Standarisasi Obat Alam II

Oleh: Ahwan
•Parameter Non Parametik
Cemaran Mikroba (COLIFORM)
• Merupakan golongan bakteri gram negatif
• Tidak membentuk spora & fakulatif anaerob.
• Coliform tumbuh dengan adanya garam empedu &
memfermentasi laktosa dgn hasil asam (370C).
• Oksidasi negatif E. Coli adlh salah satu grup coliform yg dpt
memfermentasi laktosa dgn membentuk asam & gas (44 0C).
• Indol (+), tdk menggunakan citrat, menhasilkan asam dari
manitol (37 0C), MR (+), VP (-)
BGL (Brillian Green Lactose)
LB (lactose Broth, Gibco) Pepton
Beef extract 3,5 g Lactose
Pepton 5,0 g Ox gall
Lactose 5,0 g Briliant Green
Distilled Water 1L Destilled Water 1 L
Preparasi Awal

PDF (Pepton
Dilution Fluid)

Diambil 9 mL

1 mL 1 mL E+ 1 mL
Ekstrak 9 mL A+ 9
ad 10 ml PDF (A) mL PDF
PDF (E) (B)
Uji Perkiraan

Tiap tabung (A,B,C,) disiapkan 2 tabung berisi 9 mL MCB

yang dilengkapi tabung Durham (A1,A2,A3 dst)

Masukkan 1 mL pengencer untuk tabung (A1,A2,A3) dst

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam

Catat dan amati gas pada tiap tabung setelah 24-48 jam
Uji Konfirmasi
Pindahkan 1 sengkelit biakan dari tabung yang
menunjukkan uji prakiraan positif ke dalam tabung yang
berisi 10 mL BGLB yang dilengkapi tabung Durham

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam

Amati pembentukan gas

Catat jumlah tabung yang positif gas dan rujuk pada tabel
NDT/MPN

Tabel MPN menunjukkan jumlah bakteri coliform per gram

sampel yang diuji
TABEL MPN Coliform
3 dari setiap 10 mL 3 dari setiap 1 mL
0 0
0 0
0 1
1 0
1 0
1 1
1 1
1 2
2 0
2 0
2 1
2 1
2 2
2 2
3 0
3 0
3 0
3 1
3 1
3 1
3 2
3 2
3 2
3 3
3 3
3 3
3 3
3 dari setiap 0,1 mL per 100 mL
0 3
1 3
0 3
0 4
1 7
0 7
1 11
0 11
0 9
1 14
0 15
1 20
0 21
1 28
0 23
1 33
2 64
0 43
1 755
2 120
0 93
1 150
2 210
0 240
1 160
2 1100
3 2400
Cemaran Mikroba
Kapang dan Khamir
• Merupakan jenis jamur
• Kapang (multiseluler) dan khamir (uniseluler).
• Dimana kapang lama kelamaan akan mengjasilkan
mikrotoksin yaitu suatu alfatoksin dari golongan
alfatoksin.
• Dapat tumbuh dengan faktor cuaca (suhu dan
kelembaban)
• Semakin rendah suhu dan kelembaban semakin tinggi
maka pertumbuhan kapang semakin baik.
• Tumbuhan pada sediaan pangan (berupa kacang-
kacangan, jagung, beras dan lain) atau simplisia dengan
kadar air yang tinggi.
• Pertumbuhan 3 – 7 hari lebih lama daripada bakteri
Prosedur
ASA (Air
Suling Agar)
0,05%
Potato Dextrosa Agar (PDA)
Air Suling Agar 0,05% (ASA) Diambil 9 mL

1 mL 1 mL E 1 mL B 1 mL C
Ekstrak ad 5 ad 5 ad 5
ad 5 mL mL mL ASA mL ASA
ASA (A) ASA (B) (C) (D)

Pipet 0,5 mL tabung (A,B,C,D) pada permukaan PDA cair pada

cawan petri

Goyang sambil putar (buat duplo)

 Blangko:
Media PDA
Media PDA dan ASA 1 mL

Biarkan memadat

Inkubasi 25-26ºC selama 5-7 hari

Catat jumlah koloni jamur yang tumbuh pada hari 5-7

Koloni ragi (bulat-bulat kecil putih seperti bakteri)

