MIKROSKOP ELEKTRON

Pengertian :
Sebuah mikroskop yang mampu melakukan pembesaran objek hingga dua juta kali,
memiliki kemampuan pembesaran objek, dan resolusinya jauh lebih bagus dibandingkan
dengan mikroskop cahaya. Mikroskop ini menggunakan elektrostatik dan elektromagnetik
untuk mengontrol pencahayaan, dan tampilan gambar. Selain itu, menggunakan lebih
banyak energi dan radiasi elektromagnetik yang lebih pendek dibandingkan dengan
mikroskop cahaya.
Jenis-Jenis Mikroskop Elektron :
Mikroskop Transmisi Elektron (TEM) Mikroskop Pemindai Elektron (SEM)

SEM digunakan untuk studi detail

TEM ditemuan oleh Dr. Ernst Ruska
(ilmuwan dari Univ. Berlin). Pada tahun
1931, beliau menciptakan mikroskop
dengan menggunakan 2 lensa magnet. 2 –
3 tahun kemudian, beliau menambahkan
lensa ketiga dan mendemonstrasikan
kinerjanya yang menghasilkan resolusi
hingga 100 nm.
Cara kerja TEM mirip dengan
projector slide, dimana elektron
ditembuskan kedalam objek pengamatan
dan pengamat dapat mengamati hasilnya
pada tembusan layar. TEM berfungsi untuk
mengamati bagian dalam sel atau organela
dalam suatu sayatan objek yang akan
diamati. Dalam penggunaannya terdapat
persyaratan bahwa objek pengamatan harus
setipis mungkin. Preparasi sediaan pada
TEM, yaitu :
1. Fiksasi, dilakukan dengan
menggunakan senyawa
glutaraldehida atau osmium
tetroksida untuk mematikan sel
tanpa mengubah struktur sel yang
akan diamati.
arsitektur permukaan sel atau struktur jasad
renik lainnya, dan objek akan diamati
secara tiga dimensi. Sejarah SEM, yaitu :
 Dr. Max Knoll (fisikawan Jerman,
1935) mendeskripsikan teori
pertama kali.
 Dr. Manfred von Ardenne
(fisikawan Jerman) mengklaim
dirinya telah melakukan penelitian
suatu fenomena, kemudian
disebut SEM hingga tahun 1937.
 Dr. Vladimir Kosma Zworykin,
Dr. James Hillier, Dr. Snijder
(ilmuwan Amerika, 1942)
membangun SEM dengan resolusi
hingga 50 nm atau magnifikasi
8.000 kali.
Pada SEM, gambar dibuat
berdasarkan deteksi elektron baru (elektron
sekunder) atau elektron pantul yang
muncul dari permukaan sampel ketika
dipindai dengan sinar elektron. Kemudian,
elektron sekunder atau elektron pantul
yang terdeteksi diperkuat sinyalnya dan
besar amplitudonya ditampilkan dalam
gradasi gelap-terang pada layar monitor
CRT (cathode ray tube), dimana gambar
struktur objeknya sudah diperbesar dan
dapat dilihat. Pada proses operasinya,
 2. Pembuatan sayatan, untuk
memotong sayatan hingga setipis
mungkin. Preparat dilapisi dengan
monomer resin melalui proses
pemanasan, kemudian dilakukan
pemotongan dengan mikrotom.
Sayatan yang telah terbentuk
diletakkan diatas cincin berpetak
untuk diamati.
3. Pelapisan/pewarnaan, dilakukan
dengan menggunakan logam
berat, seperti uranium atau timbal
untuk memperbesar kontras antara
preparat yang akan diamati
dengan lingkungan sekitarnya.
Mikroskop Pemindai Transmisi
Elektron (STEM)
STEM merupakan hasil
pengembangan dari TEM. Cara kerja
STEM, yaitu elektron menembus
spesimen, lalu optik elektron terfokus pada
sudut yang sempit dengan memindai objek
menggunakan pola pemindaian, dimana
objek dipindai dari satu sisi ke sisi yang
lainnya (raster), sehingga menghasilkan
lajur-lajur titik (dots) yang membentuk
gambar seperti CRT pada TV atau monitor.
Mikroskop Refleksi Elektron (REM)
Cara kerjanya sama dengan TEM,
namun sistem ini menggunakan deteksi
pantulan elektron pada permukaan objek.
Teknik ini menggabungkan dengan teknik
refleksi difraksi elektron energi (reflection
high energy electron diffraction) dan
teknik refleksi pelepasan spektrum energi
tinggi (reflection high-energy loss
SEM tidak memerlukan sampel yang
ditipiskan, sehingga dapat digunakan untuk
melihat objek dari sudut pandang 3
dimensi. Preparasi sediaan pada SEM,
yaitu :
1. Fiksasi, dilakukan dengan
menggunakan senyawa
glutaraldehida atau osmium
tetroksida untuk mematikan sel
tanpa mengubah struktur sel yang
akan diamati.
2. Dehidrasi, untuk memperendah
kadar air dalam sayatan, sehingga
