REVIEW MATERI

Dosen :
Hanandayu Widwiastuti, S.Si., M.Si
Disusun oleh :
Neta Destiana Fitrianingsih (P17120193054)

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES MALANG

JURUSAN GIZI
PROGRAM STUDI DIII ANALIS FARMASI DAN MAKANAN
2020/2021
 Review Materi

“ Chromatography Ion-exchange”
1. Kromatografi merupakan teknik pemisahan fisik suatu molekul atau komponen dalam
suatu campuran, berupa gas maupun cairan sesuai dengan perbedaan absorbsi dan
elusinya. Teknik ini dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Teknik ini
menggunakan dua zat dimana zat tersebut tidak dapat bercampur, dua zat tersebut
merupakan fase diam dan fase gerak.
2. Kromatografi ion exchange merupakan pemisahan berdasarkan pertukaran ion, dimana
molekul analit tertahan pada kolom berdasarkan interaksi ionic.Fase gerak yang
digunakan dapat berupa buffer atau larutan dengan pH netral. Ion terlarut yang bermuatan
berlawanan akan tertarik ke dalam fase diam dengan gaya elektrostatis. Sedangkan fasa
gerak yang biasa digunakan adalah resin, resin yang biasa digunakan adalah resin-Q,
resin amina kuarter dan resin DEAE. Biasanya digunakan untuk memisahkan asam
amino.
3. Prinsip kerjanya yaitu diawali dengan injection dimana ion dari analit mulai masuk ke
dalam pori-pori fase diam, kemudian terjadi adsorbsion, sehingga ion counter bertukar
dengan ion dari analit tersebut. Kemudian yang terakhit yaitu elusi.
4. Terdapat dua jenis pertukaran ion yaitu pertukaran anion dan pertukaran kation.
Pertukaran kation ini terjadi ketika molekul bermuatan positif menarik molekul
bermuatan negative, sedangkan pertukaran anion terjadi ketika molekul negative menarik
yang bermuatan positif.
5. Metode pada kromatografi penukar ion
- Kolom dicuci dengan larutan penyangga A
- Dicuci kembali dengan larutan penyangga B
- Menyetimbangkan kolom dengan larutan buffer A
- Persiapan sampel
- Dimasukkan kedalam kolom
- Elusi protein
6. Keuntungan menggunakan ion-exchange yaitu, tidak menyebabkan denaturasi sehingga
dapat digunakan untuk segala tahap dan skala pemurnian,pemisahan IXE dapat dikontrol
dengan mengubah pH, konsentrasi garam atau media yang digunakan, selektivitas tinggi,
lebih efisien daripad akromatografi lainnya.
7. Kekurangannya yaitu alat dan bahan yang digunakan mahal, kekeruhan harus di bawah
10 ppm.
 Review Jurnal
“Analisis Senyawa Asam Klorogenat Dalam Biji Kopi Robusta (Coffea Canephora)
Menggunakan Hplc”

1. Pendahuluan
Kromatografi merupakan metode pemisahan fisik, Dimana komponen-komponen
yang dipisahkan didistribusikan diantara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu
lapisan stationer den permukaan luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut
sepanjang landasan stationer. Fasa stationer bisa berupa padatan maupun cairan,
sedangkan fasa bergerak bisa berupa cairan maupun gas. (A. L. Underwood & R. A. Day,
Jr., n.d.)
Ion-exchange chromatography merupakan jenis HPLC dimana fasa diam
memiliki permukaan yang bersifat ionic yang berlawanan muatan dengan muatan ion
sampel. Teknik ini secara khusus digunakan untuk sampel ionic atau dapat diionkan.
Semakin besar muatannya akan semakin kuat ikatan antara fase diam dengan sampel
sehingga semakin lama terelusi. Gaya tarik antar molekul yang mengemban bermuatan
yang saling berlawanan merupakan sifat yang digunakan dalam HPLC dalam 2 (dua) cara
yang berbeda. Pertama disebut ion pairing yang berkaitan dengan molekul-molekul kecil.
Yang kedua disebut ion exchange chromatography, dimana partikel bermuatan (matriks)
terikat secara reversible pada sampel molekul seperti protein. Pelepasan kembali
(desorpsi) sampel dari matriksnya dilakukan dengan peningkatan konsentrasi garam atau
pengubahan pH fasa gerak. Umumnya bahan penukar ion banyak digunakan dari bahan
yang mengandung senyawa dari gugus diethylaminoethyl (DEAE) atau carboxymethyl
(CM) terutama dalam bidang biokimia. (Rubiyanto, M.Si., 2013)
Proses penukaran ion berawal dari injeksi dimana ion-ion sampel masuk, kemudian
terjadi adsorbsi atau penggeseran ion counter. Yang terakhir yaitu elusi.
Jenis-jenis solute yang dapat dipisahkan secara teknik kromatografi ion antara lain:
- Ion-ion anorganik seperti : Cl⁻, Br⁻ , SO ₄2−¿¿ dan lain-lain
- Kation-kation anorganik termasuk logam alkali, alkali tanah, logam transisi dan ion-
ion rare-earth (golongan lantanida), tetapi bukan kompleks logam netral
- Asam-asam organic seperti karboksilat, sulfonat, fosfonat dan sebagainya
- Basa-basaorganik seperti amina
- Senyawa organo logam ionic

