hydrogen bonds with 1(CA-4), respectively. It can be seen from
Fig. 3S† that compounds 1(CA-4) and 22c are more stable at the
active site because the number of hydrogen bonds formed by CA-4
and 22c is more than that formed by 22, 22a, and 22b, and the
Based on the MD simulation, the binding free energy
calculations for the ftve inhibitors of the last 2 ns trajectory were
performed and are listed in Table 3. MM/PBSA and MM/GBSA
were both used in free energy calculations. Although the two
methods, MM/PBSA and MM/GBSA had been used to calculate
the DGbind in the present study, it is generally think that MM/ PBSA
energy.36 As listed in Table 3, for all the compounds, the gas phase
energy DGgas and the solvation free energy DGsol is negative and
positive, respectively, indicating that the former is favorable and
the latter is unfavorable energetic contribution to the total binding
free energy. It can also be seen that the most important contribution
to the overall binding energy is the van der Waals energy DEvdw of
DGgas. The binding free energy of the inhibitors 1(CA-4), 22, and
22a–22c via MM-GBSA are predicted to be —22.65, —44.57, —
43.34, —37.78 and —47.46 kcal mol—1,
respectively, and via MM-PBSA was predicted to be —16.83,
—30.47, —30.29, —29.71 and —31.09 kcal mol—1, respectively. It
can be seen that all binding free energies of 22, 22a–22c are far
more negative than that of CA-4, indicating their higher inhib-
itory activity. From the structure of viewpoint, the reason might
partly result from the introduction of F atom into the double bond
of the cis-stilbene moiety in 22 and 22a–22c. On the other hand,
the substituent at the 30 position on the B-ring for 22, 22a–22c is
nitro, while the corresponding substituent for CA-4 is hydroxy. To
further conftrm the relative importance of nitro and F for activity,
the structure–activity relationship between CA-4
(1) and 5 was analyzed. As shown in Table 2S,† the sole differ-
ence in structure between CA-4 (1) and 5 is the substituent at the
30 position on the B-ring. The substituent for CA-4 and 5 is
hydroxyl and nitro, respectively. However, CA-4 (IC50 ¼ 1.2 mm)
is distinctly more potent than compound 5 (IC50 ¼ 2.6 mm).
Therefore, the presence of nitro at the 3 0 position on the B-ring
seems not the key factor for the high activity of the new designed
molecules. The introduction of F atom into the double bond of the
cis-stilbene moiety plays key role, which is consis- tent with the
experimental results of Alloatti et al.14
Compared with the total binding free energy of the template
22, the values of 22b are bigger, the value of 22a is similar, and

Table 3 Binding free energy (DGbind, kcal mol—1) (last 2 ns) of ligand–tubulin complexes along with the different energy (kcal mol—1) contributions
No. DEvdw DEele DGgas DGGB DGSA DGsol (GB) DGbind (GB) DGPB DGSA DGsol (PB) DGbind (PB)

1(CA-4) —35.99 —8.90 —44.89 27.12 —4.88 22.24 —22.65 32.19 —4.12 28.07 —16.83
22 —52.80 —12.40 —65.19 27.52 —6.90 20.62 —44.57 39.15 —4.43 34.72 —30.47
22a —54.24 —10.34 —64.57 28.18 —6.94 21.23 —43.34 38.82 —4.53 34.29 —30.29
22b —48.69 —12.55 —61.24 29.78 —6.31 23.46 —37.78 35.94 —4.41 31.53 —29.71
22c —60.08 —11.83 —71.90 32.04 —7.60 24.44 —47.46 45.62 —4.81 40.81 —31.09
 View Article Online

RSC
only the value of 22c is more negative. That is, from the binding free
energy of viewpoint, 22c is more active than 22, which has the
highest activity among the known reported CA-4 and CA-4 analogues.
