Perbandingan Capillary Electrophoresis dengan Cellulose Acetate Electrophoresis pada Skrening Hemoglobinopathies

Pendahuluan
Kelainan bawaan Hb : thalassemia dan struktur varian. Thalassemia: defek sintesis rantai globin, -atau globin.

Struktur varian/ hemoglobinopathies, kelainan struktural

Hb. Trait -thalassemia : anemia ringan / tanpa anemia, MCV , MCH , dan kadar HbA2 .

Pendahuluan
HbA2

diukur dengan elektroforesis selulosa asetat (basa) atau agar sitrat (asam), iso electro focusing (IEF), microcolumn kromatografi, dan HPLC

Elektroforesis

Tidak bisa membedakan antara HbE dan HbO, HbD dan HbG . Elektroforesis memakan waktu, tenaga khusus Kurang akurat dalam kuantifikasi konsentrasi Hb rendah atau Hb varian

Pendahuluan
IEF

memiliki resolusi baik, tapi memiliki kelemahan yang sama seperti metode elektroforesis lain

Kromato grafi kolom

baik utk diagnosis carrier, namun melelahkan, dan memakan waktu

HPLC HPLC

metode pilihan instrument dan pelatihan khusus hasil dalam pola yg kompleks HbA2 palsu pada HBD Punjab Trait. HbA2 palsu pada HbS, dan co-elusi dengan HbE, Hb Osu, Christianborg, HbG Coushatta, dan Hb Lepore.

Elektroforesis kapiler (CE)

memisahkan Hb normal (A, F, dan A2), dan mendeteksi Hb varian. Analisis simultan, pemisahan cepat, resolusi baik, akurasi tinggi, otomatisasi penuh. Mampu memisahkan HbA2 dari HbE, HBC, Hb Lepore, dan HbS

CE dapat membantu mengungkapkan karakteristik dan prevalensi mutasi thalassemia pada populasi Korea

Tujuan
Studi ini mengukur fraksi Hb pada pasien hipokromik
mikrositik untuk mendeteksi thalassemia dan Hb varian. CE dibandingkan dengan elektroforesis selulosa asetat (CA) untuk menggantikan CA dengan CE di laboratorium klinis.

BAHAN DAN METODE

1. Sampel 143 40 normal, 103 mikrositik hipokromik
Eksklusi : Inflamasi akut/ kronis, infeksi, tiroiditis,perdarah an akut, keganasan

2. Px Hematologi CBCS dengan XE2100 (Sysmex, Kobe, Jepang)

3. Selulosa asetat elektroforesis pada plate selulosa asetat Titan III ,350V, 25 menit, dg buffer basa.

4. Elektroforesis Kapiler dg prinsip CE dalam larutan bebas.

5. Nilai Referensi nilai acuan produsen. 6. Konfirmasi : analisis gen

Elektroforesis Kapiler (CE )

CE menggunakan sistem Minicap (Sebia, Norcross,
Prancis) menggunakan prinsip CE dalam larutan bebas

Berat molekul dipisahkan dengan mobilitas

elektroforesis dalam buffer basa dengan pH tertentu.

Pemisahan juga terjadi menurut pH elektrolit dan aliran

elektro-osmotik.

Sistem ini memungkinkan analisis multipel dan

simultan. Electropherograms diekspresikan dengan zona dibagi dari Z1 sampai Z15.

Analisis statistik
Perhitungan statistik dilakukan dengan MedCalc 11.3.0.0
(Med Calc Software Company, Mariake, Belgia). Student t-test untuk membandingkan parameter RBC dan fraksi Hb antara kelompok kontrol dan hipokromik mikrositik.

Perbandingan metode dengan Student-t test dan regresi

linier. Nilai P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

HASIL
1. Pemisahan hemoglobin normal dan varian oleh CE Dilakukan kontrol terhadap hb A,F,S,C (Gbr. 1A).

Hemoglobin utama, termasuk A, F, S, dan C dan Hb

normal dipisahkan dengan baik. Dalam sistem Minicap, pola fraksi keluar dari kanan ke kiri dengan urutan sebagai berikut: dari HbA2 sampai HbA (Gambar 1B).

Fraksi terglikasi tidak diseparasi dari HbA pada CE.

gambar. 1. Pola separasi Hb menggunakan CE terhadap kontrol AFSC (A) : kontrol, (B) : kontrol normal HbA2

2. Nilai Referensi

Expected values CE dari manufacturer

HBA : 96,8-97,8%, HbF : <0,5% HbA2 : 2,2-3,2%

validasi rekomendasi untuk laboratorium ini HbA : 96,8-97,8% HbF : <1% HbA2 : 2,2-3,5%

rentang normal CA orang dewasa

HbA : 96,8-97,8% HbF : <1% HbA2 : 1,9-3,5%

3. CBC dan fraksi Hb pada kontrol normal dan kelompok hipokromik mikrositik

Pada kelompok hipokromik mikrositik, Hb, Hct, MCV, MCH, dan

MCHC menunjukkan perbedaan yang nyata dibandingkan dengan kelompok kontrol (P <0,0001) (Tabel 1).

