Autoantibodies to neutrophil extracellular traps represent a potential

serological biomarker in rheumatoid arthritis

Abstrak
Neutrophil extracellular traps (NETs) adalah jaringan kromatin ekstraseluler yang
dihiasi dengan protein antimikroba, dibentuk oleh neutrofil untuk menjebak patogen. NETs
terlibat dalam pembentukan reaksi autoimun. Di sini, kami menyelidiki reaktivitas antibodi
serum rheumatoid arthritis (RA) dengan NETs dan mengeksplorasi apakah antibodi anti-NET
(ANETA) memiliki potensi sebagai biomarker pada RA. Untuk mengukur ANETA, kami
mengembangkan ELISA dengan NETs yang diisolasi dari neutrofil manusia yang terstimulasi
dan memverifikasi hasil dengan pewarnaan imunofluoresensi NETs. ANETA terdeteksi pada
22% -69% RA sera. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati dalam reaktivitas serum
RA dengan NETs yang berasal dari pasien RA dan neutrofil kontrol yang sehat, atau dengan
NETs yang diinduksi oleh phorbol 12-miristat 13-asetat atau kalsium ionofor A23187.
ANETA sudah terdeteksi di awal pada pasien RA yang baru didiagnosis dan peningkatan
serta penurunan level diamati pada sampel dengan median follow-up selama 7 tahun. Dengan
ANETA ELISA, kami menunjukkan bahwa ANETA juga terdapat pada serum pasien lupus
erythematosus (36%), Sjögren's syndrome (76%) dan Skleroderma (61%). Selain antibodi
terhadap NETs, juga terdapat NETs atau fragmen NET dalam RA sera yang ditentukan
dengan menggunakan sandwich ELISA. Peningkatan level NETs atau fragmen NET
terdeteksi di 32% serum. Untuk menilai potensi ANETA sebagai biomarker pada RA, kami
membandingkan positif ANETA dengan gambaran klinis lainnya. Kehadiran ANETA secara
signifikan lebih tinggi pada pasien rheumatoid factor (RF) -positif, tetapi tidak berkorelasi
dengan anti-citrullinated protein antibodies (ACPA), atau dengan adanya fragmen NET
dalam serum. Selain itu, tidak ada korelasi yang diamati dengan usia, jenis kelamin, onset
penyakit, aktivitas penyakit dan penanda inflamasi. Penemuan ini menunjukkan bahwa
ANETA mungkin dapat menjadi independent biomarker pada RA dan mungkin juga pada
penyakit autoimun lainnya.

Pendahuluan
Rheumatoid arthritis (RA) adalah penyakit autoimun, yang mempengaruhi sekitar 1%
populasi dunia dan ditandai dengan kerusakan sendi yang dimediasi oleh peradangan [1]. Dua
reaktivitas autoantibodi yang sering ditemukan dalam serum pasien RA yaitu antibodi anti
citrullinated protein (ACPA) dan antibodi terhadap bagian Fc dari IgG yang disebut
rheumatoid factor (RF), termasuk dalam kriteria ACR / EULAR untuk klasifikasi RA [2].
Kehadiran antibodi ini berkorelasi dengan aktivitas penyakit, prognosis dan hasil [3]. Baik
ACPA dan RF adalah biomarker sensitif untuk RA, meskipun RF kurang spesifik [4].
Sekelompok pasien RA yang relatif kecil, meskipun signifikan, tidak memiliki ACPA
maupun RF (seronegative RA) dan sedang didiagnosis melalui pemeriksaan fisik, pencitraan
sendi yang terkena, atau dengan cara lain. Identifikasi biomarker baru untuk RA yang
memfasilitasi diagnosis, memiliki potensi prognostik untuk hasil penyakit, atau prediktor
untuk respons pengobatan, merupakan tantangan yang terus berlanjut.
Sekitar 15 tahun yang lalu, neutrophil extracellular traps (NETs) digambarkan
sebagai mekanisme baru neutrofil untuk melawan infeksi [5]. NET terdiri dari kromatin yang
dicampur dengan protein granular dan digunakan untuk menjebak patogen. NET terlibat
dalam beberapa penyakit autoimun, seperti lupus eritematosus sistemik (SLE), vaskulitis
terkait ANCA dan RA [6-8]. Neutrofil pasien RA ditemukan memiliki kecenderungan yang
meningkat untuk membentuk NET dan merespons lebih kuat terhadap rangsangan
neutrofilaktivasi [9-11].
Menariknya, beberapa penelitian telah mengidentifikasi protein sitrulin pada NET,
termasuk histon, neutrofil elastase, azurocidin dan myeloid cell nuclear differentiation
antigen (MNDA) [9,12,13]. Protein ini mungkin mengandung epitop yang dikenali oleh
autoantibodi dalam serum RA. Bahkan, RA sera terbukti memiliki antibodi terhadap NET,
dan reaktivitasnya berkurang ketika ACPA dari serum habis [9,13-15]. ACPA juga telah
dilaporkan untuk merangsang pembentukan NET, menunjukkan umpan inflamasi ke depan
[9,16,17]. Sedikit yang diketahui tentang antibodi anti-NET lain pada RA yang tidak
menargetkan citrulline, dan prevalensi keseluruhan ANETA pada pasien RA tidak jelas.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai prevalensi autoantibodi terhadap NET
di RA dan potensinya sebagai sebuah biomarker di RA. Prevalensi ANETA dalam serum
pasien RA ditentukan dengan ELISA anti-NET dengan empat jenis NET yang berbeda dan
hasilnya diverifikasi dengan uji imunofluoresensi. Untuk menentukan nilai klinis ANETA
sebagai biomarker, hasilnya dibandingkan dengan kadar ACPA dan RF. Akhirnya, kami
membandingkan level ANETA dengan parameter klinis lainnya seperti keberadaan NET
yang bersirkulasi atau fragmen NET, skor aktivitas penyakit dan penanda inflamasi.

