Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Talanta 71 (2007) 639–643

Validasi metode indikasi stabilitas HPLC untuk Vitamin C dalam

sediaan farmasi/kosmetik semipadat dengan glutathione
dan sodium metabisulfite, sebagai antioksidan

Adriana M. Maiasebuah, Andre Rolim Babysebuah,∗, Wilson J.Yasakab, Eunike Suenagab,

Telma M. Kanekosebuah, Maria Valéria R. Velascosebuah
sebuahDepartemen Farmasi, Sekolah Ilmu Farmasi, Universitas São Paulo, 580 Prof. Lineu Prestes Av., bl. 13,
Conjunto das Quı́micas, Cidade Universitária, 05508-900 São Paulo, SP, Brasil
bDepartemen Farmakologi, Institut Ilmu Biomedis, Universitas São Paulo, 1374 Prof. Lineu Prestes Av.,
ICB II, Cidade Universitária, 05508-900 São Paulo, SP, Brasil
Diterima 1 April 2006; diterima dalam bentuk revisi 7 Mei 2006; diterima 7 Mei 2006
Tersedia online 12 Juni 2006

Abstrak

Metode indikasi stabilitas HPLC telah divalidasi untuk Vitamin C (asam askorbat) dalam formulasi farmasi/kosmetik semipadat yang mengandung
glutathione dan sodium metabisulfite, sebagai antioksidan. Prosedur yang dijelaskan termasuk penentuan metode yang andal, tepat, akurat dan
spesifik menggunakan 250 mm×4,6 mmC18kolom, 0,2% asam metafosfat/metanol/asetonitril (90:8:2, v/v/v) sebagai fase gerak dan deteksi pada 254
nm. Asam nikotinat dan asam askorbat digunakan sebagai standar, keduanya menunjukkan kemurnian 99,0%. Linearitas ditetapkan untuk
konsentrasi asam askorbat mulai dari 1,0 hingga 12 -g mL-1−1, persentase akurasi/pemulihan adalah 95,46–101,54%, nilai presisi 0,38 (intra-hari)
dan 1,22% (antar-hari), dan LOD dan LOQ ditemukan 0,05 dan 0,17 -g mL−1, masing-masing. Fase gerak yang bekerja meningkatkan waktu retensi
asam askorbat menjadi≈3,5 menit dengan laju alir 1,0 mL menit-menit−1dan memberikan resolusi zat aktif dari asam nikotinat (standar internal),
produk degradasi (asam oksalat) dan eksipien lain dari sediaan farmasi/kosmetik.
© 2006 Elsevier BV Semua hak dilindungi undang-undang.

Kata kunci:Asam askorbat; Sediaan farmasi; metode indikasi stabilitas HPLC; Asam oksalat; Formulasi kosmetik

1. Perkenalan tesis kolagen, karnitin, tirosin dan reaksi yang bergantung

Vitamin C, juga dikenal sebagai asam askorbat, telah banyak
digunakan dalam sediaan farmasi dan kosmetik, termasuk
bentuk sediaan topikal semipadat, untuk perlindungan
formulasi terhadap oksidasi dan untuk mengerahkan aktivitas
fisiologis/biologis. Aktivitas biologis utama Vitamin C terkait
dengan pemeliharaan potensi oksidasi-reduksi organisme.
Selain sifat antioksidannya, asam askorbat bekerja pada
inaktivasi radikal bebas, co-faktor enzimatik, penghambatan
pembentukan nitrosamin, partisipasi pada sintesis
∗Penulis koresponden di: Laboratorium Teknologi Farmasi, Departemen
Farmasi, Sekolah Ilmu Farmasi, Universitas São Paulo, FCF-USP, 580 Prof.
Lineu Prestes Av., bl. 13, Conjunto das Quı́micas, Cidade Universitária,
05508-900 São Paulo, SP, Brasil. Telp: +55 11 3091 3623; faks: +55 11 3815
4418.
Alamat email:andrerb@usp.br,andre rolim@uol.com.br (bayi AR).
pada sitokrom P450, intervensi pada metabolisme besi dan
histamin, depigmentasi kulit, dan reaksi imunologi [1–7].
Asam askorbat menghadirkan stabilitas yang wajar ketika
kondisi penyimpanan melindungi zat aktif dari kelembapan,
panas, dan luminositas. Dalam larutan berair, ia terurai oleh
oksigen lingkungan dan agen oksidan, terutama dengan
adanya alkali dan logam berat, memperoleh asam
dehidroaskorbat dan, akhir-akhir ini, asam diketoglukonat.
Tahap oksidasi terakhir ini tidak dapat diubah dan aktivitas
biologis sudah terganggu. Sebagai produk degradasi akhir dari
asam askorbat, asam oksalat terbentuk[8,9].
Bermacam-macam teknik telah dijelaskan untuk
kuantisasi Vitamin C dalam bentuk sediaan farmasi, seperti:
titrimetri, spektrofotometri, elektrokimia, fluorimetri,
enzimatik dan kromatografi.[10–13]. Sejak matriks bentuk
sediaan farmasi/kosmetik, dikembangkan sebagai emulsi

