4.1.2.

4 Studi hemoglobin dengan pertukaran kation cairan kromatografi kinerja tinggi (HPLC)

Pertukaran kation HPLC telah menjadi metode referensi untuk menghitung dan menentukan jenis
hemoglobin dalam sampel darah [19, 67, 68]. Dalam sistem ini, hemoglobin adalah dilarutkan dalam
buffer yang memiliki pH 6,4 yang kurang dari pH hemoglobin (6,5-7,5) dan muatan bersih molekuler
kemudian dikonversi menjadi positif. Hemoglobin berbeda kemudian memiliki jumlah muatan positif
yang berbeda yang menentukan kekuatan ikatan hemoglobin ke resin bermuatan negatif. Hb Bart
memiliki afinitas mengikat terlemah, sedangkan Hb Constant Spring memiliki ikatan yang kuat. Karena
itu, pada saat melintasi kation eksternal, urutan hemoglobin yang dielusi mulai dari yang cepat sampai
yang paling lambat adalah sebagai berikut: Hb Bart's-HbH-HbF-HbAo-HbA2 / E-Hb Musim Semi Konstan
(Gambar 8).

HbA biasanya diderivatisasi ke beberapa fraksi termasuk Hbs A1a minor, A1b, A1c, dan HbAo mayor. Hbs
A1a minor, A1b, dan A1c dielusi setelah HbF. Dalam penentuan jenis Hb rutin, hanya HbAo mayor yang
biasanya dilaporkan ke dokter. Ini menyebabkan jumlah puncak hemoglobin tidak sama dengan 100%.

HbE, yang umum ditemukan di bagian tenggara dunia, dielusi bersama HbA2. Namun, sebagian besar
produsen merancang program yang membaca puncak hemoglobin di regio A2 hanyalah sebagai HbA2.
Karena itu, operator harus sadar bahwa jika persentase puncak-A2 lebih dari 10, itu adalah HbE
ditambah HbA2 dan mengindikasikan bahwa sampel tersebut memiliki HbE. Operator harus melaporkan
HbE atau HbE ditambah HbA2, bukan melaporkan HbA2 sebagaimana yang dilaporkan oleh mesin.

Ada beberapa produsen yang memproduksi mesin HPLC di dunia dan prosedur operasi serta protokol
kontrol kualitas dibuat khusus untuk setiap merek. Yang paling penting, semua merek ini menghasilkan
pemisahan puncak hemoglobin yang identik. Gambar 8 menunjukkan contoh pola hemoglobin diperoleh
dari Variant ™ Hemoglobin Analysis System, mesin HPLC yang banyak digunakan di Thailand. Dalam
protokol ini, tipe hemoglobin pada manusia normal orang dewasa adalah A2A dengan HbA2 2,6 ± 0,38%
[19].

Berbeda dengan CAE pada pH 8,6, hemoglobin yang dipisahkan melalui pertukaran kation HPLC secara
otomatis dihitung berdasarkan proporsinya dalam darah. Karena itu, baik jenis maupun jumlah
hemoglobin biasanya diperoleh saat diproses pada mesin ini.