So the carboxyl at the 50 position on the B-ring in 22c is also very
Open
important for bioactivity. Although the DGbind values for 22a and 22b
Acces
are bigger than that for 22, their DGbind values are far smaller than that
s
for CA-4. So the three designed compounds 22a–22c could be used as
Articl
good potential tubulin polymerization inhibitors.
e.
Publis
hed on Docking analysis
07
To understand the discrepancy of activity between CA-4, 22, and
Augus
22a–22c for tubulin polymerization, a series of molecular docking
t
simulations were carried out. Fig. 9 shows the 3D binding modes of
2017.
the compounds CA-4, 22, 22a, 22b, and 22c at the colchicine binding
Down
site of tubulin (PDB ID: 3UT5). As shown in Fig. 9, compound 22,
loaded
22c could be perfectly docked into the active site of tubulin. The
on
binding pattern with the active site is very similar to that of CA-4. The
14/08/
trimethoxyphenyl group occupies a same position as the
2017
corresponding moiety of CA-4. For compounds 22a and 22b, by
09:08:
contrast, Fig. 9 shows that their conformations seem to be out of the
35.
colchicine binding site, which is consistent with the conclusion that
22c has the most negative binding free energy (the strongest binding
hisaffinity) in molecular dynamics simulations. Fig. 10 shows the
article
docking results of 22a, 22b, 22c, CA–4, 22 and colchicine crystal
is struc- ture. As shown in Fig. 10, it can be easily seen that some key
license
amino acids such as Gly10, Gln11, Ala12, Asp69, Asp98, Ala99,
d Ala100, Asn101, Ser140, Gly143, Gly144, Thr145, Val177, Ser178,
Fig. 10 Compounds 22a–22c, CA-4 and 22 docked into the binding
under
Glu183, Tyr224 and Lys254 play key roles in the interaction with site of 3UT5. The inhibitor is shown as purple stick model.
a compound 22c at the binding site of 3UT5. The initial docking results
Creati
show that the Gly10, Gln11, Ala12, Asp69, Ala99, Asn101, Ser140,
ve Gly144, Thr145, Val177, Ser178, Glu183, Tyr224 and Lys254 form
Comm
electrostatic interaction, and the Asp98, Ala100 and Gly143 form van situs The observed hydrogen bond distances are 2.65 A˚ (Gln11–
onsder Waals interaction with compound 22c. Six hydrogen bonds are OH/–NO2), 3.16 A˚ (Val177–OH/O–), 2.74 A˚ (Tyr224–OH/O–),
Attrib 2.95 A˚ (Tyr224–OH/–OCH3), 2.94 A˚ (Lys254–HN–H/–OCH3)
formed between 22c and the colchicine
and 2.97 A˚ (Lys254–HN–H/–OCH3). Similarly, 22, 22a–22b and
CA-4 were docked into the same protein as shown in Fig. 10,
which result in four hydrogen bond interactions for CA-4, two
hydrogen bond interactions for 22a, 22b, and 22. The presence of
more hydrogen bonds in 22c seems the key factor for its high
activity. Docking results could correlate well with the CoMFA and
CoMSIA results. For example, docking results show that the nitryl
and carboxyl of B-ring in 22c are in favor of the formation of stable
hydrogen bond interaction and enhancement activity. As shown in
Fig. 7a and b, the appearance of white contour at C 3, C4, and C5
positions in B-ring indicates that substitution by hydrophilic groups
at these locations will result in a higher inhibitory activity. Three
pieces of cyan contours near the B-ring indicate the hydrogen bond
donor moieties should improve the biological activity. Herein the
nitryl and carboxyl are just hydrophilic and donor groups. Docking
results show that the trimethoxy substitutions in ring A interact with
many hydro- phobic amino acid residues, such as Gly10, Asp98,
Asn101, Asp69. A yellow contour at the A-ring shown in Fig. 7a also
Fig. 9 Proposed binding modes of CA-4 (in green), 22 (in magenta), indicates that this position is suitable to be substituted with hydrophobic
22a (in orange), 22b (in red), 22c (in blue) in the colchicine site of group.
tubulin.