Lempeng yang diamati yang ada 40-60 koloni kapang/khamir

Kontrol:
K1 Cawan petri diisikan media dan dibiarkan memadat
K2 Cawan petri diisikan media dan pengencer kemudian dibiarkan
memadat
Cara Perhitungan

Misalkan pada pengenceran 10-4 terdapat sebanyak 40

koloni, maka angka kapang/khamir (bila terdapat) adalah
40 x 10-4 koloni per gram.
• Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari
pengenceran yang sama menunjukkan jumlah antara 40-
60 koloni, dihitung jumlah koloni dari kedua cawan dan
dikalikan dengan faktor pengenceran
• Bila pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat
jumlah koloni lebih besar dari dua kali jumlah koloni pada
pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat
pengenceran terendah (misal pada pengenceran 10-2
diperoleh 60 koloni dan pada pengenceran 10-3 diperoleh
20 koloni, maka dipilih jumlah koloni padatingkat
penegenceran 10-3 diperoleh 20 koloni
Cara Perhitungan

• Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan
jumlah 40-60 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat
pengenceran terendah dan dihitung sebagai angka kapang/khamir
perkiraan.
• Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan
disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka kapang/khamir
dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran
terendah.

Rumus Perhitungan :
Uji Eschericia coli
• Merupakan bakteri gram negatif
• Berbentuk batang
• Bakteri golongan aerob.
• Menyebabkan terjadinya penyakit infeksi yaitu infeksi
saluran Kemih (ISK), infeksi saluran cerna (diare) dan
gastroentritis.
• Biakan yang positif diuji dengan MPN coliform, diinokulasi
dalam media ECB (Eschericia coli Broth) dan diinkubasi
pada suhu 44 0C selama 24 – 48 jam.
• Gas yg terbentuk pd tabung durham berarti positif
megandung coliform dan dilakukan penanaman pada
media EMBA (Eosin Methylene Blue Agar) di inkubasi
selama 24 jam pada suhu 37 0C.
Preparasi Awal
A 10-1 B 10-2 C10-3
0,5 mL 0,5 mL A 0,5 mL B
Ekstrak ad 5 mL ad 5 mL
ad 5 mL BPW(B) BPW (C)
BPW (A)

Kocok

Ambil 0,25 mL dan tuang pada permukaan BP agar

Sebar dan ratakan dengan batang gelas bengkok (duplo)

Biarkan hingga terserap media

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam (posisi cawan terbalik)
 Setelah 24 jam

Ambil cawan dengan jumlah koloni 30-300 (warna hitam mengkilap dan
dikelilingi daerah jernih)

Beri tanda pada koloni

Inkubasi sampai 48 jam

Hitung koloni semua yang tumbuh (seperti di atas)

Uji Koagulase
Pindahkan koloni yang diduga Staphylococcus aureus dalam
tabung BHIB

Inkubasi pada suhu 35 - 37ºC selama 20-24 jam

+ 0,3 mL plasma kelinci dalam 0,1 mL biakan BHIB

Inkubasi pada suhu 35 - 37ºC selama 4 – 6 jam

Terjadi gumpalan koagulase S.A positif

Staphylococcus aureus
Preparasi
Ekstrak dipreparasi dan dilarutkan dalam media Buffered Pepton
Water (BPW) diambil dengan berbagai macam seri konsentrasi dan
dimasukkan dalam cawan poreslin yang berisi media baird parker (BP)
diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 – 48 jam
A 10-1 B 10-2 C10-3
0,5 mL 0,5 mL A 0,5 mL B
Ekstrak ad 5 mL ad 5 mL
ad 5 mL BPW(B) BPW (C)
BPW (A)

Kocok

Ambil 0,25 mL dan tuang pada permukaan BP agar

Sebar dan ratakan dengan batang gelas bengkok (duplo)

 Biarkan hingga terserap media

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24-48 jam (posisi cawan terbalik)

Setelah 24 jam

Ambil cawan dengan jumlah koloni 30-300 (warna hitam mengkilap dan
dikelilingi daerah jernih)

Beri tanda pada koloni

Inkubasi sampai 48 jam

Hitung koloni semua yang tumbuh (seperti di atas)