Material and method

2.1 Pasien sera
 Studi ini dilakukan sesuai dengan rekomendasi dari Komite Layanan Etika Penelitian
Nasional (NRES) Northwest (Greater Manchester West), Inggris untuk pasien RA dan telah
disetujui oleh wilayah 'Commissie Mensgebonden Onderzoek' Arnhem Nijmegen, dengan
persetujuan tertulis dari semua subjek sesuai dengan Deklarasi Helsinki. Semua pasien RA
memenuhi kriteria ACR untuk RA dan direkrut dari klinik di University Hospital Aintree di
Liverpool dan di Pusat Medis Universitas Radboud / Sint Maartenskliniek di Nijmegen. Sera
dari pasien RA pada awal dan tindak lanjut adalah dari Leiden Early Arthritis Clinic dan telah
dijelaskan sebelumnya [18]. Skleroderma, lupus eritematosus sistemik dan Sera pasien
sindrom Sjögren adalah hadiah dari Dr. Alain Meyer (Université de Strasbourg, Strasbourg,
Prancis).

2.2 Kuantifikasi RF pada sera

RF ditentukan dengan ELISA (Rheumatoid Factor Ab ELISA kit; Cat Abnova. no.
KA1442) sesuai dengan instruksi pabrikan.

2.3 Pengukuran komponen NET terlarut dalam sera

Jumlah NET dalam serum dihitung seperti yang telah dijelaskan sebelumnya,
menggunakan ELISA NET [19]. Singkatnya, ELISA sandwich dilakukan dengan antibodi
anti-MPO (Biorad Cat. No 0400–0002) berfungsi sebagai antibodi penangkap untuk
mengikat NET atau NET sisa-sisa. Antibodi anti-DNA terkonjugasi menjadi peroksidase (cell
death detection ELISAPLUS, Roche, Cat. no 11774425001) kemudian digunakan untuk
mendeteksi NET terikat.