tidak mengganggu proses
pengamatan.
3. Pelapisan/pewarnaan, dilakukan
dengan menggunakan logam
mulia, seperti emas atau platina
untuk memperbesar kontras antara
preparat yang akan diamati
dengan lingkungan sekitarnya.
Mikroskop Pemindai Lingkungan
Elektron (ESEM)
ESEM merupakan pengembangan
dari SEM untuk megatasi objek
pengamatan yang tidak memenuhi syarat
sebagai objek TEM maupun SEM.
Biasanya objek tersebut merupakan bahan
alami yang ingin diamati secara detail
tanpa merusak atau menambah perlakuan
yang tidak perlu terhadap objek. Teknologi
ESEM dirintis oleh Gerasimos D.
Danilatos, seorang kelahiran Yunani yang
berimigrasi ke Australia pada akhir tahun
1972.
Cara kerja ESEM, yaitu pertama
dilakukan suatu upaya untuk
menghilangkan penumpukan elektron
(charging) di permukaan objek dengan
spectrum ). membuat suasana dalam ruang sampel
tidak vakum, tetapi diisi dengan sedikit gas
Spin-Polarized Low-Energy Electron yang akan mengantarkan muatan positif ke
permukaan objek. Hal ini menimbulkan
Microscopy (SPLEEM)
masalah karena kolom tempat elektron dan
SPLEEM merupakan variasi lain ruang filamen dipercepat, dimana elektron
yang dikembangkan dari teknik yang sudah yang dhasilkan memerlukan tingkat vakum
ada sebelumnya, digunakan untuk melihat yang tinggi. Permasalahan dapat
struktur mikro dari medan magnet. diselesaikan dengan memisahkan sistem
pompa vakum ruang objek, ruang kolom,
dan filamen menggunakan sistem pompa
masing-masing ruang, kemudian dipasang
satu atu lebih piringan logam platina
(aperture) berlubang dengan diameter 200
– 500 nmikrometer untuk melekatkan
elektron dan perbedaan tingkat kevakuman
tiap ruangan tetap terjaga.
Teknik Pembuatan Preparat Pada Mikroskop Elektron
1. Kriofksasi : Menggunakan teknik pembekuan spesimen dengan cepat. Teknik ini
menggunakan nitrogen cair atau helium cair, dimana air yang ada akan membentuk
kristal-kristal menyerupai kaca.
2. Fiksasi : Untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan
menggunakan glutaraldehida atau osmium tetroksida.
3. Dehidrasi : Dengan cara menggantikan air dengan bahan pelarut organik, seperti
ethanol atau aceton.
4. Penanaman (Embedding) : Dengan cara menginfiltrasi jaringan dengan resin,
seperti araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian.
5. Pembelahan (Sectioning) : Untuk mendapatkan potongan tipis dari spesimen,
sehingga menjadikannya semi transparan terhadap elektron. Pemotongan ini bisa
dilakukan dengan ultramicrotome menggunakan pisau berlian untuk menghasilkan
potongan yang tipis sekali. Pisau kaca juga bisa digunakan karena harganya lebih
murah.
6. Pewarnaan (Staining) : Dengan menggunakan metal berat, seperti timah, uranium,
atau tungsten untuk menguraikan elektron gambar, sehingga menghasilkan kontras
antara struktur yang berlainan, dimana khususnya materi biological banyak yang
warnanya nyaris transparan terhadap elektron (objek fase lemah).
7. Pembekuan Fraktur (freeze fracture) : Untuk menguji membran lipid. Jaringan
atau sel segar didinginkan dengan cepat (cryofixed), kemudian dipatah-patahkan
atau dengan menggunakan microtome sewaktu masih berada dalam keadaan suhu
nitrogen (hingga mencapai -100o celcius).
8. Ion Beam Milling : Suatu metode persiapan sebuah sampel hingga menjadi
transparan terhadap elektron dengan menggunakan cara pembakaran ion (biasanya
digunakan argon) pada permukaan dari suatu sudut hingga memercikkan material
dari permukaannya. Metode Focused Ion Beam Milling lebih rendah, dimana
gallium ion digunakan untuk menghasilkan selaput elektron transparan pada suatu
bagian spesifik sampel.
9. Pelapisan Konduktif (Conductive Coating) : Mempersiapkan lapisan ultra tipis
dari suatu material electrically-conducting untuk mencegah terjadinya akumulasi
dari medan elektrik statis pada spesimen sehubungan dengan elektron irradiasi saat
proses penggambaran sampel.
 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Electrophoresis)

