BAB I

Uji Pirogenitas
I.1 Definisi Pirogen
Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang berhubugan dengan rasa panas,
dan kata gen yang artinya membentuk atau menghasilkan. Pirogen adalah produk mikroorganisme
terutama berasal dari bakteri gram negatif.
Pirogen merupakan senyawa dengan berat molekul tinggi yang dinyatakan sebagai
senyawa lipopolisakarida yang diproduksi oleh kira-kira sekitar 10-15% massa bakteri total.
Pirogen adalah senyawa yang jika masuk kedalam tubuh akan mempengaruhi suhu tubuh dan
biasanya menghasilkan demam. Pengobatan demam akibat pirogen pada beberapa kasus sulit
diobati dan dapat menyebabkan kematian. Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas,
meliputi endotoksin (LS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari membran luar
bakteri gram negatif.
I.2 Uji Pirogenitas
Tujuan dari uji pirogenitas adalah untuk mengetahui apakah suatu sediaan ujii steril bebas
pirogen atau tidak.
Cara pengujian dengan cara mengukur peningkatan suhu tubuh kelinci yang disebabkan
oleh penyuntikan intravena sediaan uji steril.
Hewan percobaan: kelinci (syarat: seminggun sebelum pengujian tidak menunjukkan
penurunan bobot badan)
Hewan uji tidak dapat digunakan jika :
Tiga hari sebelumnya dipakai untuk pengujian pirogenitas, hasil negatif.
Tiga minggu sebelumnya digunakan untuk pengujian pirogenitas sediaan uji tidak
memenuhi syarat.
Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitas tetapi respon rata-rata kelompok
kelinci melebihi 1,200

Alat
1. Termometer atau termometer listrik
- Ketelitian skala 0,10
- Dapat dimasukkan kedalam rektum kelinci sedalam ± 5cm
2. Alat suntik (terbuat dari kaca atau bahan lain yang cocok, tahan pemanasan pada suhu
250)
Sediaan Uji
Dibuat dari zat uji dengan melarutkan atau mengencerkannya menggunakan larutan
natrium klorida P steril bebas pirogen atau jika zat uji berupa larutan yang sesuai dapat langsung
digunakan.
Pengujian
Pengujian meliputi dua tahapan yaitu:
1. Pendahuluan hewan uji disuntik dengan larutan NaCl P steril bebas pirogen (10 ml/kgBB,
intravena) 1-3 hari sebelum pengujian
2. Pengujian utam: sediaan uji dihangatkan ± 38,50
3. Disuntikkan perlahan kedalam vena auricularis tiap kelinci dan dilakukan evaluasi
Penafsiran Hasil
Penafsiarn hasil dilakukan menurut Farmakope Indonesia Edisis III atau IV. Penafsiran
hasil dibedakan untuk:
1. Hewan percobaan (kelinci)
2. Sediaan uji
Persyaratan penafsiran hasil pembacaan suhu (respon) dibaca sesuai petunjuk dan dibandingkan
dengan daftar tabel
Jumlah Kelinci Sediaan uji memenuhi syarat Sediaan tidak memenuhi
jika jumlah respon tidak syarat jika jumlah respon
melebihi melebihi
3 1,200 2,700
6 2,800 4,300
9 4,500 6,600
12 6,600 6,600

 Prosedur kerja :
1. Kelinci dimasukkan ke kotak dengan penahan yang cukup longgar, badan bebas,
kelinci dapat duduk dengan bebas
2. Uji pendahuluan :
 Ruang harus tenang, di ruang dengan perbedaan terhadap temperature
pemeliharaan tidak boleh lebih dari 3C
 1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak diberi makan dan selama
waktu pengujian tidak diberi minum
 Catat temperature badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit
yang dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga tiga jam sesudah
penyuntikan dengan laruan NaCl P steril bebas pirogen
 Kelinci yang menunjukkan beda temperature lebih besar dari 0,6C tidak
dapat digunakan untuk pengujian utama
3. Pengujian utama
 1 kelompok hewan percobaan terdiri dari 3 ekor kelinci
 Hangatkan sediaan uji hingga temperature kurang lebih 38,5C
 Suntikkan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci
 Lama penyuntuikan tidak lebih dari 4 menit dan volume sediaan uji tidak
kurang dari 0,5 mL dan tidak lebih dari 10 mL per kg berat badan
 Jika gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiap kelompok uji terdiri dari 3
ekor kelinci
4. Penafsiran hasil
 Temperature awal adalah temperature rata-rata 2 pembacaan temperature
dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan
sediaan uji
 Temperature maksimum adalah temperature tertinggi yang dicatat selama 3
jam setelah penyuntikan sediaan uji
 Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit yang
dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah penyuntikan