2.4 Isolasi neutrofil dan induksi pembentukan NET

Darah dikumpulkan dari donor yang sehat atau dari pasien RA (dengan informed
consent dari semua subjek). Untuk 25 ml darah anti-koagulasi ditambahkan 5 ml HetaSep
(Stemcell Technologies, Cat. No 07806), diikuti dengan inkubasi selama 30 menit pada suhu
37 ° C. Lapisan atas mengandung sel darah putih kemudian dikumpulkan dan diletakkan di
atas 15 ml Ficoll (GE healthcare, Cat. no 17-1440-02) dan disentrifugasi selama 30 menit
pada 500 × g. Granulosit dicuci sekali dengan PBS dan sisa darah merah sel dihilangkan
dengan lisis hipotonik dengan amonium klorida (150 mM). Selanjutnya, granulosit
dikumpulkan oleh sentrifugasi dan diresuspensi dalam media DMEM / F12 yang telah
dihangatkan sebelumnya tanpa fenol-merah (Gibco, Kat. no 11039-021). Per cawan petri (60
cm2), 20 hingga 30 juta neutrofil ditanam dalam total volume 15 ml. Sel-sel dibiarkan
menempel pada pelat selama 30 menit pada suhu 37 ° C dan kemudian distimulasi dengan 5
nM PMA (Sigma Aldrich, Kat no P1585) atau 4 μM A23187 (Sigma Aldrich, Cat. No
C7522). NET dibiarkan terbentuk selama kultur selama 3 jam dan 15 menit. Untuk
menghambat degradasi proteolitik dari protein terkait NET, PMSF ditambahkan pada 2 jam
15 m, 2 jam 30 m, 2 jam 45 m dan 3 jam setelah induksi untuk sel yang diberi perlakuan
PMA dan pada 2 jam 45 m dan 3 jam setelah stimulasi A23187 [20,21]. Setelah 3 jam 15 m,
media kultur dibuang dan sel-selnya dicuci sekali dengan PBS sebelum diinkubasi dengan 4
ml 5 U / ml mikrokokokus nuclease (MNase; Boehringer Mannheim, Cat. no. 85446620)
dalam media DMEM / F12 yang dihangatkan selama 10 menit pada suhu 37 ° C. Supernatan
itu dikumpulkan, ditambah dengan 5 mM EDTA untuk menghambat MNase dan
disentrifugasi selama 5 menit pada 1500 × g untuk menghilangkan sisa-sisa sel. Hasil panen
NET disuplementasi dengan 10% gliserol dan 1 mM dithiothreitol dan disimpan pada suhu
-20 ° C sampai digunakan lebih lanjut.

2.5 ELISA ANETA

Beberapa panen NET yang berasal dari beberapa donor darah Pasien RA atau individu
sehat, dan dari neutrofil terstimulasi dengan PMA atau A23187 dikumpulkan untuk
menghasilkan sediaan NET homogen yang cukup untuk analisis semua sampel yang diuji.
Jumlah DNA ditentukan dengan menambahkan 5 mM Sytox Hijau dan mengukur DNA
menggunakan kurva kalibrasi DNA. Dalam pelat Nunc Maxisorp (Thermo Fisher Scientifc,
Kat. No 442404), Panen NET yang setara dengan 675 ng DNA ditambahkan ke setiap sumur
(dalam 100 μl DMEM) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 ° C. Untuk analisis sampel
dari RA kohort B dan C dan dari baseline, dan sampel dari penyakit autoimun lainnya
menggunakan preparat NET campuran dari neutrofil yang distimulasi oleh PMA dan
A23187. Selanjutnya sumur ditutup dengan inkubasi selama 1 jam di kamar suhu dengan
blocking buffer (5% susu kering non-lemak dalam PBS mengandung 0,05% Tween-20
(PBST)). Setelah blocking, serum pasien ditambahkan, diencerkan 100 kali lipat dalam
blocking buffer, diikuti dengan inkubasi selama 1,5 jam pada 37 ° C. Setelah 3 kali pencucian
dengan PBST, sumur diinkubasi dengan 100 μl peroxidase-conjugated goat-anti-human
immunoglobulin (Dako, Kat. No P0212), diencerkan 2000 kali lipat dalam blocking buffer,
selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah pencucian akhir dengan PBST (dua kali) dan PBS
(dua kali), sumur diinkubasi dengan TMB (Invitrogen, Cat. no 00-4201-56) menurut
pedoman pabrikan. Reaksi pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 2 M H2SO4 dan
diukur pada absorbansi 450 nm dengan plate reader (Tecan Sunrise).
2.6 Mikroskopi imunofluoresensi
Neutrofil ditanam pada slide kaca mikroskopis, pembentukan NET diinduksi, dan
kultur diperlakukan dengan PMSF seperti yang dijelaskan atas. Setelah 3 jam 15 m, slide
dicuci satu kali dengan PBS sebelum sel difiksasi dengan metanol dingin selama 30 menit
pada suhu -20°C. Setelah 3 dicuci dengan aseton dingin, slide dikeringkan dengan udara dan
disimpan di −20°C sampai digunakan lebih lanjut. Untuk imunofluoresence, slide tersebut di
blok dengan blocking buffer (5% susu kering tanpa lemak dalam PBS yang mengandung
0,05% Tween-20 (PBST)) selama 60 menit pada suhu kamar. Selanjutnya sel/NET diinkubasi
dengan pengenceran 100 kali lipat serum pasien dalam larutan blocking buffer selama 1,5
jam pada suhu kamar. Setelah tiga kali pencucian dengan PBST, sel diinkubasi dengan 400
kali lipat pengenceran ALEXA Fluor® 568-conjugated goat-anti-human IgG antibody (Life
Teknologi, cat. no. A11004) dalam blocking buffer selama 30 menit di ruangan suhu. Slide
dicuci tiga kali dengan PBS sebelum pewarnaan dengan 1 μg/ml 4′,6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI, Sigma Aldrich) di PBS selama 5 menit. Setelah pencucian terakhir di
PBS dan Milli-Q air, slide ditutup dengan coverslip menggunakan Mowiol (Sigma Aldrich).
Pewarnaan sel dianalisis pada mikroskop Leica DMRA Fluoresensi dengan kamera Leica
DFC340 FX CCD.