Pengertian Elektroforesis :
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan molekul (DNA, RNA, protein)
melalui medium tertentu berdasarkan ukuran dan muatan listriknya.
Prinsip yang digunakan adalah memisahkan protein berdasarkan BM dengan
menggunakan matriks penyangga akrilamid. Protein akan tersparasi dalam medan listrik,
dilanjutkan dengan pewarnaan, penghilangan warna, dan pembilasan gel. Pembacaan BM
dapat dilakukan dengan melihat pita yang terbentuk oleh marker.
Gel Pada Elektroforesis :
1. Agarose gel (DNA dan RNA)
2. Polyacrylamide gel (protein)
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang :
1. Bidang Kepolisian : Pemeriksaan DNA, seperti pemeriksaan sidik jari yang
memiliki karakteristik khusus.
2. Kegiatan Biologi Molekuler : Salah satu cara untuk memvisualisasikan
keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.
Aplikasi Elektroforesis :
1. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda
2. Mengetahui susunan sekuens berbagai genom
3. DNA fingerprinting
4. Mendeteksi kelainan genetik
5. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu.
6. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau
percobaan perlakuan gen.
7. Mempelajari evolusi tingkat molekular.
8. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam.
9. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein tertentu
10. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
11. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA plasmid
12. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR
Elektroforesis Protin :
Pada dasarnya dilakukan dengan prinsip serupa dengan elektroforesis DNA, namun
menggunakan gel poliakrilamid. Dalam pembuatannya, gel akrilamid ditambah sodium
dedocyl sulphate (SDS), yaitu senyawa untuk mendisosiasikan (penguraian) protein menjadi
sub-unitnya. Hal ini disebut dengan SDS-Page. Protein yang dielektroforesis dapat dianalisis
dengan pengecatan menggunakan COOmasie blue yang biasanya ditambahkan bersamaan
dengan sampel.
SDS-Page :
 Memisahkan protein berdasarkan ukuran.
 Sampel buffer harus dipanaskan selama 5 menit, berisi :
1. SDS (CH3-(CH2)10-CH2OSO3-NA+)
2. Glukosa atau gliserol
3. Ionizable tracking dye (i.e., bromophenol blue)
 Prinsip dasar pengerjaan :
1. Tempatkan gel pada peralatan chamber.
2. Masukkan sampel dalam well / sumuran.
3. Run gel
 Elektroforesis Gel Poliakrilamid