Media yang Digunakan
Baird Parker
Brain Heart Infusion Broth (BHIB)
Plasma kelinci
Buffered Pepton Water
Vogel Johnson (VJ) agar
Salmonella sp
Preparasi
Ekstrak dipreparasi dan dilarutkan dalam media Lactose broth diambil
diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 – 48 jam. Diambil cuplikan
kedalam media Tetrahionate Brilliant Green Broth (TBGB) dan Selenit
Cystine Broth (SCB) pada suhu 43 0C selama 24 jam

Pra-pengkayaan (pre-enrichment)

Cuplikan dalam LB hasil homogenisasi (1 mL ad 10 mL LB dibuat duplo)

Lactose Broth (LB)

Inkubasi 37ºC selama 18-24 jam (dihomogenkan)

 Pengkayaan selektif
•Tetrahionate Brilliant Green Pindahkan 1 mL biakan LB dalam
Broth (TBGB) @ 10 mL media TBGB
•Rappapport Vasilliadis (RV)
@ 10 mL SCB
•Selenit Cystine Broth (SCB)
•Brilliant Green Agar (BGA) @ 10 mL RV (high microbial load)
•Bismuth Sulfit Agar (BSA)

Inkubasi pada suhu 43ºC selama 24 jam

Isolasi
Pindahkan 1sengkelit biakan dari TBGB , RV dan SCB pada permukaan
BGA dan BSA

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam

Amati koloni yang tumbuh

BGA: koloni dari tidak berwarna merah muda hingga merah, dari translucent hingga keruh
(opaque) dengan lingkaran merah muda hingga merah.
BSA: koloni berwarna coklat abu-abu sampai hitam dan kadang-kadang dengan kilap
logam. Warna media di sekitar koloni mula-mula berwarna coklat, jika masa inkubasi
bertambah, warna koloni menjadi hitam.
Identifikasi
Pilih 2 atau lebih koloni tersangka BGA dan BSA

Inokulasikan pada TSIA, LIA dan NA dengan tusukan/goresan

Inkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam

Dugaan salmonella positif bila:

TSIA warna merah pada permukaan agar, warna kuning pada

dasar tabung dengan atau tanpa pembentukan hidrogen sulfida
LIA warna ungu, bila permukaan berwarna ungu, sedangkan
bagian dasar berwarna kuning, maka dianggap negatif
Uji Serologi
Pindahkan 1 sengkelit dari NA miring

Suspensikan dengan 1 tetes NaCl 0,85% pada kaca obyek

Aglutinasi segera suspensi tidak dapat dipakai

Tidak terjadi aglutinasi spontan teteskan antisera salmonella
polivalen O pada suspensi. Homogenkan dengan menggoyangkan
kaca obyek atau menggunakan sengkelit

Amati selama 1 menit terjadi aglutinasi: Salmonella positif

ALFATOKSIN
• Merupakan toksin atau racun dari mikotoksin dari kapang
Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus.
• Dipengaruhi oleh faktor cuaca (suhu dan kelembaban)
• Terdapat pada bahan pangan & pakan ternak.
• Terdiri dari alfatoksin B1, B2, G1 dan G2.
• Mikroorganisme yang mempunyai metabolit berfluoresensi
pada panjang gelombang 366 nm.
• Mudah dianalisis dengan kualitatif dan kuantitatif, apabila
punya standar baku alfatoksin.
• Metode analisanya bisa menggunakan KLT atau elisa reader.
Structure Alfatoksin
Metode Analisa
Terhadap larutan ekstrak dan baku aflatoksin dilakukan kromatografi
lapis tipis sebagai berikut:
Fase diam : Lempeng pra lapis silica gel (E Merck)
Baku aflatoksin : Campuran siap pakai terdiri atas 5,0 µg
Aflatoksin B1 ;1,5 µg Aflatoksin B2 ; 5,0 µg
Aflatoksin G1 ; 1,5 µg Aflatoksin G2 dalam larutan
campuran toluene dan asetonitril (98:2).
Pengembang : Campuran Kloroform-Aseton-n-Heksana (85:15:20)
Jarak rambat : 8 cm
Penampak bercak: Bercak berwarna biru atau hijau kebiruan setelah
lempeng diletakkan dibawah sinar UV 366 nm
menandakan aflatoksin positif.
PARAMETER SPESIFIK
Identitas Senyawa