0039-9140/$ – lihat front matter © 2006 Elsevier BV Semua hak dilindungi undang-
undang. doi:10.1016/j.talanta.2006.05.006
640 AM Maia dkk. / Talanta 71 (2007) 639–643
sion dan / atau gel, menghadirkan berbagai eksipien yang
mungkin muncul sebagai pengganggu, serta terjadinya produk
degradasi, selain adanya zat antioksidan penstabil untuk
Vitamin C, metode indikasi stabilitas HPLC memiliki
keunggulan. Kromatografi cair kinerja tinggi dianggap sebagai
metode yang sensitif dan selektif, menargetkan tujuan
penentuan zat aktif ini, dan sebagai uji indikasi stabilitas, yang
merupakan metode yang digunakan untuk analisis sampel
stabilitas dalam industri farmasi dan kosmetik. [14,15].
Pengujian HPLC menghadirkan kemudahan, kecepatan, dan
kemampuan untuk memisahkan zat secara kuantitatif tanpa
prederivasi. Untuk mencapai karakteristik metode tersebut,
metodologi HPLC harus divalidasi sesuai dengan parameter
analitik yang diakui dengan baik yang ditetapkan oleh
Kompendium Resmi, literatur ilmiah dan Farmakope,
memperoleh secara eksperimental linearitas, spesifisitas,
akurasi, presisi, dan batas deteksi dan kuantifikasi.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan dan
memvalidasi metode indikasi stabilitas HPLC untuk kuantisasi Vitamin C
(asam askorbat) dari sediaan farmasi/kosmetik, dikembangkan sebagai
emulsi minyak dalam air dan gel berair, yang mengandung glutathione
dan sodium metabisulfite, sebagai antioksidan.
2. Percobaan
2.1. Peralatan
HPLC Shimadzu LC-10AD yang terintegrasi dengan sistem Kelas-
LC10 digunakan dengan detektor UV-visible. Untuk akuisisi data,
perangkat lunak Shimadzu SPD-10A digunakan. Pemisahan dicapai
dengan menggunakan 250 mm×4,6 mm Phenomenex LiChrospher®
100–RP18 5 -m C18kolom.
Sampel dan larutan standar dikromatografi pada suhu
sekitar (24,0±2.0◦C), menggunakan 0,2% asam metafosfat/
metanol/asetonitril (90:8:2, v/v/v) sebagai fase gerak (laju
aliran 1,0 mL min-−1) dengan deteksi pada 254 nm dan
volume injeksi 20 -L.
2.2. Bahan kimia
Metanol grade HPLC dan asetonitril dari Mallinckrodt
digunakan untuk menyiapkan fase gerak, bersama dengan
asam metafosfat 0,2% kualitas grade reagen dari Carlo Erba.
Semua reagen digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Formulasi farmasi/kosmetik dikembangkan sebagai emulsi
minyak dalam air (o/w) topikal dan gel berair. Komposisi
kualitatif sediaan meliputi: (1) emulsi o/w, lilin pengemulsi NF,
etilheksil stearat, minyak mineral, natrium karboksimetil
betaglucan, HEDTA (N-2- asam hidroksietil-
etilendiamintriasetat), air (dan) gliserin (dan) natrium laktat
(dan) TEA-laktat (dan) serin (dan) asam laktat (dan) urea (dan)
sorbitol (dan) natrium klorida (dan) lauril dietilenadiaminoglisin
(dan) lauril aminopropilglisin (dan) allantoin, fenoksietanol
(dan) metilparaben (dan) etilparaben (dan) propilparaben (dan)
butilparaben, Vitamin C (asam askorbat, 10%, b/b), glutathione,
natrium metabisulfit, metildibromo glutaronitril, wewangian
dan dis-
air yang diolah; (2) gel berair, hidroksietilselulosa, metilparaben,
HEDTA, sorbitol, air (dan) gliserin (dan) natrium laktat (dan) TEA-
laktat (dan) serin (dan) asam laktat (dan) urea (dan) sorbitol (dan)
natrium klorida (dan) lauril dietilenadiaminoglisin (dan) lauril
aminopropilglisin (dan) allantoin, Vitamin C (asam askorbat, 10%,
b/b), glutathione, natrium metabisulfit, methyldibromo
glutaronitrile, pewangi dan air suling. Semua komponen diperoleh