 Tidak ada perbedaan signifikan untuk kuantifikasi fraksi

Hb antara kedua kelompok (P> 0,05) (Tabel 2).

4. Perbandingan dua metode

Ada korelasi yang baik untuk pengukuran HbA (r = 0,9370, P

<0,0001), HbA2 (r = 0,8973, P <0,0001), dan HbF (r = 0,8010, p = 0,0304) antara kedua metode (Gambar 2) .

 Kedua teknik menunjukkan tingkat yang sama untuk HbA

(97,4 0,7% oleh CE; 97,4 1,1% oleh CA) dan HbA2 (2,5 0,6% oleh CE; 2,5 0,7% oleh CA)dan juga terhadap HbF (0,4 1,1% oleh CE; 0,5 2,7% oleh CA).

Tidak ada perbedaan signifikan secara statistik untuk

kuantifikasi Hb (P> 0,05) (Tabel 3).

Hasil px CE vs CA pada 143 spesimen

Kesesuaian keseluruhan dari 2 metode untuk fraksi Hb adalah 89,5% (128/143) (Tabel 4).

5. Kasus dengan fraksi Hb abnormal

Total fraksi Hb abnormal dideteksi oleh CE dan CA 1,4%.

Pada kelompok hipokromik mikrositik, 29 kasus HbA2 , 2 kasus HbA2 , 3 kasus HbF , dan 2 kasus dengan peningkatan HbA2 dan HbF
Setelah eksklusi pasien IDA 2 pasien (1,4%) diduga thalassemia minor. Salah satu, dg tingkat HbA2 6,3%, dikonfirmasi dengan sekuensing dan salah satu kasus peningkatan HbF karena IDA

Diskusi

-thalassemia terutama ditemukan di Mediterania, Afrika, Asia Tenggara

Di Korea dilaporkan sekitar 20 kasus thalassemia sejak 1988

studi ini, membandingkan CE dan CA untuk mengukur fraksi Hb pasien mikrositik hipokromik dalam kemampuan mendeteksi thalassemia dan Hb varian

Diagnosis thalassemia

analisis indeks eritrosit ,morfologi, kuantifikasi HbA2 menggunakan metode konvensional HPLC,elektrophoresis , dan teknik microcolumn

Kuantifikasi HbA2 penting karena pada kadar rendah dan hanya sedikit peningkatan pada penyakit dan Hb varian sering mengganggu pengukurannya

 CA rutin digunakan tetapi kurang akurat. HPLC adalah

metode pilihan tetapi mahal dan tidak tersedia secara rutin.

Penelitian sebelumnya menunjukkan CE

HbA2 dari HbE, HBc, dan HbS.

memisahkan

Metode ini : efisiensi tinggi (beberapa sampel dapat

dijalankan secara paralel), akurasi tinggi, dan otomatisasi penuh.

 Pada studi ini, terdapat hubungan yang baik untuk

pengukuran HbA, HbF, dan HbA2 antara CE dan CA.

Persentase kesepakatan fraksi Hb,CE dan CA : 89,5%. CA tidak mengidentifikasi beberapa penurunan HbA2 dan
kenaikan HbF. Ini menunjukkan bahwa CE lebih sensitif dari CA untuk mendeteksi fraksi Hb.

CA hanya mendeteksi 25% varian Hb. Beberapa studi menunjukkan presisi yang rendah untuk
kuantifikasi HbA2 berdasarkan elektroforesis.

Fitur menonjol metode CE kemampuan memisahkan

HbA2 sepenuhnya dari HbE.

 Dalam studi ini, 29 pasien mengalami penurunan HbA2.

Di antaranya, 25 kasus didiagnosis sebagai IDA, dan 4 kasus tersebut dianggap memiliki sifat -thalassemia. Dalam penelitian ini, salah satu donor yang diidentifikasi memiliki -thalassemia adalah dari Asia Tenggara, Burma. pertumbuhan migrasi dari daerah dengan prevalensi tinggi -thalassemia ke Korea.

 Frekuensi gen -thalassemia di Korea sekitar 0,1% . Pada studi ini, total fraksi hemoglobin abnormal : 1,4%
dideteksi oleh CE dan CA.