Jurnal tersebut bertujuan untuk menganalisis kandungan asam klorogenat dalam

biji kopi robusta (coffea canephora) menggunakan HPLC dengan prinsip ion-exchange.
Karena banyak penelitian dan artikel yang berfokus pada kafein yang terkandung dalam
kopi, sedangkan senyawa lain yang bermanfaat seperti asam klorogenat di dalam kopi
 belum banyak diteliti dan diketahui oleh masyarakat luas. Selain itu, adanya aktivitas
senyawa asam klorogenat pada biji kopi juga dapat menghasilkan efek farmakologi
Banyaknya efek farmakologi asam klorogenat seperti antivirus hepatitis B,
antihipertensi, antidiabetes, sebagai antioksidan dan hepatoprotektor dapat dijadikan
sebagai alternatif dan pengembangan obat baru.(FARHATY & Muchtaridi, 2016)

Asam klorogenat merupakan senyawa homolog yang terdiri datas asam kafeat, asam
ferulat, dan asam 3,4-dimetoksi-sinamat, yang dihubungkan oleh ikatan ester ke gugus
hidroksil dari asam kuinat, kapasitas antioksidan asam klorogenat lebih kuat dari pada
asam askorbat (vitamin C). Asam klorogenat dapat melindungi pertumbuhan kopi dari
mikroorganisme, serangga dan radiasi UV (Farah, 2012)

Struktur asam klorogenat (Sukohar et al., 2013)

Selain asam klorogenat banyakn komponen kimia lain didalam kopi seperti kafein, asam
klorogenat, trigonelin, karbohidrat, lemak, asam amino, asam organik, aroma volatile dan
mineral dapat menghasilkan efek yang menguntungkan dan membahayakan bagi
kesehatan penikmat kopi.

Sedangkan sampel kopi sendiri yaitu kopi Robusta atau Coffea canephora. Kopi
ini merupakan spesies kopi yang sering di budidayakan dan memberikan nilai ekonomis
yang tinggi selain kopi Arabika (Coffea Arabica)
2. Metode
2.1 Alat
- Kolom kromatografi berbahan gelas
- Instrument HPLC
- Corong pisah
- Chamber
2.2 Bahan
- Kopi hijau
- Plat KLT
- Methanol
- Etil asetat
 - Heksana
- Buffer sitrat
- AkuaDM
- Resin AMberlite FPA900 UPS Cl

2.3 Prosedur
1. Mengekstraksi serbuk kopi hijau dengan metode perebusan
2. Merebus 100 gram serbuk kopi hijau dengan 800 mL pelarut akuaDM selama 30
menit pada suhu 95 ℃ .
3. Memisahkan filtrate dan residunya
4. Selanjutnya dilakukan ekstraksi menggunakan metode ekstraksi cair-cair
5. Filtrate ditambahkan dengan pelarut etil asetat-heksana, kemudian dilakukan
pengocokan dan memisahkan lapisan ekstrak dengan lapisan air
6. Memurnikan hasil ektraksi dengan menggunakan kolom kromatografi dengan
prinsip pertukaran ion
7. Melakukan analisis secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis pada
hasil fraksinasi dari kolom kromatografi
8. Kemudian dilakukan analisis kadar klorogenat menggunakan HPLC

3. Hasil dan Pembahasan

3.1 ekstraksi dan partisi
Ekstrak hasil perebusan tampak berwarna coklat kehijauan, Hasil pemekatan
filtrat rebusan kemudian ditimbang dan diperoleh ekstrak kasar (crude extract) biji kopi
robusta sebanyak 30,0465 gram yang berwarna kuning kecoklatan. Ekstrak kasar
sebanyak 15,5125 gram dilarutkan dalam 100 mL metanol (polar) dan dipartisi
menggunakan 3x70 mL n-heksana (non-polar). Faksi n-heksana kemudian dipekatkan
dan diperoleh berat sebesar 3,0096 gram sedangkan fraksi metanol yang telah dipisahkan
sebanyak 118 mL. Selanjutnya di partisi dengan penambahan 3x70 mL etil asetat, karena
pemisahan tidak terlihat dengan jelas maka ditambahkan 47,2 mL akuades (40% dari
volume fraksi metanol). Diperoleh bobot sebesar 9,5612 gram ekstrak biji kopi robusta.
3.2 pemisahan Asam Klorogenat dari Ekstrak Kasar Biji Kopi Robusta
Menurut jurnal tersebut Kromatografi kolom sangat cocok digunakan untuk
pemisahan ion-ion baik berupa kation maupun anion. Senyawa asam klorogenat memiliki
gugus karboksil (-COOH). Dijelaskan pada pemurnian menggunakan kromatografi kolom
anion karboksilat akan melakukan penukaran dengan ion Cl⁻ yang terdapat pada fasa
diam, fasa diam yang digunakan adalah Resin AMberlite FPA900 UPS Cl yang di
peroleh dari The Dow Chemical Company, resin ini memiliki ukuran partikel yang
seragam (640 ± 50 m) dan matriksnya berupa copolymer-stirena-divinilbenzen (co-
stirena-DVB). Struktur co-stirena-DVB tersusun dari cross-linked senyawa stirena yang
terpolimerisasi sehingga co-stirena-DVB dapat digunakan sebagai media adsorbsi dalam
berbagai jenis senyawa organik. Fase gerak yang digunakan adalah buffer sitrat karena
memiliki range pH sesuai dengan asam klorogenat. Setelah asam klorogenat terikat pada
fase diam kemudian di elusi menggunakan akuades dan dilanjutkan dengan buffer sitrat
dengan variasi pH , 6,11; 5,18; dan 4,16. Elusi dengan akuades menghasilkan lima fraksi
(A1-A5), fraksi A1 berwarna keruh sedangkan fraksi lain tidak berwarna. Sedangkan
elusi menggunakan larutan buffer sitrat pH 6,11 menghasilkan 16 , buffer sitrat pH 5,18
menghasilkan 10 fraksi (B5.1-B5.10), dan buffer sitrat pH 4,16 menghasilkan 10 fraksi
(B4.1-B4.10).