2.7 Analisis gambar

Analisis gambar imunofluoresensi dilakukan secara semi-otomatis menggunakan
perangkat lunak FIJI [22]. Untuk mengukur pengikatan antibodi RA ke NETs, mask struktur
NET ditentukan dengan mensubstratsi mask semua badan sel dari mask semua struktur
terwarna di gambar. Mask dari semua struktur terwarna pada gambar dibuat dengan ambang
batas rendah untuk menghilangkan piksel latar belakang. Mask sel badan dibuat dengan
ambang batas tinggi untuk memilih inti sel atau badan sel yang masih mengandung tingkat
DNA yang tinggi. Pendekatan ini memungkinkan penentuan intensitas fluoresensi dari NET
(dinyatakan dalam nilai warna abu-abu), yang diukur di DAPI dan ALEXA Fluor 568
saluran. Akibatnya, pewarnaan NET oleh RA sera (ALEXA Fluor 568 channel) dapat
dinormalisasi berdasarkan jumlahnya NET yang diukur dalam saluran DAPI.

2.8 Analisis statistik

 Signifikansi perbedaan antar dataset ditentukan oleh uji-t Student. Untuk analisis
korelasi, dihitung dengan Pearson r. Pembuatan grafik dan analisis statistik dilakukan dengan
menggunakan Perangkat lunak GraphPad Prism 7 (versi 7.04, GraphPad Software, Inc).

3. Hasil
3.1. Analisis ELISA ANETA (anti-NET antibodies) dalam serum pasien RA
Untuk mendeteksi keberadaan antibodi anti-NET (ANETA) dalam serum, kami
mengembangkan ELISA menggunakan preparat NET yang diambil dari neutrofil yang baru
diisolasi. Karena telah dilaporkan sebelumnya bahwa NET yang diinduksi oleh rangsangan
yang berbeda sebagian berbeda dalam komposisi, kami pertama kali menilai reaktivitas 168
serum RA (Cohort A) dengan NET yang diinduksi oleh A23187 atau PMA, menggunakan
neutrofil dari individu yang sehat dan pasien RA. NET yang tidak dapat bergerak diinkubasi
dengan 36 kontrol yang sehat dan 168 serum RA untuk memungkinkan ANETA mengikat.
Sinyal rata-rata serum kontrol sehat ditambah dua kali deviasi standar digunakan sebagai nilai
batas.
Secara total, 85 dari 168 serum RA (51%) menunjukkan reaktivitas terhadap
setidaknya satu dari preparat NET (pada gambar 1A).

Lebih dari 40% serum RA reaktif dengan NET dari neutrofil RA; 43% bereaksi
dengan NET yang diinduksi A23187 dan 39% bereaksi dengan NET yang diinduksi oleh
PMA. Dua puluh delapan persen serum RA reaktif dengan NET dari individu sehat,
dihasilkan baik dengan A23187 atau dengan PMA. Meskipun NET dari kontrol yang sehat
agak lebih jarang dikenali dibandingkan dengan yang dari pasien RA, perbedaan ini
tampaknya tidak signifikan secara statistik (nilai p = 0,278). Perbedaan antara reaktivitas RA
terhadap NET yang diinduksi A23187 dan yang diinduksi PMA hampir mencapai
signifikansi statistik (p-value = 0.06). Serum positif ANETA yang kuat menunjukkan
reaktivitas dengan sebagian besar atau semua preparat NET, sedangkan serum yang kurang
reaktif kuat hanya mengenali satu atau sebagian dari sediaan NET (pada gambar 1B).

Fig. 1. ANETA in sera of RA patients. (A) ANETA was measured in 168 RA sera and 36 healthy control sera using ELISA
with pooled NET preparations obtained from neutrophils of human controls (HC) and RA patients (RA), which were
stimulated by either A23187 or PMA. The reactivity values (a.u.: arbitrary units) were calculated by dividing the absorption
of each individual serum by the average of the healthy control sera. Blue bars represent the cut-off values (mean plus 2 times
standard deviation of healthy control sera that were analysed in parallel on the same plate). *p < 0.01, **p < 0.001, Student's
t-test. (B) Heatmap of the reactivity of the RA sera with the different types of NETs. Red intensity corresponds to reactivity
value, blue indicates no reactivity. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred
to the Web version of this article.)