 View Article Online

Paper
RSC
Table 4 ADMET prediction of designed compounds
ADME ADMET ADMET ADMET ADMET ADMET ADMET ADMET ADMET A
T solubility solubility hepatotoxic CYP2D6 CYP2D PPB Alog BBB D
No. absorpt level ity 6 level P98 level M
Open ion E
probability probability
Acces level T
s
Articl P
S
e.
A
Publis _
hed on 2
07 D
Augus
1(CA-4) 0 —3.93 3 0.913 1 0.534 2 3.508 1 56.535
t
22 0 —4.456 2 0.807 0 0.455 2 3.554 2 78.543
2017. 22a 0 —4.722 2 0.807 0 0.415 2 3.89 2 78.543
Down 22b 0 —4.601 2 0.854 0 0.396 2 2.808 4 105.083
loaded 22c 1 —4.16 2 0.708 0 0.386 1 3.184 4 116.659
on Thr145, Val177, Tyr224, Gys241 and Lys254) as well as hydrogen
14/08/ bonds between the representative compounds and residues were
2017
09:08: ADMET prediction
35. Pharmacokinetics is mainly a quantitative study of the process of
drugs in the organism (absorption, distribution, metabolism and
excretion). The prediction results for some representative compounds
his
(CA-4, 22, 22a–22c) are reported in Table 4. Fig. 4S (see ESI†)
article
shows that all the compounds have an optimum cell permeability (PSA
is < 140 A˚2 and Alog P98 < 5).46 As shown in
license
Table 4, the absorption levels of CA-4, 22, 22a, 22b are 0, indi-
d cating that they can be well absorbed by the cell membrane. The
under
absorption level of 22c is 1, which has moderate absorption. The
a aqueous solubility plays a dominant role in the bioavail- ability of the
Creati
candidate drugs. With the exception of CA-4 having good aqueous
ve solubility (level 3), all other compounds have low aqueous solubility
Comm
levels (level 2). Compared with CA- 4, the designed compounds 22b
onsand 22c have undeftned BBB penetration level (level 4) values, 22a
Attrib
has a medium level (level 2). As to CYP2D6 probability, with the
exception of CA-4 inhibiting cytochrome P450, all the designed
molecules exhibit satisfactory effect, the value is less than 50% (level
0). This indicates that the designed molecules can readily undergo
oxidation and hydroxylation in the phase-I metabolism. Further, the
prediction of ADMET plasma protein binding property denotes that
compound 22c has a binding 90%–95% (level 1) and the other
compounds CA-4, 22, 22a, 22b have binding $95% (level 2). This
suggests that the most potent 22c has good bioavailability and is not
likely to be highly bound to carrier proteins in the blood. Finally, the
designed molecules have a predicted hepatotoxicity probability of
70%–80%, which is lower than that of CA-4 (91.3%).

Conclusion
The identiftcation of some CA-4 analogues as potential tubulin
polymerization inhibitors is performed by a combination of computer-
aided drug design techniques, ie 3D-QSAR study, molecular docking,
MD simulations, and binding free energy calculation. The established
3D-QSAR models show signiftcant statistical quality and excellent
predictive ability. To verify the reliability of the models, the inhibitory
activity of some synthetic CA-4 analogues was evaluated and
predicted. Molec- ular docking for some typical CA-4 analogues was
carried out. Some vital residues (Gln11, Ala12, Asn101, Gly144,

RSC
located. Based on the 3D-QSAR and docking results, some new
potent inhibitors (22a–22c) were designed and predicted. 30 ns of
MD simulations had been successfully run for ftve repre- sentative
compounds and their binding free energies were calculated. The
total binding free energies of all designed compounds are much
more negative than that of CA-4 and they are meaningful for
experimental synthesis. Both 3D-QSAR study and MD simulation
results theoretically indicate that the F atom of the double bond in
the cis-stilbene moiety could distinctly improve the inhibitory
activity of the CA-4 analogues.