Prevalensi hemoglobinopathies sangat rendah di Korea,

sehingga elektroforesis Hb belum diperiksa rutin. CE disarankan sebagai alat skrining untuk gangguan hemoglobin pada populasi Korea.

Kesimpulan
CE sebanding dengan CA dalam hal pengukuran fraksi
Hb, dan cocok untuk skrining.

PICO
Population
: Pasien mikrositik hipokromik dengan atau tanpa anemia Intervention : Pemeriksaan elektroforesis metode kapiler Comparation : Pemeriksaan elektroforesis metode selulose asetat Out come : Pemeriksaan elektroforesis metode kapiler dapat menggantikan metode selulose asetat untuk pemeriksaan thalasemia dan hemoglobinopati pada laboratorium klinis.

Telaah kritis uji diagnostik

1. Validitas : Apakah penelitian uji diagnostik dilakukan dengan standar baku emas yang benar? Ya. Apakah tes diagnostik dilakukan terhadap pasien dengan spektrum yang sesuai dan dapat diterapkan dalam prakatek sehari-hari ? Ya Apakah tes (atau kelompok tes) divalidasi dengan kelompok kontrol? Ya

2. Penilaian uji diagnostik : tidak dilakukan karena studi ini tidak bertujuan untuk mencari sensitivitas /spesifisitas. 3. Kemamputerapan. Apakah uji diagnostik tersebut terjangkau, tersedia dan akurat? Ya Apakah keseluruhan uji diagnostik bermanfaat pada pasien? Ya Valid, penting, dapat diterapkan Level of evidence: 2b

Alpha Thalassaemia Classification (2).

trait due to deletion of one or two of the four alpha genes, asymptomatic (eg - / , --/ , - /- ). Hemoglobin H disease is the lack of three of the four genes resulting in alpha thalassaemia major. Hemoglobin Barts Hydrops Fetalis results from absence of all four genes, incompatible with post natal life.

Beta Thalassemia Classification.

thal major is homozygosity or compound heterozygosity resulting in severe phenotype. thal minor or trait is heterozygosity with asymptomatic phenotype. thal intermedia is an intermediate phenotype produced by a variety of genotypes.

Alpha Thalassaemia Major - target cells, microcytosis, hypochromia, NRBCs,

Thal Major anisocytosis, poikilocytosis, targets, tear drops, fragments, hypochromaia, basophilic stippling.

22

22

Table 1: Laboratory features in different clinical states.

Iron Deficiency Haemoglobin Serum Fe Transferrin Receptor N or Chronic Disease or N or N or N Iron Overload N N Thalassemia

N or or N N N or N

Transferrin Sat. Ferritin MCV Marrow Fe

Alpha Thalassemias : Hb fractions and indices

Genotype aa/aa -a/aa Diagnosis Haematology Clinical Signs Absence Absence Heterozygous a + Slight microcytosis Biological Signs Hb A : N HbA2 : N (2-3.5%) Hb A and HbA2: N Hb Barts 0-3% at birth Hb A and HbA2: N or Hb Barts 2-8% at birth

-a/-a - -/aa - -/-a

Homozygous a + Heterozygous a o ao/a+ compound heterozygote (Hb H disease)

microcytosis hypochromia

No significant clinical signs

microcytosis, hypochromia

Haemolytic anaemia splenomegaly

Hb A HbA2 (1.5%<) Hb Barts > 5% Hb H 10-20%

- -/- -

a o homozygote severe anaemia (hydrops foetalis) destruction of the erythroblasts

Severe hypoxia Absence of HbA and HbF Hb Barts 80-100% Hb Portland < 5%

Hemoglobinosis Hb S Sickle cell disease

Sickle cell

Indeks eritrosit
Mean corpuscular volume (MCV). MCV adalah ukuran
atau volume rata-rata eritrosit

Mean corpuscular hemoglobin (MCH). MCH adalah

jumlah rata-rata hemoglobin dalam eritrosit MCHC: adalah perhitungan rata-rata konsentrasi hemoglobin di dalam eritrosit. MCHC menurun (hipokromia) dijumpai pada kondisi di mana hemoglobin abnormal diencerkan di dalam eritrosit, seperti pada anemia dan kekurangan zat besi dalam talasemia. Peningkatan MCHC (hiperkromia) terdapat pada kondisi di mana hemoglobin abnormal terkonsentrasi di dalam eritrosit, seperti pada pasien luka bakar dan sferositosis bawan.