3.2. ANETA dalam serum pasien RA dideteksi dengan imunofluoresensi

Untuk mendukung hasil yang diperoleh dengan ELISA ANETA, kami menganalisis
serum yang sama dalam uji imunofluoresensi. Singkatnya, neutrofil pasien RA dan individu
sehat diletakkan pada slide kaca dan distimulasi dengan PMA untuk membentuk NET.
Setelah fiksasi sel dan NET, slide diinkubasi dengan pasien RA dan serum kontrol yang sehat
dan pengikatan antibodi divisualisasikan dengan antibodi sekunder berlabel Alexa-568
dengan DAPI digunakan sebagai counterstain. Gambar digital direkam dengan mikroskop
fluoresensi dan diukur dengan pendekatan semi-otomatis menggunakan perangkat lunak FIJI.
Script FIJI membedakan antara autoantibodi yang mengikat NET dan badan sel seperti yang
dijelaskan di bagian Metode. Semua sampel, 112 RA dan 19 serum kontrol sehat, dianalisis
dalam uji imunofluoresen ini (pada gambar 2A).
 Juga digunakan dalam ELISA ANETA yang dijelaskan di atas. Penghitungan
fluoresensi NET oleh skrip FIJI menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan
antara sinyal yang diperoleh dengan NET yang berasal dari neutrofil RA dan dari neutrofil
kontrol yang sehat (data tidak ditampilkan). Data kuantifikasi berbasis FIJI berkorelasi baik
dengan penilaian gambar yang sama secara kasat mata, menunjukkan bahwa pendekatan ini
menghasilkan kuantifikasi ANETA yang akurat. Secara total, analisis imunofluoresensi
menunjukkan bahwa 48% pasien RA positif ANETA (pada gambar 2B).

Ini serupa dengan persentase serum pasien RA yang ditemukan mengandung ANETA
oleh ELISA (51%). Memang, skor imunofluoresensi berkorelasi cukup baik dengan skor
ELISA (Pearson r = 0,601, p <0,0001), menunjukkan bahwa keduanya metode dapat
diterapkan untuk mengukur reaktivitas serum RA terhadap NET (pada gambar 2C).
Fig. 2. Reactivity of RA patients' sera with NETs visualized by immunofluorescence and quantified by FIJI. (A) Examples of
images representing ANETA-positive and ANETA-negative RA sera. (B) FIJI-based quantification of ANETA in sera of
RA patients and healthy controls (HC) (n = 112 *p < 0.01). (C) Correlation between ANETA detection by ELISA and by
immunofluorescence (FIJI score). a. u.: arbitrary units. n = 112.

3.3. ANETA pada kelompok pasien RA lain dan penyakit autoimun lainnya
Untuk mendapatkan lebih banyak wawasan tentang frekuensi terjadinya ANETA pada
pasien RA, sampel dari dua kohort RA lainnya (B dan C) dianalisis dengan ELISA ANETA.
Juga dalam kohort RA ini ANETA sering terdeteksi, meskipun persentase sampel ANETA-
positif menunjukkan perbedaan yang nyata, masing-masing 22% dan 69% (pada tabel 1).
Kombinasi dari semua serum RA yang diuji (Kelompok A, B dan C) mengarah ke frekuensi
41%. Untuk menyelidiki apakah ANETA lebih disukai ditemukan dalam serum RA atau
terjadi juga dalam serum dari pasien autoimun lain, sampel serum pasien dengan Systemic
Lupus Erythematosus (SLE), sindrom Sjögren (SjS) dan scleroderma (SSc) dianalisis untuk
mengetahui keberadaan ANETA (pada tabel 1). Sebagian besar pasien yang sensitif ANETA
ditemukan dalam kelompok SjS (76%), diikuti oleh kelompok SSc (61%). Pada SLE 36%
pasien positif ANETA, tetapi pasien SLE positif ANETA rata-rata memiliki skor ELISA
tertinggi dibandingkan dengan kelompok penyakit lainnya.
3.4. ANETA pada pasien RA yang baru didiagnosis dan setelah tindak lanjut
Telah didokumentasikan dengan baik bahwa yang terbaik dikarakterisasi autoantibodi
di RA, ACPA dan RF, dalam banyak kasus dapat dideteksi sejak awal selama perkembangan
penyakit. Untuk mendapatkan lebih banyak wawasan tentang penampilan ANETA selama
RA, sampel diambil pada awal (BL) dan setelah tindak lanjut rata-rata 7 tahun (FU; IQR:
6,2–7,9 tahun) diuji dalam ELISA ANETA. ANETA hadir baik dalam sampel BL dan FU
(pada gambar 3).