Beberapa sampel dapat dimasukkan ke dalam gel poliakrilamida. Pipet microliter

digunakan untuk memasukkan larutan ke dalam sumuran. Sampel yang bermuatan negatif
akan bergerak menuju anoda, pada bagian bawah gel.
Agarose SDS-Page
Untuk asam nukleat, seperti DNA dan Untuk protein dengan ukuran yang
RNA. berbeda.
Memisahkan berdasarkan muatan listrik, Memisahkan berdasarkan ukuran.
ukuran, dan bentuk.
Gel terbuat dari agar yang berasal dari Gel terbuat dari bubuk polyacrylamide.
rumput laut.
Identifikasi Kemurnian Dengan SDS-Page

Alat : Separating gel 12,5%

Seperangkat alat elektroforesis, kaca load, Acrylamide 30% 2063 µl
comb (sisir), mikropipet, mikrotip, beaker 1,5 M Tris-HCl pH 1250 µl
glass, timbangan analitik, spatula, tube 8,8
elektroforesis, kompor listrik, kuvet, dan H2O 1635 µl
spektrometer. SDS 10% 50 µl
APS 10% 50 µl
Bahan :
TEMED 10 µl
Aquades, akrilamid, LGB (Lower Gel
Buffer), UGB (Upper Gel Buffer), TEMED Stacking gel
Acrylamide 30% 257,5 µl
(Tetra Etil Metil Ethilene Diamine), APS
1 M Tris-HCl pH 312,5 µl
(Amonia persulfat), pepsin, running buffer 6,8
(berisi SDS), larutan pewarna (Croomasil H2O 662,5 µl
Brilian Blue, metanol, asam asetat glasial, SDS 10% 12,5 µl
aquabides), larutan pembilas (metanol,
asam asetat glasial, aquabides). APS 10% 3,75 µl
1M Tris-HCl pH 6,8 (20 ml) TEMED 2,5 µl
Tris-HCl 3,1528 gr Acrylamide 30% (50 ml)
Aquadest 20 cc Acrylamide 14,5 gr
SDS 10% (10 ml) Bis Acrylamide 0,25 gr
H2O 50 cc
SDS 1 gr
1,5 M Tris-HCl pH 8,8 (50 ml)
Aquadest 10 cc
Tris HCl 11,823 gr
APS 10% (1ml) Aquades 50 cc
APS 0,1 gr
Teknik Elektroforesis Gel Poliakrilamid

A. Persiapan Sampel

Alat : Bahan :
- Appendorf 1,5 ml - Sampel protein
- Tracking dye / RSB :
 Tris HCl pH 6,8 1 ml
 Gliserol 0,8 ml
 SDS 10% 1,6 ml
 β-mercaptoetanol 0,4 ml
 Bromophenol blue 1% 0,2 ml
 Aquadest 4 ml
B. Persiapan Gel

1. Alat dan bahan pembuatan gel disiapkan. Kaca dipasang pada penjepitnya.
2. Campuran bahan separating gel disiapkan sesuai dengan resep dan
konsentrasinya.
3. Campuran separating gel dihomogenkan dengan cepat agar tidak segera
mengeras.
4. Campuran separating gel dimasukkan pada gel caster dengan bantuan pipet,
diikuti dengan pemberian aquades agar permukaan gel rata dan oksigen tidak
ada.
5. Ruang disisakan untuk stacking gel.
 6. Setelah separating gel mengeras, sisa aquades dibuang.
7. Campuran stacking gel disiapkan.
8. Campuran stacking gel dihomogenkan dengan cepat.
9. Campuran stacking gel dituang di atas separating gel dan sisir (comb) segera
dipasang diatas stacking gel.
10. Gel dibiarkan hingga mengeras.
11. Setelah gel mengeras, kaca dilepas dari penjepitnya.
12. Gel pada kaca dipasang pada alat elektroforesis dan running buffer dituang.
C. Prosedur
1. Sampel protein dan tracking dye (RSB) disiapkan.
2. 20 µl sampel protein dan 20 µl tracking dye (RSB) dicampur, dimasukkan
dalam eppendorf.
3. Sampel direbus pada suhu 100°C selama 5 menit.
4. Sampel didinginkan pada suhu ruangan.
D. Elektroforesis Gel