Conflict of interest
The authors declare that there is no ftnancial/commercial conict
of interest.
Acknowledgements
Thanks for ftnancial support given by Shanghai Municipal Natural
Science Foundation (No. 15ZR1440400), Collaborative Innovation
fund (XTCX2016-14) Shanghai Municipal Education Commission
(Plateau Discipline Construction Program). Authors
View are
Articlealso
Online
thankful to Shandong Huawei Pharmaceutical Com. Ltd. for their
help in Tubulin Polymerization Assay.
References
1 Y. Han, H. Malak, AG Chaudhary, MD Chordia,
DG Kingston and S. Bane, Biochemistry, 1998, 37, 636–644. 2
MA Jordan and L. Wilson, Nat. Rev. Cancer, 2004, 4, 253–
265.
3 F. Pellegrini and DR Budman, Cancer Invest., 2005, 23, 3264–
3273.
4 GM Cragg and DJ Newman, J. Nat. Melecut., 2004, 67, 232–
244.
5 RB Ravelli, B. Gigant, PA Curmi, I. Jourdain, S. Lachkar,
A. Sobel and M. Knossow, Nature, 2004, 428, 198–202.
6 GA Orr, P. Verdier-Pinard, H. Mcdaid and SB Horwitz,
Oncogene, 2003, 22, 7280–7295.
7 RA Stanton, KM Gernert, JH Nettles and R. Aneja, Med. Res.
Rev., 2011, 31, 443–481.
8 G. Pettit, SB Singh, E. Hamel, CM Lin, DS Alberts and
D. Garcia-Kendal, Experientia, 1989, 45, 209–211.
9 NH Nam, Curr. Med. Chem, 2003, 10, 1697–1722.
 View Article Online

10 Paper
K. Ohsumi, R. Nakagawa, Y. Fukuda, T. Hatanaka,
29 FM Ranaivoson, B. Gigant, S. Berritt, M. Joullie andRSC
Y. Morinaga, Y. Nihei, K. Ohishi, Y. Suga, Y. Akiyama and T.
M. Knossow, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr.,
Tsuji, J. Med. Chem, 1998, 41, 3022–3032.
2012, 68, 927–934.
11 GR Pettit and MR Rhodes, Anti-Cancer Drug Des., 1998,
Open 30 U. Essmann, L. Perera, ML Berkowitz, T. Darden, H. Lee and
13, 183–191.
Acces 12 JJ Hall, M. Sriram, TE Strecker, JK Tidmore,
LG Pedersen, J. Chem. Phys, 1995, 103, 8577–8593.
s 31 DA Case, T. Darden, TE Cheatham III, C. Simmerling,
CJ Jelineka, GD Kumar and GR Pettit, Bioorg. Med. Chem Lett.,
Articl
JM Wang and RE Duke, et al., AMBER 12, University of
2008, 18, 5146–5149.
e.
California, San Francisco, 2013, 1, p. 3.
13 KG Pinney, MP Mejia, VM Villalobos, BE Rosenquist,
Publis
32 S. Miyamoto and PA Kollman, J. Comput. Chem, 1992, 13,
GR Pettit, P. Verdier-Pinard, et al., Bioorg. Med. Chem, 2000, 8, 952–962.
hed on 2417–2425. 33 W. Humphrey, A. Dalke and K. Schulten, J. Mol. Graphics
07 14 D. Alloatti, G. Giannini, W. Cabri, I. Lustrati, M. Marzi, A. Ciacci, Modell., 1996, 14, 33–38.
Augus et al., J. Med. Chem, 2008, 51, 2708–2721. 34 PA Kollman, I. Massova, C. Reyes, B. Kuhn, S. Huo, L. Chong,
t 15 L. Zhao, JJ Zhou, XY Huang, LP Cheng, W. Pang, ZP Kai, et al., et al., Acc. Chem Res., 2000, 33, 889–897.