Fig. 3. Presence of ANETA in RA at baseline and after follow-up. (A) Serum was taken from 34 RA patients shortly after
diagnosis (BL) and after a median follow-up of 7 years (FU). The presence of ANETA was determined by ANETA ELISA.
The reactivity values (a.u.: arbitrary units) were calculated by dividing the absorption of each individual serum by the
average of the healthy control sera. (B) Average ANETA reactivities of BL and FU samples (n = 34).

Baik peningkatan dan penurunan tingkat ANETA diamati pada sampel FU

dibandingkan dengan sampel BL yang cocok. Tidak ada perbedaan signifikan dalam tingkat
ANETA antara sampel BL dan FU yang diamati.

3.5. NET yang beredar di serum pasien RA

Kehadiran ANETA dalam serum pasien RA menimbulkan pertanyaan apakah juga
fragmen NET atau NET juga hadir dalam serum ini. Kehadiran fragmen NET dapat
meningkatkan kemungkinan mengembangkan autoantibodi terhadapnya. Untuk menyelidiki
kemungkinan ini, kami menerapkan sandwich ELISA untuk mendeteksi fragmen NET dalam
serum RA kohort A. Sebuah antibodi monoklonal tikus yang tidak dapat bergerak terhadap
myeloperoxidase (MPO) digunakan untuk menangkap kompleks yang mengandung MPO
dalam serum pasien. Kompleks NET yang ditangkap dideteksi dengan antibodi anti-DNA
monoklonal terkonjugasi peroksidase. Tingkat variabel dari fragmen NET terdeteksi di 32%
dari serum RA (pada gambar 4A).

Menariknya, kami tidak menemukan korelasi yang signifikan antara NET yang
beredar dan ANETA (pada gambar 4B).

Fig. 4. Circulating NETs in RA patient sera. (A) Using a sandwich ELISA circulating NETs in sera of RA patients (n = 110)
and healthy controls (n = 9) were determined. *p < 0.05 (B) Correlation between circulating NETs in RA sera and ANETA
as measured by ELISA (n = 110).

3.6. ANETA dan jaringan sirkulasi pada pasien RA seropositif dan seronegatif
Untuk menyelidiki apakah keberadaan ANETA atau NET yang bersirkulasi dikaitkan
dengan autoantibodi yang sering ditemukan di RA, RF dan ACPA, kejadian bersama mereka
dianalisis. Tidak ada hubungan yang diamati antara ANETA dan ACPA yang diukur dengan
tes anti-CCP2 untuk RA kohort A (pada gambar 5A). Hal ini menunjukkan bahwa reaktivitas
anti-NET tidak atau hanya pada tingkat tertentu dimediasi oleh pengenalan epitop
citrullinated pada NET. Ini dikuatkan oleh hasil yang diperoleh dengan RA kohort B & C.
Sebaliknya, tampaknya tingkat ANETA secara signifikan lebih tinggi pada serum RF-positif
daripada pada serum RF-negatif (pada gambar 5 B, p <0,001). Tidak ada hubungan signifikan
yang ditemukan antara tingkat NET yang bersirkulasi dan ACPA atau RF (pada gambar 5C
dan 5D). Kurangnya hubungan antara ANETA dan ACPA dan antara NET yang bersirkulasi
dan ACPA menunjukkan bahwa ANETA dan / atau NET yang bersirkulasi mungkin menarik
untuk klasifikasi subkelompok seronegatif pasien RA. Namun, frekuensi kemunculannya
pada kelompok pasien ini relatif rendah. Hanya 1 dari 27 pasien seronegatif yang memiliki
ANETA dan jaringan sirkulasi yang terdeteksi hanya pada 4 pasien ini.

Fig. 5. Association of ANETA and circulating NETs with ACPA and RF. (A) Average ANETA ELISA score for ACPA-
negative and positive (anti-CCP2) sera. (B) Average ANETA ELISA score for RF-negative and positive sera. n = 168 *p <
0.001, student's t-test. (C) Average circulating NETs level for ACPA-negative and positive (anti-CCP2) sera. (D) Average
circulating NETs level for RF-negative and positive sera. n = 110.

