SPEKTOFOTOMETER UV-VIS

A. Sejarah Spektofotometer UV-Vis

Senyawa organik terkonjungsi menyerap UV (190-400 nm) atau terlihat
(400-700 nm) cahaya semakin besar derajat konjugasi semakin besar tingkat
penyerapan pada panjang gelombang lebih lama. Dengan demikian, senyawa
yang sangat terkonjugasi seperti β-karoten dan hemoglobin menyerap dibagian
terlihat spektrum dan berwarna. Senyawa aromatik terkonjungsi kurang
menyerap dalam daerah UV spektrum. Namun, kemajuan besar diikuti
penemuan fundamental dalam spektrokopi studi tentang penyerapan radiasi
elektromagnetik oleh senyawa kimia dan spektrometri, studi kuantitatif dan
dari fenomena ini.
Absorbansi cahaya oleh bahan pertama kali diekplorasi oleh ahli
matematika Jerman Johann Heinrich Lambert (1728-1777) yang
menemukakan bahwa untuk radiasi monokromatik (dalam radiasi praktek pita
sempit) jumlah cahaya yang diserap adalah berbanding lurus dengan panjang
jalur cahaya itu melalui material dan tidak tergantung dari intensitas cahaya .
Astronom Jerman Wilhelm Beer (1797-1850) memperluas pekerjaan ini dan
menemukan bahwa untuk larutan encer, ada hubungan linier antara
konsentrasi analit dan absorbansi.
Ahli kimia klinis Henry Bence Jones (1813-1873) menggunakan emisi
untuk mendeteksi lithium dalam urin dan pada jaringan lain termasuk lensa
dihapus dari mata pasien katarak dan bekerja dengan Agustus Dupre (1835-
1907), digunakan analisis fluoresensi untuk mendeteksi kina dalam darah dan
jaringan lain. Pengenalan Spektofotometer komersial UV pertama, oleh
Arnold O. Beckman (1900-2004). Namun, kelompok-kelompok seperti yang
dipimpin oleh Bernand B. Brodie (1907-1989) melanjutkan untuk
menggunakan instrumen untuk mengembangkan kuantitatif. Brodie
mendirikan beberapa aturan dasar untuk sukses meansurement obat dan racun
lainnya dalam spesimen biologi, banyak yang masih berlaku hari ini.
Seperti dengan pengembangan spektofotometer UV praktis, kepentingan
militer , kali ini dalam obat antimaterialis, juga mendorong kemajuan di
spektrophotofluorimetry. Brodie dan Sidney Udenfriend (1918-2001)
menggunakan fluorimeter Coleman sederhana filter untuk mengukur
quinacrine dalam plasma, tetapi jelas bahawa jika panjang gelombang eksitasi
dapat bervariasi banyak molekul lebih dapat dianalisis menggunakan eknik
ini. Robert L. Bowman (1916-1995) mengembangkan spectrophotofluorimeter
monokromator pertama ganda, yang dengan kolaborasi dari perusahaan
instrumen Amerika, dipamerkan pada konferensi 1956 Tickets Pittburgh
sebagai AMINO-Bowman SPF.
Dipertengahan abad ke-19 kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen
(1811-1899) fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887)
bekerjasama mengembangkan spektofotometer menemukan 2 unsur baru:
rubidium dan cesium. Yang digunakan banyak kimiawan untuk menemukan
unsur baru semacam galium, indium dan unsur-unsur tanah jarang.
Spektroskopi telah memainkan peran penting dalam penemuan gas-gas mulia.
Spektofotometer terdiri atas sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor
pencatat. Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar polikromatis dari
sumber cahaya menjadi sinar kromatis. Penggunaan spektroskopi sebagai
sarana penentuan struktur senyawa memiliki sejarah yang pajang. Reaksi
nyala yang populer berdasarkan prinsip yang samma dengan spektroskopi.
Spektrofotometer UV-Vis pada umumnya digunakan untuk :
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonyugasi dan
auksokrom dari suatu senyawa organik.
 2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang
maksimum suatu senyawa
3. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer.
B.  Pengertian Spektofotometer
       Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan
fotometer. Spektrometer ialah menghasilkan sinar dari spektrum dan panjang
gelombang tertentu, sedangkan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer
adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi
tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang. Kelebihan spektrometer dibandingkan fotometer adalah
panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh
dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada
fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh
dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi
melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak
mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis,
melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada
spektrometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh
dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer
tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel
pengabsorpsi untuk larutan sampel atau  blanko dan suatu alat untuk
mengukur perbedaan adsorpsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding.
Faktor yang Mempengaruhi Daya Adsorpsi
Kecepatan adsorpsi sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara
lain:
 1. Konsentrasi
Proses adsorpsi sangat sesuai untuk memisahkan bahan dengan
konsentrasi yang rendah dari campuran yang mengandung bahan lain dengan
konsentrasi tinggi.
2. Luas Permukaan
Proses adsorpsi bergantung pada banyaknya tumbukan yang terjadi
antara partikel-partikel adsorbat dan adsorben. Tumbukan efektif itu akan
meningkat dengan meningkatnya luas permukaan.
3. Suhu
Adsorpsi akan lebih cepat berlangsung pada suhu tinggi, namun
demikian pengaruh suhu adsorpsi zat cair tidak sebesar pada adsorpsi gas.
4. Ukuran Partikel
Semakin kecil ukuran partikel yang diadsorpsi maka proses
adsorpsinya akan berlangsung lebih cepat.
5. pH
pH mempunyai pengaruh dalam proses adsorpsi. pH optimum dari
suatu proses adsorpsi ditetapkan melalui uji laboratorium.
6. Waktu Kontak
Waktu untuk mencapai keadaan setimbang pada proses serapan ion
logam oleh adsorben berkisar antara beberapa menit hingga beberapa jam.
Syarat senyawa yang dapat dianalisis menggunakan
spektrofotometer Uv-Vis adalah senyawa mengandung gugus kromofor dan
auksokrom.
C.  Pengertian Spektrofotometri UV-Vis
Spektofotometer UV-Vis Merupakan spektrofotometer yang
menggabungkan jenis Spektrofotometer Vis (Visible) dan Spektrofotometer
UV (Ultra Violet), yang artinya terdapat dua jenis sumber cahaya berbeda.
Pada instrument yang sudah lebih canggih sumber cahaya tidak lagi
menggunakan dua sumber cahaya yang berbeda, namun menggunakan satu
sumber cahaya dengan jangkauan Panjang gelombang yang lebar.     
 Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah
ultraviolet (200-400 nm) dan sinar tampak (400-800 nm) oleh suatu senyawa.
Serapan cahaya uv atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik,
yaitu promosi elektron-elektron dari orbital dasar yang berenergi rendah ke
orbital tereksitasi yang berenergi lebih tinggi. Panjang gelombang cahaya uv
atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul-
molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan
menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang
memerlukan energi lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang
yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak
(senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan dari
pada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang lebih pendek
(Herliani, 2008).
        Absorpsi spektrofotometri UV-Vis adalah istilah yang digunakan ketika
radiasi ultraviolet dan cahaya tampak diabsorpsi oleh molekul yang diukur.
Alatnya disebut spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometer UV-Vis (Ultra
Violet-Visible) adalah salah satu instrumen yang digunakan dalam
menganalisa suatu senyawa kimia. Spektrofotometer digunakan karena
kemampuannya dalam menganalisa banyak senyawa kimia serta
kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan
beberapa metode analisa (Herliani, 2008).
Syarat-syarat analisis dengan spektrofotometer Uv-Vis
1. Larutan harus berwarna atau mengandung senyawa organik tak jenuh
2. Sinar harus monokromatis
 3. Larutan harus jernih (tidak keruh)
4. Pelarut yang digunakan tidak boleh bereaksi secara kimia dengan sampel
yang dianalisis.
D. Bagian-bagian Spektofotometer UV VIS