Kelinci memenuhi syarat :

- Bila antar kelinci perbedaan suhu awal tidak lebih dari 1C

Kelinci tidak memenuhi syarat :

- Perbedaan temperature awal lebih besar dari 0,2c

- Temperatur awal lebih kecil dari 38C dan tidak lebih besar dari 39,8C

Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat :

- Jika jumlah respon tidak melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi
syarat jika jumlah respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok
- Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian diulangi
- Jika pengujian keempat jumlah respon melebih 6,6C sediaan uji dinyatakan
tidak memenuhi syarat
i. Perhitungan sel darah putih
Injeksi obat suntik yang mengandung pirogen pada pembuluh baik darah kelinci akan
menyebabkan terjadinya percobaan sel-sel darah putih
Misal : penurunan limfosit dan menaikkan neutrofi ini menjadi indikator terhadap
adanya aktivitas pirogen.

ii. Test Limulus Amebocyte Lystate (LAL)

Prinsip : penggumpalan ekstrak cair sel darah kepiting ladam kuda (Limulus
polyphemus) dengan adanya pirogen.
LAL test merupakan metoda yang sensitive untuk penentuan endotoksin bakteri gram
negatif atau lipopolisakarida (pirogen).
Di mana lipid A dari molekul endotoksin dapat memberikan reaksi menjadi gel
dari limulus lystate
Ada kecocokan atau persamaan hasil antara LAL dengan test kelinci

Cara uji in vitro dengan menggunakan sifat membentuk gel dari lisat amebasit dari limulus
polifemus. Uji ini 5-10 kali lebih sensitif dari Rabbit test.

Kondisi LAL-test:

a. pH larutan 6-7

b. suhu 37oC

c. kontrol negatif: aquadest (pelarut)

d. kontrol positif (pirogen/endotoksin)

e. keuntungan: cepat, mudah, praktis

Gambar 1. Limulus
Amebocyte Lysate (LAL)
untuk deteksi endotoksin
 Reagensia LAL dibuat dari ekstrak set darah Horseshoe Crab dari spesies Limulus
polvphentus, yaitu jenis invertebrata yang telah hidup pada jaman pra sejarah. Corpuscula
darah Limulus hanya terdiri dari satu macam set darah yang disebut sebagai Amoebocvte.
Amoebocvte dalam banyak hal menyerupai platelet, tetapi ukurannya agak lebih besar.

Untuk mendapatkan reaksi yang optimal antara reagensia LAL dengan endotoksin,
Thomas J. Novitsky (1984) menyebutkan perlunya unsur-unsur yang harus ada dalam
reagensia LAL, yaitu :

 pro-clotting enzynze (zymogen).

 clotting protein (coagulogen).

 Garam anorganik

Uji LAL didasarkan atas kemampuan endotoksin menyebabkan koagulasi "protein

coagulogen", sebagai unsur reagensia LAL, sehingga terbentuk "Gel". Untuk mengevaluasi
hasil reaksi tersebut, Marlys Weary (1986) menyebutkan adanya 4 metode dasar yang dapat
dipakai, yaitu antara lain : The gel-clot end point test: The turbidometric assay; The
cobrimetric assay; dan Chromogenis substrate test. Metode yang disebutkan pertama adalah
yang paling sering digunakan untuk mengevaluasi Uji LAL.

Sebagai gambaran masing-masing metode dan tahapan-tahapan untuk melakukan uji LAL
adalah sebagai berikut :

"The gel-clot end point test" (Uji penggumpalan gelatin)

Reagensia LAL dicampur dengan sampel larutan uji dalam tabling galas masing-
masing dengan volume sama yaitu 1,0 ml.

Setelah dicampur, tabung gelas tersebut diinkubasi pada temperatur 37°C ± 2°C
selama 60 menit ± 1 menit.