Asosiasi ANETA dengan RF mungkin setidaknya sebagian dapat dijelaskan dengan

pengikatan RF ke wilayah Fc ANETA yang telah mengikat target mereka pada NET dan
dengan demikian meningkatkan sinyal. Lebih jauh, RF dikenal karena ikatan non-spesifiknya
dan interferensi dengan tes laboratorium lain yang mendeteksi antibodi. Karena IgM juga
merupakan isoform RF yang paling menonjol di RA, kami mengulangi ELISA ANETA kami
dengan menggunakan antibodi sekunder yang khusus untuk IgG. Kami tidak menemukan
perbedaan antara anti-IgG dan anti-IgG, -IgA, -IgM sebagai antibodi sekunder, menunjukkan
bahwa RF tidak menghasilkan hasil positif palsu dalam uji ANETA kami (data tidak
ditampilkan).
3.7. Asosiasi ANETA dengan parameter demografis dan klinis
Untuk mendapatkan lebih banyak wawasan tentang nilai klinis ANETA sebagai
biomarker, kami menyelidiki hubungannya dengan fitur klinis. Selain usia dan jenis kelamin,
tingkat ANETA pasien RA positif ANETA dibandingkan dengan durasi penyakit dan skor
aktivitas (DAS28) dan dengan penanda inflamasi umum C-reactive protein (CRP) dan laju
sedimentasi eritrosit (LED). Tidak ada korelasi yang diamati untuk salah satu fitur ini (pada
gambar 6).