dari sumber komersial dan digunakan seperti yang diterima, tanpa
pemurnian lebih lanjut.
Konsentrasi asam askorbat dipilih sesuai dengan literatur
yang menunjukkan bahwa Vitamin C 10,0% (b/b) untuk aplikasi
topikal mengurangi eritema yang disebabkan oleh radiasi UV-A
dan UV-B (dibandingkan dengan kontrol)[1,16–18].
Air murni diproduksi oleh Sistem Millipore Milli-Q Plus
(Molsheim, Prancis).
2.3. Standar
Asam askorbat (C6H8HAI6) dengan kemurnian 99,0%
disediakan dari Roche. Asam nikotinat dengan kemurnian
99,0% dibeli dari Synth (São Paulo, Brasil) dan digunakan
sebagai standar internal (IS)[15,19]. Referensi kimia tersebut
digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
2.4. Persiapan fase gerak
Larutan fase gerak disiapkan dengan hati-hati menambahkan
metanol dan asetonitril ke 0,2% asam metafosfat dan mencampur
dengan baik (pH 2,8). Larutan ini disaring melalui membran
selulosa asetat berdiameter 0,22 m (Millipore) dan dihilangkan
gasnya dengan sonikasi.
2.5. Linearitas
Sekitar 25 mg asam askorbat standar (kemurnian 99,0%)
dan 25 mg asam nikotinat IS (kemurnian 99,0%) ditimbang
dengan tepat dan dilarutkan dalam 50 mL fase gerak untuk
memperoleh konsentrasi stok 500 -g mL−1. Standar disiapkan
secara terpisah.
Alikuot asam askorbat standar diencerkan hingga
konsentrasi yang dibutuhkan mulai dari 1,0 hingga 12 -g mL-1
−1. Asam nikotinat dalam jumlah yang tepat dipindahkan ke
setiap larutan asam askorbat mencapai nilai konsentrasi
konstan 20 -g mL−1. Solusi standar kerja disiapkan dalam
ulangan dua.
Kurva standar dibangun dengan memplot rata-rata laju daerah
puncak asam askorbat/asam nikotinatmelawankonsentrasi asam
askorbat standar yang dijelaskan sebelumnya.
Metode least-square fit digunakan untuk mengevaluasi
secara statistik hasil linearitas dengan garis regresi dengan
kemiringan dany-intersep dan koefisien korelasi linier (r2)
[20–23].
2.6. Kekhususan
Untuk menilai pemisahan asam askorbat, nikotinat dan
oksalat dan kemungkinan pengganggu dari eksipien
formulasi farmasi/kosmetik yang mengandung glutathione
 AM Maia dkk. / Talanta 71 (2007) 639–643
dan natrium metabisulfit, sebagai antioksidan, spesifisitas dipertimbangkan
dalam dua tingkat:
(a) formulasi topikal bebas analit tanpa glutathione dan
sodium metabisulfite:
Kira-kira 250 mg formulasi topikal (emulsi o/w dan
gel berair) ditimbang dengan tepat dan dilarutkan,
secara terpisah, dalam 50 mL fase gerak, dengan
pencampuran selanjutnya. Sampel disentrifugasi pada
3000 rpm selama 5 menit pada suhu kamar (24,0±2.0◦
C). Supernatan dibuang. Alikuot sampel diencerkan
hingga konsentrasi akhir 10,0 -g mL-1−1emulsi m/a dan
gel berair pada fase gerak.
(b) analisis individu asam askorbat dan nikotinat, antioksidan
(glutathione dan sodium metabisulfite) dan asam oksalat
(produk degradasi Vitamin C):
Sekitar 25 mg asam askorbat standar, asam nikotinat,
glutathione, natrium metabisulfit dan asam oksalat ditimbang
dengan tepat dan dipindahkan satu per satu ke labu ukur dan
dilarutkan dalam 50 mL fase gerak. Alikuot dari masing-
masing sampel diencerkan hingga konsentrasi yang
dibutuhkan 10,0 -g mL-1−1.
2.7. Akurasi/pemulihan dan presisi
Akurasi/pemulihan ditentukan oleh perbandingan antara
konsentrasi teoretis asam askorbat standar yang ditambahkan
ke formulasi topikal bebas analit dan yang diperoleh dalam
analisis kromatografi. Ulangan tiga untuk setiap konsentrasi
digunakan dan fase gerak digunakan sebagai pelarut.
Presisi, dihitung sebagai standar deviasi relatif (RSD,%),