Pembacaan pengujian larutan yaitu tabung galas dari inkubator diambil dengan
hati-hati, kemudian membaliknya 180°, sehingga permukaan atas tabung berada di
bagian bawah.
 Hasil pembacaan adalah :

Positif (+) jika terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti contoh larutan tersebut
mengandung sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia yang digunakan.

Negatif (-) jika tidak terbentuk·gelatin padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji
tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia
yang digunakan.

BAB II
Penetapan Kadar Obat dan Jumlah Metabolitnya dalam Urin Ibu Hamil Dengan
Metode Kromatografi Lapis Tipis

II.1 Asam Folat

Asam folat adalah bentuk vitamin B kompleks yang larut dalam air. Asam folat merupakan
bentuk sintesis dari vitamin B9 yang disebut folat. Zat ini dibutuhkan dalam pertumbuhan tubuh
karena bersifat multifungsi, mulai dari membantu proses produksi DNA, hingga pembentukan sel
darah merah. Asam folat memiliki struktur C19H19N7O6.
Berikut ini merupakan fungsi asam folat untuk ibu hamil.
1. Mencegah cacat tabung saraf
Vitamin ini membantu perkembangan saraf pada janin. Tabung saraf pada bayi,
yang nantinya akan tumbuh menjadi otak dan sumsum tulang belakang, dilindungi
oleh asam folat untuk mencegahnya mengalami gangguan selama pembentukan
awal sistem saraf pusat.
2. Memproduksi sel darah merah
Vitamin ini juga meningkatkan produksi sel darah merah dalam tubuh. Hal ini
penting selama kehamilan terutama karena ibu hamil rentan terkena anemia akibat
kekuranga zat besi. Asam folat akan memastikan jumlah sel darah merah dalam
tubuh akan tetap normal meskipun mengonsumsi suplemen yang dapat mengurangi
jumlah zat besi.
3. Melindungi bayi dari komplikasi
Dapat menurunkan resiko bibir dan langit-langit sumbing. As. Folat juga
mengurangi resiko bayi lahir prematur, keguguran, perkembangan yang buruk bayi
dalam kandungan, dan masalah berat badan saat lahir.
 4. Melindungi ibu yang sedang promil
Asupan asam folat yang cukup setiap harinya diketahui dapat mencegah
preeklampsia, serangan jantung, stroke, kanker, dan alzheimer.

5. Pembentukan DNA
Asupan ini dibutuhkan untuk memproduksi, memperbaiki, mengaktifkan DNA
yang berkaitan dengan genetik bayi. Selain itu, juga bagus untuk perkembangan
plasenta dan pertumbuhan janin.
Kebutuhan asam folat untuk wanita yang sedang menjalankan program hamil adalah 400
mikrogram (mcg) atau 0,4 miligram (mg) per hari. Setidaknya dikonsumsi sebulan sebelum masa
konsepsi atau pembuahan. Dosis 400 mcg atau 0,4 mg asam folat tersebut bisa didapatkan dari
makanan yang mengandung asam folat atau pun dari suplemen.
Makanan Sumber Asam Folat
Makanan sumber asam folat yang bisa Anda temukan dengan mudah, antara lain:

Sayuran hijau, seperti asparagus, brokoli, bayam, sawi hijau, kubis Brussel.
Buah-buahan, seperti jeruk, alpukat, dan bit.
Kacang-kacangan, seperti kacang merah, kacang hijau, kacang polong, kacang tanah, dan
kacang kedelai.
Biji-bijian, seperti gandum dan sereal.

Hati sapi, makanan laut, salmon, telur, dan susu rendah lemak. Hati sapi memang tinggi asam
folat tapi juga tinggi kolesterol, jadi dianjurkan untuk tidak banyak dalam mengonsumsinya.

