METODE SPEKTOFOMETRI UV VISIBLE

Diajukan sebagai tugas kimia analitik

OLEH

Nama : Erna Islauhu Handayani

NIM : P07134121015

Kelas :A

Dosen Pembimbing :

Ida Bagus Rai Wiadnya, S.Si, M.Ked

POLTEKKES KEMENKES MATARAM

PROGRAM STUDI D4 TEKNIK LABORATORIUM MEDIS

JURUSAN TEKNIK LABORATORIUM MEDIS

 A. Pengertian Spektrofotometer
Spektrofotometer merupakan instrumen yang umum digunakan untuk menganalisis
bahan kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Spektrofotometri adalah metode
pengukuran kuantitatif yang didasarkan pada pengukuran absorbs (penyerapan) radiasi
gelombang elektromagnetik.

Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang
gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan
detektor fototube. Benda bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan
spektrum yang lebar terdiri atas panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan
dengan cahaya tampak itu mampu mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan
karenanya menimbulkan kesan subyektif akan ketampakan (vision). Dalam analisis secara
spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang
digunakan, yaitu daerah UV  (200 – 380 nm), daerah visible (380 – 700 nm), daerah
inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).

B. Sejarah Spektrofotometer
Absorbansi cahaya oleh bahan pertama kali dieksplorasi oleh ahli Matematika
Jerman Johann Heinrich Lambert (1728-1777) yang menemukan bahwa untuk radiasi
monokromatik (dalam radiasi praktek pita sempit) jumlah cahaya yang diserap adalah
berbanding lurus dengan panjang jalur cahaya itu melalui material dan tidak tergantung
dari intensitas cahaya. Astronom Jerman Wilhelm Beer (1797-1850) memperluas
pekerjaan ini dan menemukan bahwa, untuk larutan encer, ada hubungan linier antara
konsentrasi analit dan absorbansi.

Digunakan analisis fluoresensi untuk mendeteksi kina dalam darah dan jaringan
lain. Pengenalan spektrofotometer komersial UV pertama, oleh Arnold O. Beckman (1900-
2004), Namun, kelompok-kelompok seperti yang dipimpin oleh Bernand B. Brodie (1907-
1989) melanjutkan untuk menggunakan instrumen untuk mengembangkan kuantitatif.
Brodie mendirikan beberapa aturan dasar untuk sukses meansurement obat dan racun
lainnya dalam spesimen biologi, banyak yang masih berlaku hari ini.

Di pertengahan abad ke-19, kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-

1899) fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824- 1887) bekerjasama
mengembangkan spektrometer menemukan 2 unsur baru: rubidium dan cesium.

C. Prinsip Kerja Spektrofotometer

Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energy
yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul.
Besar energy yang diserap tertentu dan menyebabkan electron tereksitasi dari ground
state ke keadaan tereksitasi yang memiliki energy lebih tinggi. Serapan tidak terjadi
seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik tetapi hanya pada
system-sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan p dan non bonding
electron.

Dari 4 jenis spektrofotometer ( UV, Vis, UV-Vis dan Ir ) memiliki prinsip kerja yang
sama yaitu “adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang
gelombang tertentu”. Perbedaanya terletak pada panjang gelombang yang digunakan.

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer, bila cahaya

monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut diserap
(Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
 Hukum lambert-beer menyatakan hubungan linear antara absorban dengan
konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hokum
Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan,  yaitu :

 Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

 Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama
 Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang
lain dalam larutan tersebut
 Tidak terjadi flourensensi atau fosforisensi
 Indeks bias tidak bergantung pada konsentrasi larutan.

Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari
warna yang teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya terdapat
pada tabel berikut ini :
 Panjang Gelombang Warna Terlihat Warna Komplementer
<400 Ultraviolet -
400-450 Violet Kuning
450-490 Biru Jingga
490-550 Hijau Merah
550-580 Kuning Ungu
580-650 Jingga Biru
650-700 Merah Hijau
>700 Inframerah

D. Cara Kerja Spektrofotometer UV-VIS

Cara kerja spektrofotometer yaitu sinar dari sumber radiasi diteruskan menuju
monokromator. Cahaya dari monokramator diarahkan terpisah melalui sampel dengan
sebuah cermin berotasi. Detector menerima cahaya dari sampel secara bergantin secara
berulang-ulang, sinyal listrik dari detector diproses, diubah ke digital dan dilihat hasilnya,
selanjutnya perhitungan dilakukan dengan computer yang sudah terprogram.
E. Proses Absorbsi Cahaya Pada Spektrofotometer

F. Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat

Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.

1. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung,

karena cahaya dari matahari akan dapat mengganggu pengukuran.
2. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas
meja yang permanen.
3. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.
4. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.
5. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.

G. Hal-hal yang harus diperhatikan

1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna

Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna,
maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang
berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.
 2. Panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang

mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal,
akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer
dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.

3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban

Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang

dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang
terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan
absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

H. Faktor – faktor penyebab kesalahan Analisis UV-Vis

Faktor – faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalammenggunakan

spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit :

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan
blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis
termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang biasanya dari bahan gelas atau kuarsa,
namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik norml pada pengukuran dengan absorbnsi sangat
rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi,
sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui
pengenceran atau pemekatan)
 I. Cara Kalibrasi Spektofotometer UV-VIS

1. Kalibrasi Panjang gelombang

Menggunakan filter gelas helium oksida yang mempunyai panjang gelombang

acuan (nm) , pasang  filter gelas holium oksida pada kompartemen sampel
dan kompartemen pembanding dibiarkan kosong (udara) , Scan spektrum
serapan holium oksida, bandingkan panjang gelombang spektrum yang
diperoleh dengan data panjang gelombang acuan.

1. Kalibrasi Absorbans

Buat larutan kalium dikromat 50 + 0,5 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam sulfat
(larutan A) , Buat larutan kalium dikromat 100 + 1  mg dalam 1 liter 0,005 mol/L
asam sulfat (larutan B) , buat larutan 0,005 mol/L asam sulfat sebagai
pembanding dan bandingkan hasilnya dengan data acuan (+ 2%)

J. Kelebihan dan kekurangan Spektrofotometer UV-VIS

Kelebihan Spektrofotometri UV-Vis

 Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi

 Caranya sederhana
 Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

Kekurangan Spektrofotometri UV-Vis

 Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet
 Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185
nm
 Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi
dengan energy eksitasi rendah
 Sinar yang dipakai harus monokromatis
 K. Kesimpulan

Spektofotometri merupakan alat yang digunakan untuk mengukur energi secara

relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang. Dapat dipakai untuk tujuan analisis kualitatif (data sekunder) dan
kuatitatif. Spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu,
monokromator, sel pengadsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat
pengukur perbedaan adsorbsiantara sampel dan blanko ataupun pembanding.