diperoleh dalam dua tingkat: intra- (10 injeksi/hari, selama 3
hari) dan antar-hari (satu injeksi/hari, selama 6 hari).
Sekitar 50 mg asam nikotinat; 50, 150 dan 250 mg formulasi
topikal bebas analit; dan 5, 15 dan 25 mg asam askorbat
standar ditimbang dengan tepat dan dilarutkan, secara
terpisah, dalam 50 mL fase gerak, dengan pencampuran
selanjutnya. Sampel disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5
menit pada suhu kamar (24,0±2.0◦C). Supernatan dibuang.
Untuk mencapai akurasi/pemulihan, alikuot sampel diencerkan
hingga konsentrasi akhir 2.0, 6.0 dan 10.0 -g mL-1−1asam askorbat
standar dan 20,0 -g mL−1asam nikotinat pada fase gerak. Untuk
mendapatkan presisi intra- dan inter-run, sampel diencerkan
hingga konsentrasi akhir asam askorbat 6,0, dan 20,0 -g mL−1dari
asam nikotinat[21,24–27].
2.8. Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ)
Batas deteksi dan kuantifikasi ditentukan dengan
pengenceran serial larutan asam askorbat untuk mendapatkan
rasio sinyal/noise dari≈3:1 untuk LOD dan≈10:1 untuk LOQ.
Sekitar 25 mg asam askorbat standar ditimbang dengan
tepat dan dilarutkan dalam 50 mL fase gerak. Jumlah yang
tepat dari larutan asam askorbat standar diencerkan
hingga konsentrasi yang dibutuhkan 0,03, 0,05, 0,1 dan 1,0
-g mL-1−1. Solusi standar kerja disiapkan dalam ulangan
tiga[21,25–27].
641
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Pemilihan fase gerak
Sebelum melakukan uji validasi, kondisi kromatografi
untuk metode indikasi stabilitas HPLC dipelajari untuk
mencapai kesesuaian sistem yang sesuai.
Komposisi fase gerak diuji dengan buffer metanol/fosfat
+ tetrabutilamonium (30:70 dan 70:30, v/v) dalam C8kolom (
λ=254 nm); dan 0,2% asam metafosfat dalam larutan air,
0,2% asam metafosfat/metanol (95:5 dan 90:10, v/v), 0,2%
asam metafosfat/asetonitril (95:5 dan 90:10, v/v) dan 0,2
%asam metafosfat/metanol/asetonitril (90:5:5, v/v/v) dalam
C18kolom (λ=254nm). Fase gerak tersebut belum
menunjukkan respons yang memadai untuk kuantisasi
asam askorbat karena mereka tidak dapat mengidentifikasi
antioksidan glutathione, sebagai komponen sediaan
farmasi/kosmetik, dan memberikan waktu retensi yang
tidak sesuai untuk zat aktif (≈1 menit)[28].
Fase gerak yang bekerja, 0,2% asam metafosfat/metanol/
asetonitril (90:8:2, v/v/v), telah meningkatkan waktu retensi
menjadi≈3,5 menit, memberikan resolusi asam askorbat dari asam
nikotinat, ditunjukkan padaGambar 1, dan eksipien lain dari
formulasi topikal dengan puncak yang tajam dan simetris, dan
menghindari gangguan dari kebisingan peralatan. Selain itu, fase
gerak ini dilaporkan dapat mempertahankan umur kolom lebih
lama. Kondisi percobaan akhir ditetapkan seperti yang dijelaskan
dalam Bagian2.1 dan 2.4.
3.2. Linearitas
Linearitas dipelajari pada rentang konsentrasi
1,0–12,0 -g mL−1. Untuk mengevaluasi pengaruh eksipien dari
formulasi topikal, linearitas juga dipelajari dengan keberadaan
emulsi m/a dan gel berair bebas analit dan tidak ada
interferensi yang ditemukan, menjaga hubungan linier dan
proporsional. Ulangan dari tiga injeksi dilakukan untuk setiap
sampel.
Kurva standar dibangun sesuai dengan rasio puncak
asco
konsentrasi asam
konsisten menjadi
Gambar 1. Kromatogram asam askorbat standar, glutation, natrium metabisulfit,
asam oksalat dan asam nikotinat standar internal pada 254 nm. Fase gerak adalah
0,2% asam metafosfat/metanol/asetonitril (90:8:2, v/v/v).
642 AM Maia dkk. / Talanta 71 (2007) 639–643