 RDW adalah variasi ukuran eritrosit. Dalam beberapa kasus

anemia, seperti anemia pernisiosa, variasi dalam ukuran eritrosit (anisositosis) bersama dengan variasi dalam bentuk (poikilositosis) menyebabkan peningkatan RDW. MPV adalah ukuran rata-rata trombosit/platelet. PDW merupakan indikasi variasi ukuran trombosit yang dapat menjadi tanda pelepasan platelet aktif.

100 90

Normal pattern

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 12 24 36 Age (months)
HbF HbA HbA2

Hb A: a2b2

Hb F: a2g2 Hb A2:a2d2
Adult Agarose gel Alkaline buffer Newborn

Direct detection of hemoglobins at 415 nm

Capillarys: 33 samples/hr, Minicap: 9 samples/hr

Hb identification for Capillarys/Minicap

Z 15 : Hb H Z 14 : // Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore Z 12 : Hb Barts, Hb J-Providence, Hb J-Mexico, Hb J-baltimore. Z 11 : Denaturated Hb A, Hb Kaoshiung Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom Penh Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Alegre.. Z 6 : Hb D-Punjab, denaturated Hb E, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kln. Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Kln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb aA2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant

Case 7: 65 years, Male, Hgb 9.4g/dl, Hematocrit 27.3

Co-migration with A2

A= 62.1 % A2 = 31.7%*

44

Case 7: Hb E migrates separately from Hb A2

Hb A
Hb E

Hb A2

45

Case 9: Diabetic patient, 61 years, Hb 11.6g/dl, hematocrit 34.8, MCV 85

Hb A

Hb C

Hb A 51.8% Hb A2 2.9% Hb C 35.9%

Hb A2

Slight anemia; compatible with heterozygote A/C

Example for a beta variant

Hb A a a b b
Beta variant: association a/bmutated

Hb A2
a a d d

Hb A

b variant (One additional peak)

a a Hb F

bm bm

Hb A2

Electrophoresis Principle.
Separation

of haemoglobins with electrophoresis at pH 8.4 (alkaline) and pH 6.2 (acid). Scanning allows quantification of the hemoglobin present, bands are seen by staining. At alkaline pH Hb C, E, A2 and O migrate together to form a single band, Hb S, D and G also co migrate.

Electrophoresis Principle (2).

At

acid pH Hb C separates from E and O and Hb S separates from D and G. Hb E and O cannot be separated by electrophoresis neither can Hb D and G.

HPLC Disadvantages (2).

Capillary

zone Electrophoretic method can be used to quantify Hb A2 in the presence of Hb S by eliminating interference from these adducts. Interference can also be eliminated by the use of micro anion-exchange column methodology. Integration errors can result in false decreases in the values obtained, although this can be minimized by applying known corrections.

Capillary electrophoresis

CE

Capillary electrophoresis (CE) was developed from

combining several features of different methods including the principle of gel electrophoresis, the fused silica capillary of gas chromatography (GC), and the highly sensitive detectors of highperformance liquid chromatography (HPLC).

CE
Separation in CE is based on different mobility of analytes under an electric field, which occurs in a capillary filled with buffer. Unlike other media (e.g., paper, agarose, and polyacrylamide gel), electrophoresis in a capillary can use a high voltage (up to 800 V/cm) due to the physical properties of fused silica capillaries. A large surface area to volume ratio of a capillary provides effective heat dissipation. The small dimension of a capillary requires small amounts of samples and buffer and the automation of CE requires less time and labor.

 In 1989, Karger organized the first

International Symposium on High Performance Capillary Electrophoresis (12) and, in the same year, the first commercial CE instrument was available. Since then, the number of publications on CE have been rapidly increasing due to its versatility, simplicity, and high efficiency.

The principle of

CE

The principle of CE is based on the different migration of solutes in an electric field, and electrophoresis is performed in narrow-bore capillaries filled with electrolyte. The mobility of analytes depends upon their sizes, charges, and degree of ionization, viscosity, temperature, and dielectric constant of the background electrolyte (BGE). Upon application of voltage, analytes

are driven by two forces, the electrophoretic migration and the electro-osmotic flow (EOF).

Indeks eritrosit

Ntaios et al., 2007. Ann Hematol 86:487491

Indeks eritrosit

Niazi, et al., 2010. Gomal journal of medical sciences2010,v0l 8 n0 2

 Several acquired conditions are associated with

modest elevations of HbF. They include pregnancy, recovery from marrow hypoplasia, aplastic anemia, leukemia, thyrotoxicosis, hepatoma, and juvenile chronic myeloid leukemia.4 The latter condition is exceptional in that it seems to reflect a genuine reversion to fetal erythropoiesis.5 The remainder seem to be examples of the transient reactivation of HbF under conditions of acute erythropoietic stress, that is, rapid expansion of the erythron.6