1. Sampel protein dimasukkan ke dalam gel melalui ujung atas stacking gel
sebanyak 2 µl/sumur.
2. Power supply dinyalakan.
3. Sampel diproses atau running dengan memberikan tegangan listrik sebesar 120
V selama 60-90 menit.
4. Gel dilepas dari kacanya.
E. Staining dengan Coomasie Briliant Blue
1. Gel direndam dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R - 250.
2. Rendaman gel dalam staining solution Coomasie Brilliant Blue R – 250
diletakkan di dalam shaker selama 20 - 30 menit.
F. Destaining
1. Pewarna pada gel dihilangkan dalam rendaman destain solution ± 1 – 2 jam
sambil tetap di shaker.
2. Lakukan destaining semalam di atas shaker sampai gel kelihatan bersih.
3. Gel siap discan dan dianalisa hasilnya.
4. Hitung BM protein pada band protein yang tampak pada gel menggunakan
grafik regresi linear.
G. Pewarnaan dan Pelunturan Gel
 Perendaman dengan larutan pewarna (staining solution) untuk melihat pita
protein. Larutan pewarna yang sering digunakan adalah Commasie Brilliant
Blue dengan lama waktu perendaman selama 30 menit.
 Larutan peluntur (destaining solution) diberikan selanjutnya sampai terlihat
jelas pita protein di permukaan gel. Berat molekul protein ditentukan dengan
memasukkan jarak migrasi ke dalam persamaan regresi linier standard marker.
 Pelunturan warna atau destaining pada gel dilakukan secara berulang hingga
didapatkan pita protein berwarna biru dengan latar gel bening.

Protein Gel Calculating Protein Size

Perhitungan BM dari masing-
masing protein didasarkan pada marker
yang tersedia.
1. Mengukur total jarak tracking
dari stacking gel ke separating
gel.
2. Mengukur jarak tracking dari
stacking gel ke masing-masing
band protein yang terbentuk.
3. Dari BM masing-masing band
marker di log kan, kemudian
dicari retardation factor (RF)
 dengan membagi jarak tracking
masing-masing band dengan
jarak tracking total.
4. Dibuat kurva marker log BM
sebagai axis (x) dan RF sebagai
ordinat (y).
Perhitungan :
 Panjang separating gel = 4,8 cm
 Panjang pita sampel = 3,2 cm

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Percobaan Elektroforesis

A. Ukuran dan Bentuk Molekul

 Semakin besar ukuran molekul, maka pergerakan akan semakin lambat.
Bentuk molekul sekunder atau tersier mempunyai pergerakan yang lebih
lambat daripada protein primer.
B. Konsentrasi Gel
 Pada konsentrasi gel yang rendah, maka pergerakan protein lebih cepat dan
sebaliknya.
C. pH
 Besarnya pH sangat berpengaruh pada metode elektroforesis protein karena
akan mempengaruhi titik isoelektrik protein, sehingga dapat mempengaruhi
tingkat dan arah pergerakan protein.
D. Suhu
 Suhu akan mempengaruhi denaturasi protein dimana pada elektroforesis
digunakan suhu 90-95°C untuk mendenaturasi protein.
E. Voltage
 Voltage yang tinggi mempengaruhi pergerakan protein dalam gel
elektroforesis menjadi ebih cepat dan sebaliknya.
 PEMERIKSAAN METODE CHLIA

Pemeriksaan Infeksi Menular Lewat Transfusi Darah (IMLTD)

Deteksi IMLTD dapat dilakukan terhadap antibodi dan atau antigen, seperti metode
rapid test, Enzyme Immuno Assay (EIA), Chemiluminescence ImmunoAssay (ChLIA), dan
terhadap materi genetik virus seperti metoda Nucleic Acid Amplification Test (NAT).
Perbandingan Uji Saring
EIA CHLIA
Solid phate Microplate Magnetik partikel
Conjugate Ag/Ab/Anti-IgG berlabel enzim Ag/Ab/Anti-IgG
Substrat Chromogen (dengan enzim akan Luminol, isoluminol, derivatnya
berubah warna) (derivate acridinium ester)
Pembacaan Spektrofotometer Luminometer
Prinsip CHLIA