II.2 Kromatografi Lapis Tipis

KLT adalah metode pemisahan fisikokimia. Lapisan pemisah terdiri atas bahan berbutir-
butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa plat glas, logam, atau lapisan yang cocok.
Campuran yang akan dipisah berupa larutan yang akan ditotolkan baik berupa bercak ataupun pita,
setelah plat atau lapisan dimasukkan kedalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan
pengembang yang cocok (fase diam), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler
(Pengembangan), selanjutnya Senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan.
Pendeteksian bercak hasil pemisahan dilakukan dengan berbagai cara. Untuk senyawa
yang tidak berwarna cara yang paling sederhana adalah pengamatan dengan sinar ultraviolet.
Beberapa senyawa organik bersinar atau berfluoresensi jika disinari dengan sinat uv gelombang
pendek (254nm) atau gelombang panjang (366nm), jika dengan cara itu senyawa tidak dapat
dideteksi maka harus disemprot dengan pereaksi yang membuat bercak tersebut tampak yaitu
pertama tanpa pemanasan, kemudian bila perlu dengan pemasanan.
a. Fase diam (lapisan penjerap)
Fase diam berupa bahan padat yang dilapiskan pada permukaan penyangga yang datar
yang biasanya terbuat dari kaca, dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan
 melekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau
amilum. Penjerat yang biasanya digunakan adalah silica gel, selulosa, alumina, kieselgur.
Dua sifat penting dalam fase diam adalah ukuran partikel dan homogenitasnya, karena
adhesi terhadap penyongkong sangat tergantung pada kedua sifat tersebut. Fase diam butiran
halus memberikan aliran pelarut yang lebih lambat dan resolusi yang lebih baik
b. Fase gerak
Fase gerak merupakan medium angkut. Pemisahan senyawa organic selalu
menggunakan pelarut campur (maks 3 jenis pelarut). Tujuan penggunaan pelarut campur
adalah agar memperoleh pemisahan yang lebih baik. Kombinasi pelarut adalah berdasarkan
polaritas masing-masing pelarut, sehingga dengan demikian akan didapatkan sistem
pengembangan yang cocok.
c. Harga Rf
Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Rf
Struktur kimia dari Senyawa yang sedang dipisahkan
Sifat penjerap
Tebal dan kerataan dari lapisan penjerap
Pelarut dan derajat kemurniannya
Derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana
Teknik percobaan
Jumlah cuplikan yang digunakan
Suhu
Kesetimbangan

II.3 Metode Percobaan

Perlakuan
Dipersiapkan alat dan bahan
Dikalibrasi chamber untuk menentukan
banyaknya volume fase gerak
Dibuat fase gerak sebanyak 350ml
Pengamatan
Alat :
Beaker glass, chamber, plat silica, pipa
kapiler, pipet tetes, kertas saring.
Bahan :
Aquadest, n-heksan, methanol, test pack merk
andalan, urin ibu hamil
Volume fase gerak yang dibutuhkan sebanyak
280ml dengan tinggi volume fase gerak pada
bejana 1 cm
Alasam fase gerak dibuat berlebih karena
menggunakan fase gerak air : methanol : etil
asetat (8:1,5:0,5) dan karena pada proses
pembuatannya dipisahkan antara air dan etil
asetat sehingga yang diambil fasa airnya dan

Dicampurkan antara air dan etil asetat
Ditambahkan methanol, kemudian
dicampurkan, masukkan fase gerak kedalam
chamber sebanyak 280ml
Dilakukan penjenuhan dengan cara
memasukkan kertas saring yang telah
dipotong seperti pita panjang, tutup chamber
dengan wrapping dan dibiarkan hingga fase
gerak membasahi semua bagian kertas saring
Dibuat titik tempat penotolan pada plat silika
Ditotolkan urin dengan pipa kapiler pada plat
silica, kemudian dimasukkan kedalam
chamber yang telah jenuh.
Diamati pergerakan bercak noda
Dikeringkan plat silika
Disinari plat silica dengan sinar UV dan
dihitung nilai Rf nya.
akan mengurangi fase gerak, sehingga
dilebihkan.
Air 280ml, etil asetat 17,5ml.
-Etil asetat dibagian atas dan air dibawah
-Dipisahkan fase etil asetatnya
-Alasan digunakan fase yang polar karena
asam folat yang akan dideteksi dengan klt
bersifat larut air.
Metanol 52,5ml
-Penjenuhan ± 30 menit
-Jangan membuka tutup wrapping karena
akan mengganggu proses penjenuhan
-Ukuran plat 20 x 20 cm
-Panjang lintasan 11cm
-Dibuat 10 titik penotolan untuk masing-
masing kelompok 2x penotolan
-Urin ditotolkan 1 kali, hingga sampai
mongering, kemudian ditotolkan kembali
pada tempat yang sama, tujuannya agar noda
urin lebih tebal dan agar mudah dideteksi
Pergerakan noda bercak hingga atas
Plat silica kering dengan diangin2kan
UV 254 nm dan 366 nm