1.   Sumber sinar
Polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan berbagai
macam rentang panjang gelombang. Untuk sepktrofotometer  UV-VIS
menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.
2.   Monokromator
Sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang
berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis
monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa
prisma dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah
menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna
sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai
cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai
dengan jenis pemeriksaan. Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi
atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau
 cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada
gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi
atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.
3.   Sel sampel
Sebagai tempat meletakan sampel, Spektofotometer UV-VIS
menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari
kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki
kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik
dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer
sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1
cm.
4.   Detektor
Menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya
menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
 Kepekaan yang tinggi
 Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
 Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
 Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
 Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
 Macam-macam detektor :
 Detektor foto (Photo detector)
 Photocell, misalnya CdS.
 Phototube
 Hantaran foto
 Dioda foto
 Detektor panas
5.   Read out Merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat
listrik yang berasal dari detektor.

E.   Prinsip Kerja
Adapun prinsip kerja alat spektrofotometer uv-vis yaitu sumber radiasi
untuk spektroskopi UV-Vis adalah lampu tungsten. Cahaya yang dipancarkan
sumber radiasi adalah cahaya polikromatik. Cahaya polikromatik UV akan
melewati monokromator yaitu suatu alat yang paling umum dipakai untuk
menghasilkan berkas radiasi dengan satu panjang gelombang
(monokromator). Monokromator radiasi UV, sinar tampak dan infra merah
adalah serupa yaitu mempunyai celah (slit), lensa, cermin dan perisai atau
grating.