3.3 Analisis dengan kromatografi lapis tipis (KLT)

Hasil analisis KLT fraksi air dan buffer sitrat pH 6,11; 5,18; dan 4,16

Keempat fraksi hasil partisi tersebut kemudian uji kembali menggunakan KLT untuk
mengetahui keberadaan senyawa asam klorogenat. Uji ini menggunakan plat silika gel
dan system campuran eluen 10% asam asetat glasial dalam methanol. Nilai Rf standart
asam klorogenat adalah 0,57. Pada fraksi air teridentifikasi asam klorogenat dengan nilai
Rf 0,46. Sedangkan pada fraksi buffer sitrat dengan pH yang berbeda juga terindikasi
senyawa asam klorogenat pada nilai Rf yang sama yaitu 0,43. Namun pada fraksi buffer,
noda yang dihasilkan kurang jelas, dikarenakan pemilihan fasa diam dan fasa geraknya
belum tepat.
3.4 Analisis kadar asam klorogenat menggunakan HPLC

Kromatogram HPLC untuk (a) fraksi A; (b) fraksi B6; (c) fraksi B5; (d) fraksi B4.

Tingkat kemurnian fraksi air dan fraksi buffer sitrat dianalisis menggunakan HPLC
dengan kolom ODS C-18, detector Photo Dioda Aray (PDA) dengan fasa gerak akuades :
 asetonitril (4:1). Standar asam klorogenat sebelumnya telah analisa dan menunjukkan
puncak serapan pada waktu retensi 4,456 menit.
Hasil analisis fraksi A menunjukkan dua puncak serapan pada waktu retensi 4,550 menit
(asam klorogenat) dan 5,154 menit (kafein).
Sedangkan pada fraksi B6, B5, dan B4 menunjukkan adanya puncak kecil yang melebar
pada masing-masing waktu retensi 4,545 menit, 4,545 menit, dan 4,537 menit. Setiap
fraksi B6, B5, dan B4 juga dibandingkan dengan standar kafein, dan masing masing
menunjukkan puncak serapan pada waktu retensi 5,143 menit; 5,132 menit; dan 5,158
menit.
Berdasarkan hasil analisis menggunakan HPLC pada jurnal tersebut masih terbentuk
puncak serapan selain asam klorogenat sehingga mengidentifikasikan bahwa senyawa
yang diperoleh belum murni sehingga masih harus dilakukan penelitian lebih lanjut.

4. Kesimpulan
Pada penelitian tersebut ditemukan asam klorogenat pada kopi robusta ( Coffea
canephora) dengan isolasi menggunakan metode kromatografi kolom ion exchange
dengan resin AmberliteTM FPA900UPS Cl teridentifikasi asam klorogenat pada kopi
dengan konsentrasi tertinggi yaitu 27,526 mg/L pada fraksi buffer sitrat pH 6,11.
Sehingga disimpulkan bahwa pemilihan metode ekstraksi, penggunaan buffer dan
pemilihan pH, sangat berpengaruh dalam pemurnian asam klorogenat. Apabila pHnya
lebih rendah atau lebih tinggi maka hasilnya kurang murni oleh karena itu ketika
dilakukan analisis dengan HPLC masih muncul puncak serapan lain yang bukan asam
klorogenat.
5. Daftar Pustaka

A. L. Underwood, & R. A. Day, Jr. (n.d.). Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Penerbit Erlangga.

FARHATY, N., & Muchtaridi, M. (2016). Tinjauan kimia dan aspek farmakologi senyawa asam klorogenat

pada biji kopi. Farmaka, 14(1), 214–227.

Rubiyanto, M.Si., D. (2013). Teknik Dasar kromatografi. Deepublish.

Sukohar, A., Wirakusumah, F. F., & Sastramihardja, H. S. (2013). Isolation and Characterization Cytotoxic

Compounds Caffeine and Chlorogenic Acid Seeds of Lampung Coffee Robusta. Jurnal Medika

Planta, 1(4).