• Penentuan senyawa ini adalah suatu senyawa

khas/identik/penanda pada tanaman atau ekstrak.
• Berupa senyawa dari metabolit sekunder.
• Biasanya senyawa yg mempunyai aktifitas farmaklogi dan
bakteriologi.
• Bisa digunakan sebagai larutan baku atau standar (baku
primer atau sekunder).
• Merupakan golongan senyawa : fenol, flavonoid, alkaloid,
terpenoid, steroid dan lain-lain.
• Mudah didapat atau diisolasi
Fase diam : Silika gel 60 F254, jarak elusi 8 cm
Fase gerak : Toluene-etil asetat-asam format (5:5:0,6)
Larutan uji : 20 % dalam methanol
Larutan pembanding : Tilirosid 0,02 % dalam metanol
Deteksi : Sitroborat, panaskan pada 110o C selama 10 menit.
S : Sampel ekstrak daun jati belanda
P : Pembanding tilirosid
Rf Pembanding 0,26
1. Sinar tampak, coklat muda
2. UV 254 Pemadaman
2. Sitroborat UV 366, fluorosensi hijau

1 2 3
Contoh senyawa
HO OH
O CH2
H3C HO O

HO OH
OH O
Eugenol (cengkeh) Morin (kayu nangka) Aloin A (lidah buaya)

O OH
CH3
OH
O
O
HO OH O OH
O
OH

HO O
H3C CH3
OH

Timol (Herba Thymi) Tilirosida (Jatibelanda)

Abrusoside (Daun Saga)

O
H
Kandungan Total Senyawa

• Kandungan Flavonoid Total (Spektrofotometer UV-

VIS)

• Kandungan Fenolat Total (Spektrofotometer UV –

VIS)

• Kandungan alkaloid Total (Gravimetri)

• Kandungan Tanin

• Kandungan Saponin

• Kandungan Minyak atsiri (destilasi atau GC-MS)

Flavonoid Total
Metode Chang
Penetapan kandungan total flavonoid dilakukan secara
kolorimetri dengan spektrofotometri visibel. Kandungan total
flavonoid dalam ekstrak dinyatakan sebagai Kuersetin
Equivalent (%).

Pembuatan seri kadar kurva baku. larutan standar tadi

ditambah dengan etanol 95% hingga 1 ml dan ditambahkan
0,1 ml alumunium klorida 10% dan 0,1 ml kalium asetat 1
M, ditambah aquabidest. Setelah di operating Time,
absorbansi diukur pada panjang gelombang 437 nm.
Flavonoid Total
Metode Zhou
• Penetapan kandungan total flavonoid dilakukan secara
kolorimetri dengan spektrofotometri visibel.
• Kandungan total flavonoid dalam ekstrak dinyatakan
sebagai Rutin Equivalent (%) dari persamaan kurva baku
rutin.
• Rutin 0,1% dlm methanol
• Rutin ditambah dengan aquabidest hingga dan
ditambahkan NaNO2 5%, didiamkan selama 6 menit.
Lalu l AlCl3 10% ditambahkan dan didiamkan kembali
selama 6 menit. Terakhir ditambahkan ditambahkan
NaOH 4% dan aquabidest hingga volume akhir.
• Tentukan Operating Time.
• Absorbansi diukur pada panjang gelombang 510,5 nm.
Fenolat Total
Spektrofotometri Visibel/Folin Ciocalteu

• Kadar fenolat total dalam ekstrak dinyatakan sebagai Gallic

Acid Equivalent (%) .
• Kurva baku asam galat. Dlm aqua bidestilata.
• Ditambah dengan Folin Ciocalteu selama 5 menit. Ditambah
Na2CO3 7% b/v (dalam aquabidest), dicampur homogen
selama 30 detik, lalu ditambah dengan aquabidest
• Diamkan sesuai OT yang diperoleh
• Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum 749,5
nm.
Fenolat Total
• Hidrolisis
• Ekstrak ditimbang dan dimasukkan labu alat bulat. Hidrolisis
dengan ditambahkan 1 ml larutan heksanmetilentetramina
0,5%, 20 ml aseton dan 2 ml HCl 25% dalam air.
• Hidrolisis dengan pemanasan hingga mendidih (dengan
pendingin air/refluks) selama 30 menit. Campuran hasil
hidrolisis disaring, kemudian dimasukkan labu ukur 25,0 ml.
Residunya dihidrolisis kembali dengan ditambah 20 ml
aseton,
• Setelah dingin, volumenya ditepatkan dengan aseton, dikocok
hingga rata. filtrat ditambah aquadest dimasukkan dalam
corong pisah, kemudian diekstrasi kocok dengan etil asetat.
• Didapat fraksi etil asetat sebanyak 25,0 ml. fraksi etil asetat
dengan etil asetat
Pengukuran UV -Vis