F. Penggunaan Spektofotometer UV-Vis

1. Hubungkan alat dengan arus listrik
2. Nyalakan alat (biasanya di bagian belakang alat)
3. Tunggu selama 30 menit (sampai semua tampilan di layar menunjukkan
OK)
4. Sambil menunggu 30 menit, siapkan alat-alat sebagai berikut:
- Sampel
- Buku/kertas catatan + alat tulis
- Aquades untuk membilas
- Tempat buangan aquades
- Tisu
5. Setelah 30 menit, tahapan yang dilakukan adalah sebagai berikut: \
6. Tekan angka 1 (pilih menu Photometric)
7.Tekan tombol Go To WL (Wavelength) untuk mengatur panjang gelombang
8. Tekan tombol angka-angka sesuai panjang gelombang yang diinginkan

9. Tekan Enter
10. Tekan tombol autozero untuk mengnolkan (0) angka yang tertera pada
layar
11. Cuci kuvet dengan aquades (setelah dicuci dilap dengan tisu secra searah)
12. Isi kuvet dengan pelarut yang digunakan pada sampel yang akan diukur
(misal: aquades, etanol)
13. Taruh kuvet di tempat pembacaan absorbansi
14. Setelah muncul angkanya di layar, tekan tombol autozero untuk
mengnolkan (kalibrasi)
15.  Cuci kembali kuvet dan dilap
16. Isi kuvet dengan blanko
17. Lakukan pembacaan absorbansi
18. Cuci kuvet dan dilap
 19. Isi kuvet dengan sampel 1
20. Lakukan pembacaan absorbansi
21. Cuci kuvet dan dilap
22. Isi kuvet dengan sampel selanjutnya
23. Tiap ganti sampel, ulangi poin 16
 Cara mematikan spektrofotometer:
1.   Tekan tombol autozero
2.   Tekan tombol return
3.   Matikan tombol di belakang alat
4.   Cabut kabelnya
G. Cara Perawatan Spektofotometer UV-Vis
1.  Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.
2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung,
karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.
3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas
meja yang permanen.
4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.
5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.
6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur

H. Cara Kalibrasi Spektofotometer UV-Vis

Yang perlu dikalibrasi adalah panjang gelombang dan absorbansi.

1. Kalibrasi panjang Gelombang

Menggunakan saring gelas helium oksida yang memiliki panjang
gelombang acuan (nm), pasang saring gelas holium oksida pada
kompartemen sampel dan kompartemen pembanding dibiarkan kosong
(udara), pindai sektrum serapan holium oksida, bandingkan panjang
gelombang spektrum yang diperoleh dengan data panjang gelombang
referensi.
2. Kalibrasi Absorbans
 Buat larutan kalium dikromat 50 + 0,5 mg dalam 1 liter 0,005 asam
sulfat (LARUTAN A), buat larutan kalium dikromat 1,00 + 1 mg dalam 1
liter 0,005 asam sulfat (Larutan B), buat larutan 0,005 asam sulfat sebagai
pembanding dan bandingkan hasil dengan data acuan (+ 2%)

I.      Kelebihan dan Kekurangan Spektrofotometer Uv-Vis

1. Kelebihan spektrofotometer Uv-Vis:
a) Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi.

b) Caranya sederhana

c) Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

2. Kekurangan spektrofotometer Uv-Vis:

a) Absorbsi dipengaruhi oleh PH larutan,suhu dan adanya zat pengganggu
dan kebersihan kuvet.
b) Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >
    

165 nm.
c) Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron
valensi dengan energy eksitasi rendah.
d)  Sinar yang dipakai harus monokromatis

J. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Penyerapan Uv-Vis

1. Kromofor
Kromofor merupakan semua gugus atau atom dalam senyawa organik
dalam senyawa organik yang mampu menyerap sinar ultra violet dan sinar
tampak.
2. Pemilihan Pelarut
Kriteria pemilihan pelarut :
a. Tidak menyerap sinar UV pada daerah yang sama dengan daerah
sampel yang akan dianalisis. Bisanya pelarut yang tidak mengandung
sistem terkonjugasi merupakan pelarut pilihan.
 b. Pengaruh pada struktur halus dan tajam (fine structure) pada pita
serapan. Pelarut non polar tidak berikatan hidrogen dengan senyawa
yang terlarut, dengan demikian spektrum senyawa mendekati spektrum
senyawa dalam keadaan gasnya, yang mana struktur halus dan tajam
yang teramati. Dalam pelarut polar, ikatan hidrogen membentuk
kompleks dengan senyawa pelarut dan struktur halus dan tajam tidak
muncul.
c. Kemampuan mempengaruhi panjang gelombang dari sinar UV yang
diadsorpsi dalam keadaan dasar dan tereksitasi. Pelarut polar dalam
keadaan terseksitasi tidak membentuk ikatan hidrogen semudah dengan
keadaan dasar.
3. Pengaturan Suhu
Suhu rendah menawarkan pita serapan senyawa obat yang lebih tajam
daripada suhu kamar. Rsolusi vibrasional akan lebih baik karena level
vibrasional yang ditempati lebih sedikit da tingkat interaksi solut-pelarut
diminimalkan.
4. Ion-ion organik
Sifat kromoforik yang terdapat dalam senyawa anorganik ada 2, yaitu
melibatkan beberapa atom seperti MnO4- dan Cr2O72- dan yang melibatkan
atom tunggal yang memiliki kulit elektron terluar d- yang tidak lengkap.