Tabel 1
Akurasi/pemulihan asam askorbat dari emulsi o/w dan gel berair

Konsentrasi teoritis asam Konsentrasi yang didapat±SDsebuah(-g mL−1) Akurasi/pemulihan (%)

askorbat (-g mL−1)

Emulsi M/A 2.0 2.017±0,041 100,84

6.0 5.965±0,066 99.42
10.0 9.897±0,049 98.97
Gel berair 2.0 1.909±0,018 95.46
6.0 5.972±0,026 99,54
10.0 10.154±0,051 101.54

sebuahSimpangan baku (n=3).

Analisis regresi kuadrat-terkecil digunakan untuk mengevaluasi Meja 2

data rentang konsentrasi yang menunjukkan linearitas yang Hasil eksperimen validasi metode stabilitas HPLC analitik untuk
kuantisasi asam askorbat dalam formulasi farmasi/kosmetik
sangat baik selama interval yang dipelajari, denganr2≥0,99
[20,27,29]. Regresi linier duluy=0,0732x−0,0141, di manayadalah Parameter Data eksperimental

laju daerah puncak asam askorbat/asam nikotinat danxadalah Batas deteksi 0,05 -g mL−1
konsentrasi asam askorbat (-g mL−1). Batas Kuantifikasi 0,17 -g mL−1
Rentang Linearitas 1,0–12,0 -g mL−1