Fraksi etil asetat hasil hidrolisis dimasukkan labu ukur

ditambah dengan AlCl3 2% (dalam larutan asam asetat
glacial 5% v/v (dalam methanol)). Volume ditepatkan
dengan asam glasial 5% v/v (dalam methanol) hingga.
Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang maksimum
424 nm setelah didiamkan selama 70 menit. Perhitungan
kadar menggunakan kurva standar rutin hasil hidrolisis
dinyatakan dalam persen rutin terhidrolisis.
Steroid Total
Spektrofotometer Visibel
• Larutan Standar yg digunakan sitosterol dlm etanol 95 %.

• ekstrak, @ timbang seksama 500 mg ekstrak + etanol

+ 1,0 ml larutan biru tetrazolium P

+ 1,0 ml campuran larutan tetrametil ammonium hidroksida

+etanol ad 10,0 ml

• Inkubasi selama operating time di tempat gelap

• Ukur A° pada λmaks dibandingkan terhadap blangko (2,0 ml

biru tetrazolium + 2,0 ml tetrametil ammonium hidroksida +
etanol ad 10 ml)
Alkaloid Total
Gravimetri

• Sampel ditimbang dan dilarutkan dengan 50 ml larutan asam asetat

10% (dalam etanol).
• Larutan dikocok dengan magnetic stirrer selama 4 jam, kemudian
disaring.
• Filtrat kemudian dievaporasi hingga seperempat volume awalnya.
• Kemudian ditetesi dengan ammonium hidroksida hingga terjadi
endapan alkaloid.
• Endapan disaring dan dicuci dengan menggunakan larutan
ammonium hidroksida 1%.
• Kertas saring yang mengandung endapan dikeringkan dalam oven
pada suhu 60°C selama 30 menit. Setelah dingin.
• Rendemen alkaloid ditetapkan dari persentase bobot endapan
alkaloid yang diperoleh terhadap bobot penimbangan awal sampel.
Saponin Total
Spektrofotometri UV Vis dan Hemolisa
• Pembuatan suspensi darah (dengan Na sitrat 3,65 % b/v +
ad darah sapi segar ad 100 mL.
• Pembuatan Larutan baku Saponin
• 0,5 g ekstrak + larutan dapar fosfat pH 7,4 .
• Diamkan selama 6 jam pada suhu kamar
• Lihat tabung yang menghasilkan hemolisis total larutan
merah jernih tidak ada endapan
• Campur homogen, cegah terjadinya buih
• Kocok lagi setiap 30 menit, diamkan selama 24 jam pada
suhu kamar.
• Lihat tabung yang menghasilkan hemolisis total larutan
merah jernih tidak ada endapan. Hitung kadar saponin
Minyak Atsiri Total
Destilasi Uap

Labu alas bulat 1 L dihubungkan dengan pendingin dan buret

berskala. Timbang dengan seksama 1,0 g ekstrak dan
dimasukkan ke dalam labu, kemudian ditambahkan 200 mL
air suling dan batu didih. Tambahkan 0.20 ml xylene pada
tabung berskala. Labu dipanaskan dengan penangas udara,
sehingga penyulingan berlangsung dengan lambat tetapi
teratur. Setelah penyulingan selesai, biarkan selama tidak
kurang dari 15 menit, volume minyak atsiri pada buret dicatat.
Kadar minyak atsiri dihitung dalam % v/b. Penetapan
dilakukan tiga kali untuk masing-masing ekstrak.
KADAR SARI LARUT AIR
Gravimetri
• Tekniknya dari pengekstraksian lalu diendapkan sampai
bobot konstan.
• Digunakan untuk meemperoleh senyawa yg larut air (polar)
seperti fenol, glikosida, flavonoid.
• ekstrak dimaserasi dengan 25,0 mL air-kloroform LP selama
24 jam, menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali
dikocok selama 6 jam pertama. Kemudian didiamkan selama
18 jam dan disaring. Filtrat air sebanyak 5,0 mL diuapkan
dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, residu
dipanaskan pada suhu 105oC hingga bobot tetap. Kadar sari
larut air dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal
Rumus Perhitungan
Bobot krus + ekstrak = X mg
Bobot krus kosong = Y mg -
Bobot ekstrak = Z mg
Timbang seksama 0.1 % batas minimal dan maksimal