BAB III
Penetapan Kehamilan pada Urin Ibu Hamil Dengan Test Pack
III.1 Human Chorionic Gonatropin (HCG)
HCG adalah hormone yang disekresikan oleh sel-sel tropoblas ke dalam cairan ibu
segera setelah nidasi terjadi. HCG yang dihasilkan dapat ditemukan dalam serum urin.
Beberapa test pack direndam dalam urine untuk mengetahui terjadinya kehamilan atau
tidak, hanya dengan melihat jumlah garis setelah 5 menit perendaman. Test urin memiliki
ketepatan 98% namun kesalahan dapat terjadi, dikarenakan test yang terlalu dini dilakukan.
HCG dapat diperoleh dari ekskresi urin wanita hamil karena hormone yang diproduksi
oleh plasenta ini diekskresikan dalam jumlah besar dalam urin. Hormon ini memiliki sifat
seperti LH pada wanita dengan produksi gonadotropin yang rendah atau non siklis.
Hormon ini juga digunakan pada wanita dengan ovulasi pada fase luteal sehingga terjadi
infertilitas atau arbutus habitualis.

III.2 Cara Pengujian

Disiapkan alat dan bahan (test pack, urin)
Mencelupkan test pack ke dalam urin yang akan diuji sampai pada batas garis
hitam yang ditentukan
Mendiamkannya selama 30 detik
Mengangkat test pack dan membiarkannya selama 1 menit
Mengamati jumlah garis merah yang muncul pada test pack. Jika terdapat 2 garis
merah menandakan positif hamil dan jika hanya terdapat 1 garis merah
menandakan negative hamil.

BAB IV
Penetapan Indeks Busa Pada Sabun Cair, Indeks Hemolitik, dan Indeks
Ikan

Pembahasan Pengujian Indeks Ikan

Konsentrasi 0,05%
Cara Kerja :
- Pengujian ini menyampling 2 mL larutan sunlight, kemudian di adkan dengan aquadest
hingga tepat 100 mL (konsentrasinya 0,05%)
- Kemudian dimasukan 7 ekor ikan gurame, dengan ukuran panjang ikan ± 1 cm
- Amati dalam waktu 1 jam apakah terdapat ikan yang mati atau tidak
- Hasil pengamatan setelah 1 jam tidak terdapat ikan yang mati, namun konsentrasi 0,1 %
terdapat ikan 5 ikan yang mati kurang dari 1 jam
Hasil :
Tidak terdapat ikan yang mati pada konsentrasi 0,05%, sehingga indeks ikan hanya sampai
pada konsentrasi 0,1%. Maka, dapat disimpulkan bahwa dalam konsentrasi sunlight 0,1 %
memiliki indeks ikan sebesar 1000.
Pembahasan Pengujian Indeks Busa
Cara Kerja :
- Diambil sunlight 0,0125 mL (kira-kira setengah tetes)  0,0125 mL hasil dari 0,025 g/100
mL
- Kemudian diaddkan dengan aquadest 50 mL, aduk hingga homogen
- Dimasukan 1 mL cairan sabun ke tabung reaksi 1, 2, 3, dan 4
- Dimasukan 1 mL cairan sabun kedalam tabung rekasi ke-1; 2 mL cairan sabun kedalam
tabung rekasi ke-2; 3 mL cairan sabun kedalam tabung rekasi ke-3 dan 4 mL cairan sabun
kedalam tabung rekasi ke-4.
- Dikocok tabung selama 15 detik (Pengocokan 2 kali perdetik), untuk pengocokan harus
dilakukan oleh orng yang sama agar kuatya pengocokan tidak mempengaruhi hasil indeks
busa
- Diamati tinggi busa selama 15 menit
- Diukur tinggi busa setlah 15 menit

Hasil:
Hasil pengamatan menunjukan tinggi busa setelah 15 menit pada tabung 1, 2, 3 dan 4 yaitu
0,1 cm, 0,4 cm, 1,5 cm, dan 2 cm. Data ini menunjukan bahwa semakin tinggi konsentrasi dari
cairan sabun maka akan semakin tinggi indeks busa