2017. Chin. Chem Lett., 2015, 26, 993–999. 35 N. Homeyer and H. Gohlke, Mol. Inf., 2012, 31, 114–122.
Down 16 ML Brown, JM Rieger and TL Macdonald, Bioorg. Med.
36 T. Hou, J. Wang, Y. Li and W. Wang, J. Chem. Inf. Model.,
loaded Chem, 2000, 8, 1433–1441. 2011, 51, 69–82.
on 17 SY Liao, JC Chen, TF Miao, Y. Shen and KG Zheng, J. Enzyme 37 ML Shelanski, F. Gaskin and CR Cantor, Proc. Natl. Acad.
14/08/ Inhib. Med. Chem, 2010, 25, 421–429. Sci. USA, 1973, 70, 765–768.
2017 18 C. Da, SL Mooberry, JT Gupton and GE Kellogg, J. Med. 38 GR Pettit, B. Toki, DL Herald, P. Verdier-Pinard,
09:08: Chem, 2013, 56, 7382–7395. MR Boyd, E. Hamel, et al., J. Med. Chem, 1998, 41, 1688–
35. 19 YH Jin, P. Qi, ZW Wang, QR Shen, J. Wang, WG Zhang 1695.
and HR Song, Molecules, 2011, 16, 6684–6700. 39 G. Pettit, MR Rhodes, DL Herald, E. Hamel, JM Schmidt and
his20 TA Halgren, J. Comput. Chem, 1996, 17, 490–519.
RK Pettit, J. Med. Chem, 2005, 48, 4087–4099.
article
21 FM Ranaivoson, B. Gigant, S. Berritt, M. Joullie and 40 GR Pettit, CR Anderson, DL Herald, MK Jung, DJ Lee, E.
is M. Knossow, Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr., 2012, Hamel, et al., J. Med. Chem, 2003, 46, 525–531.
license68, 927–934.
41 R. Siles, JF Ackley, MB Hadimani, JJ Hall, BE Mugabe,
d 22 L. St˚ahle and S. Wold, J. Chemom., 1987, 1, 185–196.
R. Guddneppanavar, et al., J. Nat. Melecut., 2008, 71, 313–320.
23 Z. Gagic, K. Nikolic, B. Ivkovic, S. Filipic and D. Agbaba, J.
under
42 KA Monk, R. Siles, MB Hadimani, BE Mugabe,
a Taiwan Inst. Chem Eng, 2016, 59, 33–44. JF Ackley, SW Studerus, et al., Bioorg. Med. Chem, 2006, 14,
24 PK Ojha and K. Roy, Chemom. Intell. Laboratorium. Syst., 2011,
Creati
3231–3244.
ve 109, 146–161. 43 K. Ohsumi, R. Nakagawa, Y. Fukuda, T. Hatanaka,
25 A. Tropsha, Mol. Inf., 2010, 29, 476–488.
Comm
Y. Morinaga, Y. Nihei, et al., J. Med. Chem, 1998, 41, 3022–
ons26 R. Kunal, ND Rudra, A. Pravin and BA Rahul, Chemom.
3032.
Attrib Intell. Laboratorium. Syst., 2016, 152, 18–33.
44 M. Cushman, D. Nagarathnam, D. Gopal, AK Chakraborti, CM
27 A. Golbraikh and A. Tropsha, J. Mol. Graphics Modell., 2002, Lin and E. Hamel, J. Med. Chem, 1991, 34, 2579–2588.
20, 269–276. 45 R. Shirai, K. Tokuda, Y. Koiso and S. Iwasaki, Bioorg. Med.
28 PK Ojha, I. Mitra, RN Das and K. Roy, Chemom. Intell. Chem Lett., 1994, 4, 699–704.
Laboratorium. Syst., 2011, 107, 194–205. 46 WJ Egan, KM Merz and JJ Baldwin, J. Med. Chem, 2000,
43, 3867–3877.