Perhitungan kadar sari larut air

% Kadar sari larut air = W mg – Y mg X fp X 100 % = A % b/b
Z mg
Keterangan:
W mg : Bobot akhir krus+ekstrak setelah dari oven
Y mg : Bobot krus kosong yang konstan
Z mg : Bobot ekstrak
Fp : Faktor pengenceran 5 X
A% : Kadar sari larut air dalam b/b
Kadar Sari Larut Etanol
Gravimetri

• Sejumlah 1,0 g ekstrak dimaserasi dengan 25,0 mL

etanol 96%, selama 24 jam dengan menggunakan labu
bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam
pertama. Kemudian dibiarkan selama 18 jam dan
disaring cepat menghindarkan penguapan etanol. Filtrat
sebanyak 20 mL diuapkan dalam cawan dangkal
berdasar rata yang telah ditara. Residu dipanaskan
pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar sari larut
etanol dihitung dalam persen terhadap ekstrak awal.
• Perhitungan sama dilakukan pada sari larut air
• Untuk melarutkan senyawa yang larut dalam etanol
(semipolar)
Uji kandungan Kimia Ekstrak
Metode TLC-Scaner

Contoh: curcumin dlm curcumae domseticae

TLC Scaner

• Untuk mengetahui kadar senyawa aktif pada ekstrak

• Prinsip sama dengan KLT

• Hasil KLT dibaca dengan beam pd plat silika yg ditembak

pada lampu uv dan vis.

• Penetapan berdasarkan panjang gelombang maksimal.

• Hasil berupa absorbansi yang dikalkulasi menjadi luas area.

• Data berupa peak dan Retention time.

• Semakin luas peak maka area semakin luas juga,

 Peak Area

Sampel Ekstrak Kunyit Standar Kurkumin 0,75 %

KCKT/HPLC (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
• Penetapan Kadar Asiaticosida pd pegagan
Pegagan
Deteksi UV VIS
Kromatogram
Adrographidis Paniculata
Andrographolide
 Ekstak Sambiloto Konsentrasi Andrographolide
Ekstrak Etanol 95 % 25,8 mg/g
Ekstrak Etanol 50 % 19,4 mg/g
Ekstrak Etanol 20 % 2,0 mg/g
Ekstrak Air 0,8 mg/g
Kromatografi Gas O CH2
Kadar Eugenol pada minyak cengkeh Cengkeh
H3C

HO

waktu retensi 13,994 menit

L Area : 1.174.141

Standar Eugenol

L Area : 634535
93,17±1,72%b/b

Minyak Cengkeh
Massa Spectral Eugenol

Analisis dilakukan dengan menggunakan Shimadzu GC-2010 dilengkapi dengan detektor

mass selektif Shimadzu GCMS-QP2010S dan kolom kapiler RxiTM-1ms (30 m x 0,25 mm,
ketebalan film 0,25 µm). Sistem ionisasi elektron untuk deteksi GC-MS menggunakan
energi ionisasi sebesar 70 eV. Kecepatan alir helium sebagai gas pembawa diatur 1,0
mL/menit. Injektor dan MS transfer line temperatures diatur pada 280 dan 245oC, secara
respektif. Suhu kolom dijaga pada 50oC, ditingkatkan hingga 100oC dengan kenaikan
10oC/menit (ditahan selama 1 menit), kemudian ditingkatkan hingga 140 oC dengan
kenaikan suhu 5 oC/menit, ditingkatkan kembali hingga 160 oC dengan kenaikan 2
oC/menit dan ditingkatkan hingga 245 oC dengan kenaikan 5 oC/menit.