Prinsip Dasar dan Teknologi CMIA

CMIA adalah suatu metode pemeriksaan Chemiluminescent microparticle
immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi antibodi (IgM dan IgG terhadap HIV) atau
dapat juga digunakan untuk mendeteksi antigen (P24). Teknik ini memeiliki akurasi yang
sangat tinggi mencapai 99,8%.
A. Rangkaian Reaksi 1 Step
 Penambahan paramagnetik mikropartikel dan konjugate ke sampel
 Dihomogenkan
  Inkubasi, sehingga analit yang ada didalam sampel akan berikatan dengan anti
analit yang ada di mikropartikel dan membentuk ikatan immunocomplex
 Pencucian
 Penambahan Pre-trigger (H2O2)
 CMIA reader membaca background
 Penambahan trigger solution (sodium hidroksida) ke dalam campuran reaksi.
Acridinium melewati proses oksidasi ketika terpapar menjadi peroksida dan
larutan alkali. Reaksi ini menyebabkan terjadinya reaksi chemiluminescent dan
melepaskan energi dalam bentuk emisi cahaya.
 Pembacaan
B. Rangkaian reaksi untuk 2 step
 Penambahan paramagnetik mikropartikel dan konjugate ke sampel
 Dihomogenkan
 Inkubasi, sehingga analit yang ada didalam sampel akan berikatan dengan anti
analit yang ada di mikropartikel dan membentuk ikatan immunocomplex.
 Magnet menarik paramagnetik mikropartikel yang telah berikatan dengan
analit yang ada disampel ke didinding rv.
 Pencucian
 Penambahan konjugate. Konjugate ini akan melekat pada ikatan immun,
sehingga ikatan menjadi sempurna.
 Inkubasi
 Pencucian
 Penambahan Pre-trigger (H2O2)
 CMIA reader membaca background
 Penambahan trigger solution (sodium hidroksida) kedalam campuran reaksi.
Acridinium melewati proses oksidasi ketika terpapar menjadi peroksida dan
larutan alkali. Reaksi ini menyebabkan terjadinya reaksi chemiluminescent dan
melepaskan energi dalam bentuk emisi cahaya.
 Pembacaan
 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Elisa Reader
 ELISA merupakan metode immunoassay yang digunakan untuk deteksi antibodi,
protein, peptida, dan biomolekul.
 Immunoassay berasal dari kata (immuno = secara imuno) dan (assay = kemurnian
suatu substansi atau jumlah konstituen dalam suatu campuran).
 Disebut ELISA, dikarenakan :
1. Antigen / antibodi yang diinginkan diabsorbsi ke permukaan plastik (sorbent).
2. Antigen dikenali oleh antibodi spesifik (immuno).
3. Antibodi tersebut dikenali oleh antibodi kedua(immuno) yang ditempeli oleh
enzim (enzyme-linked).
4. Substrat bereaksi dengan enzim untuk memproduksi produk berupa warna.

Dalam pengertian sederhana, yaitu :

- Sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, lalu
antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan
dengan antigennya.
- Antibodi tersebut akan terikat dengan suatu enzim dan pada tahap terakhir
akan ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang
dapat dideteksi.
 Komponen-komponen penting dalam immunoassay, yaitu antibodi (antiserum),
antigen, dan labelling material.
 Antibodi (antiserum) : protein yang diproduksi oleh sistem imun untuk melawan
antigan.
 Antigen : molekul yang menginduksi produksi antibodi ketika dikenali oleh tubuh,
seperti bakteri, virus, dll.

 Labelling material : diperlukan adanya marker untuk mengetahui ikatan antigen-

antibodi, namun marker tidak boleh mengganggu ikatan.