Diskusi
Dalam penelitian ini kami telah menunjukkan bahwa sebagian besar pasien RA dan
pasien dengan penyakit autoimun lainnya memiliki antibodi terhadap NET. ANETA dalam
serum pasien dideteksi dengan baru tes ELISA yang dikembangkan dan dengan
imunofluoresensi, dan signifikan korelasi yangantara hasil yang diperoleh dengan kedua
metode tersebut diamati. Reaktivitas sera RA dengan NET yang dihasilkan dengan neutrofil
dari donor yang berbeda, pasien RA atau kontrol yang sehat, dan dihasilkan pada stimulasi
dengan PMA atau A23187, tidak secara signifikan berbeda. Kehadiran ANETA berkorelasi
lemah dengan RF, tetapi tidak dengan ACPA, NET yang bersirkulasi dalam serum,
perkembangan penyakit, aktivitas penyakit atau penanda inflamasi. Hal ini membuat ANETA
sebagai biomarker independen dan studi tambahan harus mengungkapkan apakah hal itu
mungkin terkait dengan subkelompok klinis RA dan pasien autoimun lainnya. Sepengetahuan
kami, ini adalah studi pertama yang melaporkan prevalensi ANETA dalam RA sera.
Kehadiran ANETA dalam serum RA telah dilaporkan sebelumnya, tetapi penelitian ini tidak
membahas frekuensi ANETA terjadi pada pasien RA [9,13,25].
Penelitian kami menunjukkan bahwa antibodi terhadap NET sering ditemukan pada
pasien RA (22% -69% dari pasien RA), dan seringkali sudah dapat dideteksi pada awal. NET
dan ANETA diusulkan untuk berkontribusi pada permulaan dan perkembangan RA [9], tetapi
bukti masih kurang. Sejak NET dibentuk sebagai respon terhadap patogen, fragmen NET
mungkin dibersihkan oleh fagosit lokal bersama dengan sisa-sisa bakteri, yang dapat
bertindak sebagai adjuvan dan dengan cara itu memulai respon autoimun terhadap NET pada
individu yang rentan secara genetik [15]. Setelah respon imun terhadap NET dimulai,
ANETA mungkin berkontribusi pada lingkaran setan peradangan pada pasien RA. ANETA
terikat ke NET dapat mengaktifkan sistem komplemen melalui jalur klasik, yang mengarah
ke respon inflamasi [26].
Kami mengamati variasi dalam prevalensi ANETA dalam tiga RA yang kohort diuji,
yang bervariasi dari 22% hingga 69%. Meskipun perbedaan ini mungkin disebabkan oleh
perbedaan dalam pengambilan sampel pasien dan penyimpanan sampel, akan menarik untuk
menyelidiki apakah perbedaan terapeutik mempengaruhi terjadinya ANETA pada pasien.
Analisis sampel BL dan FU dari 34 pasien RA tidak mendukung perubahan umum pada
tingkat ANETA selama perjalanan penyakit. Penjelasan penyebab yang mendasari fluktuasi
yang diamati pada subset pasien membutuhkan penelitian lebih lanjut. Kami juga telah
menilai prevalensi ANETA pada pasien dengan SLE, SjS dan SSc dan menyimpulkan bahwa
produksi ANETA tidak secara spesifik berhubungan dengan RA. Kehadiran ANETA pada
penyakit lain, khususnya SLE, telah dilaporkan sebelumnya oleh beberapa peneliti [21,27].
Meskipun kami mengamati frekuensi ANETA yang lebih rendah pada SLE dibandingkan di
SjS dan SSc, tingkat reaktivitas tampak paling tinggi pada SLE.
Studi tambahan dengan jumlah sampel pasien yang lebih besar akan diperlukan untuk
menarik kesimpulan yang baik tentang prevalensi ANETA pada autoimun, dan mungkin juga
penyakit inflamasi lainnya. Memang, ANETA juga ditunjukkan pada mikroskopik
poliangiitis [28]. Epitop yang dikenali oleh ANETA tetap tidak diketahui. Hasil banyak
penelitian telah menunjukkan bahwa jaring mengandung citrullinated protein[9,12,13], dan
karena itu, ada kemungkinan bahwa setidaknya beberapa dari mewakili Aneta ACPA.
Reaktivitas ANETA dalam serum RA tidak berkorelasi dengan reaktivitas ACPA, yang
secara kuat menunjukkan bahwa epitop lain memainkan peran yang lebih menonjol. Ada
kemungkinan bahwa NET berisi beberapa epitop yang dikenali oleh serum yang berbeda.
Pengetahuan tentang autoepitop terkait NET utama akan memfasilitasi pengembangan
ELISA anti-NET yang lebih standar. Kebutuhan sampel darah manusia segar dan prosedur
yang secara teknis menantang untuk menghasilkan NET menyiratkan bahwa NET yang
disiapkan secara independen mungkin menunjukkan beberapa heterogenitas.
Meskipun pengumpulan hasil panen NET mungkin setidaknya sebagian
menyelesaikan masalah ini, penting untuk dicatat bahwa kami tidak mengamati perbedaan
yang signifikan antara pengenalan NET dari kontrol yang sehat dan pasien RA, atau antara
NET yang diinduksi oleh PMA dan A23187. Menariknya, Chapman dan rekannya
menunjukkan bahwa komposisi protein NET yang diinduksi oleh PMA dan A23187 memang
menunjukkan perbedaan [12], yang menunjukkan bahwa NET universal komponen
memberikan antigenisitas utamanya. Kami memvalidasi ELISA anti-NET kami dengan
melakukan immunofluorescent pewarnaan dari NET dengan serum yang sama yang diuji
dalam ELISA. Ada korelasi yang signifikan antara hasil dari kedua metode, yang mendukung
penerapan ELISA anti-NET. Namun, beberapa serum menunjukkan reaktivitas tinggi dengan
NET dalam imunofluoresensi, tetapi memiliki respons ANETA yang relatif rendah dalam
ELISA atau sebaliknya. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan teknis antara kedua
teknik tersebut, karena immunofluorescent pewarnaan dari NET mencakup langkah fiksasi,
sedangkan NET tidak ditetapkan dalam ELISA. Fiksasi dapat mempengaruhi aksesibilitas
dan struktur epitop.
Menariknya, ANETA tidak berkorelasi dengan keberadaan NET fragmen dalam
serum. Kemunculan bersama fragmen ANETA dan NET dalam serum beberapa pasien
menimbulkan pertanyaan tentang sejauh mana ANETA dan NETs ada sebagai kompleks
imun dan sejauh mana imun tersebut kompleks mempengaruhi deteksi mereka dalam tes yang
diterapkan. ANETA Pengikatan ke NET dalam serum dapat mengganggu pengikatannya ke
NET dalam ANETA ELISA dan uji imunofluoresensi. Akibatnya, tingkat ANETA yang
terdeteksi mungkin merupakan perkiraan yang terlalu rendah dari sebenarnya tingkat yang.
Demikian pula, ANETA yang mengikat NET yang bersirkulasi dapat mengurangi tingkat
NET yang dapat dideteksi dalam serum. Studi lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi
masalah ini.

Kesimpulan
Dalam studi ini, ELISA anti-NET yang dikembangkan dapat digunakan untuk
mendeteksi ANETA dalam serum manusia. Sebagian besar dari pasien RA dini tampaknya
memiliki antibodi terhadap NET dalam serumnya dan sekitar sepertiga dari pasien memiliki
tingkat NET (-fragmen) yang dapat dideteksi. ANETA tidak spesifik untuk RA, tetapi juga
ditemukan dalam serum dari pasien dengan penyakit autoimun lainnya. ANETA secara
signifikan lebih tinggi pada pasien RF positif, tetapi ANETA tidak terkait dengan ACPA atau
parameter klinis lainnya. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki nilai klinis
ANETA dan NET (-fragment) yang bersirkulasi.