3.3. Kekhususan Presisi

Intra hari (n=10) 0,38%
Inter-hari (n=6) 1,22%
Spesifisitas metode indikasi stabilitas HPLC untuk
kuantisasi asam askorbat dalam sediaan farmasi/
kosmetik diselidiki untuk mendapatkan indikasi
racy/recovery (emulsi minyak dalam air −98,97 hingga
kemungkinan zat pengganggu dari eksipien sediaan
100,84%; gel berair −95,46 hingga 101,54%) dari metode
topikal, asam nikotinat, dan produk degradasi zat aktif,
indikasi stabilitas HPLC untuk kuantisasi asam askorbat dari
asam oksalat.
sediaan farmasi/kosmetik.
Kehadiran eksipien dari emulsi o/w dan gel berair (
Untuk menghitung presisi, tes intra dan antar hari
Gambar 2), termasuk antioksidan glutathione dan sodium
dilakukan dan hasilnya dinyatakan sebagai standar deviasi
metabisulfite, dan asam oksalat tidak menyebabkan
relatif (RSD, %) dalam hal rasio luas asam askorbat/asam
gangguan pada puncak asam askorbat. Dengan kondisi
nikotinat. Nilai persentase RSD yang rendah (0,38 dan
tersebut, asam askorbat diamati dapat diselesaikan dengan
1,22%) adalah bukti presisi yang tepat dari metode indikasi
baik dari komponen formulasi dan produk degradasi
stabilitas ini yang memberikan variabilitas data yang tidak
potensial dari Vitamin C.
relevan yang diuji dalam 3 (rata-rata 10 injeksi) dan 6 hari
(rata-rata 6 injeksi)[30–32].
3.4. Akurasi/pemulihan dan presisi
3.5. Batas deteksi (LOD) dan kuantifikasi (LOQ)
Akurasi/pemulihan dihitung untuk sembilan proses dari setiap solusi,
termasuk
LOD didefinisikan sebagai konsentrasi zat aktif
tercatat di
terendah yang dapat ditentukan dengan metode,
namun tidak dihitung secara tepat dan akurat. LOQ
adalah konsentrasi sampel dalam analisis yang
diperoleh dengan presisi dan akurasi yang memadai
[23,25,26]. Estimasi batas dapat dicapai dengan
penentuan rasio sinyal/noise 3:1 (LOD) dan 10:1 (LOQ).
Untuk metode indikasi stabilitas HPLC ini, nilai LOD dan
LOQ ditemukan ≈0,05 dan≈0,17 -g mL−1, masing-masing.
Meja 2meringkas data eksperimen untuk parameter
metode indikasi stabilitas HPLC.

4. Kesimpulan

Metode indikasi stabilitas HPLC dari kuantisasi asam askorbat

dalam sediaan farmasi/kosmetik semipadat yang mengandung
Gambar 2. Kromatogram formulasi farmasi/kosmetik (emulsi o/w dan gel
berair) bebas analit pada 254 nm. Fase gerak adalah 0,2% asam metafosfat/ glutathione dan natrium metabisulfit, sebagai antioksidan, yang
metanol/asetonitril (90:8:2, v/v/v). dijelaskan dalam penelitian ini divalidasi oleh linearitas, cukup
 AM Maia dkk. / Talanta 71 (2007) 639–643
akurasi / pemulihan dan presisi yang rendah, serta nilai batas
deteksi dan kuantifikasi yang rendah, menghadirkan
sensitivitas alat analitik ini. Kesederhanaan teknik waktu tanpa
konsumsi biaya rendah dan spesifisitas tinggi untuk asam
askorbat, bahkan dengan adanya berbagai eksipien dan
kemungkinan produk degradasinya, asam oksalat,
memberikan metode indikasi stabilitas ini menjadi sangat
menarik untuk penentuan asam askorbat pada emulsi o/w dan
gel berair atau dalam formulasi farmasi/kosmetik serupa
lainnya.
Pengakuan
Pekerjaan ini didukung oleh Dewan Nasional untuk
Pengembangan Ilmiah dan Teknologi (CNPq), yayasan yang terkait
dengan Kementerian Sains dan Teknologi (MCT), untuk
mendukung penelitian dan CAPES Brasil.
Referensi
[1] RM Colven, SR Pinnel, Klinik. Dermatol. 14 (1996) 227.
[2] NS Tokgoz, Optimization d'une Emulsion Multiple H/L/H Renfermant de
L'acide Ascorbique étude de Liberation et Evaliation Cosmetique, Faculté de
Pharmacie de Chatenay (Université Paris XI), Malabry, 1996.
[3] P. Karlson, G. Wolfgang, W. Gross, Patobioquı́mica, Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro, RJ, 1982, hlm. 126.
[4] S. Thormahlen, dalam: Proceedings of the 21st International Federation
Society of Cosmetic Chemists, IFSCC, Berlin, 2000, hal. 459.
[5] R. Kohen, Biomed. Apoteker. 53 (1999) 181.
[6] M. Podda, MG Traber, C. Weber, LJ Yan, L. Packer, Radik Bebas. Biol.
Kedokteran 24 (1998) 55.
[7] H. Freiberger, G. Grove, A. Sivarajah, SR Pinnel, J. Invest. Dermatol. 75
(1980) 425.
[8] MR Lowik, J. Schrijver, M. Wedel, Int. J. Vitam. Nutr. Res. 61 (1990) 43.
643
[9] E. De-Ritter, J. Pharm. Sains. 71 (1982) 1073.
[10] SP Arya, M. Mahajan, P. Jain, Anal. Chim. UU 417 (2000) 1.
[11] U. Moser, A. Bendich, dalam: G. Machlin (Ed.), Handbook of Vitamins, Marcel
Dekker, New York, NY, 1991, hal. 195.
[12] GM Jaffe, dalam: LJ Machlin (Ed.), Handbook of Vitamins: Nutritional,
Biochemical and Clinical Aspects, Marcel Dekker, New York, NY, 1984,
hal. 211.
[13] Bola GFM, Tes Vitamin Larut Air dalam Nutrisi Manusia, Chapman & Hall,
London, 1994, hlm. 156.
[14] M. Bakshi, S. Singh, J. Pharm. Bioma. Anal. 28 (2002) 1011.
[15] PA Marshall, VC Trenerry, CO Thompson, J. Chromatogr. Sains. 33 (1995)
426.
[16] D. Darr, S. Combs, S. Dunston, T. Manning, SR Pinnel, Br. J. Dermatol.
127 (1992) 247.
[17] LK Keller, NA Fenske, J. Am. Acad. Kulit. 39 (1998) 611.
[18] SS Traikovich, Arch. Otolaryngol, Surg Kepala Leher. 125 (1999) 1091.
[19] L. Fotsing, M. Fillet, I. Bechet, P. Hubert, J. Crommen, J. Pharm. Bioma.
Anal. 15 (1997) 113.
[20] DR Jenke, J.Liq. Kromat. Teknologi Terkait. 19 (1996) 737.
[21] Panduan Validasi Metode Analitik dan Bioanalitik, Resolusi RE n.
899. Badan Pengawasan Sanitasi Brasil, Brası́lia, DF, 2003.
[22] GA Shabir, J. Chromatogr. A 987 (2003) 57.
[23] A. Rolim, T. Oishi, CPM Maciel, V. Zague, CASO Pinto, TM Kaneko,
VO Consiglieri, MVR Velasco, Int. J. Farmasi. 308 (2006) 107.
[24] JM Hijau, Anal. kimia 68 (1996) 305.
[25] Q2B Validasi Prosedur Analitis: Metodologi. Konferensi Internasional
tentang Harmonisasi, Washington, DC, 1996.
[26] Farmakope AS 27. Konvensi Farmakope AS, Rockville, MD, 2004,
hal. 2256.
[27] A. Rolim, CPM Maciel, TM Kaneko, VO Consiglieri, IMN Salgado-
Santos, MVR Velasco, J. AOAC Int. 88 (2005) 1015.
[28] ES Wagner, L. Barry, RD Coffin, J. Chromatogr. 163 (1979) 25.
[29] M. Mulholland, DB Hilbert, J. Chromatogr. A 762 (1997) 73.
[30] HT Karnes, C. Maret, Pharm. Res. 10 (1993) 1420.
[31] S. Polesello, Kimia Makanan. 58 (1997) 145.
[32] Prosedur Analitis dan Validasi Metode. Badan Pengawas Obat dan
Makanan AS, Rockville, MD, 2000.