BAB V

PERHITUNGAN MIKROBA

5.1. Tujuan Percobaan

- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
cawan sebar
- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
cawan tuang
- Menghitung jumlah koloni mikroorganisme dalam sampel dengan metode
MPN
5.2. Tinjauan Pustaka
Mikroorganisme adalah jasad renik/mikroba yang tidak dapat dilihat langsung oleh
mata telanjang karena ukurannya sangat kecil bahkan beberapa jenis diantaranya
uniseluler atau hanya mempunyai satu sel. Contoh mikroorganisme bersel satu adalah
bakteri karena ukurannya yang sangat tidak memungkinkan untuk dilihat secara
langsung oleh mata maka, hanya dapat dilihat menggunakan alat bantu seperti
mikroskop (Novizan, 2002).
Pertumbuhan mikroba dapat ditentukan dengan beberapa cara seperti melalui
metode pengukuran langsung dan tidak langsung. Pengukuran pertumbuhan secara
langsung dapat dilakukan dengan beberapa cara, contohnya dengan menghitung jumlah
sel menggunakan Petroff Hausser Bacteria Counter atau Hemasitometer, atau dengan
mengukur kepekatan (turbiditas) selnya menggunakan Spectrofotometer. Perhitungan
secara langsung yang dihitung adalah jumlah total mikroba baik yang masih hidup
maupun yang sudah mati. Sedangkan pertumbuhan jasad renik tak langsung melalui
metode penuangan (Plating) pada medium padat atau dengan menimbang berat
biomassanya. Dalam metode penuangan jumlah sel ditentukan dengan menghitung
jumlah koloni yang tumbuh dalam medium padat sehingga yang terhitung hanya sel-sel
yang masih hidup (Yuwono, 2008).
Pertumbuhan individu adalah penambahan jumlah volume sel serta bagian-bagian
sel lainnya. Pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk jasad renik bersel tunggal.
Prinsip dari teknik perhitungan dengan menggunakan metode cawan yaitu koloni yang
nantinya akan dihitung menggunakan Colony Counter terlebih dahulu ditumbuh pada

59
60

suatu atau beberapa media sehingga sel tersebut dapat berkembangbiak dan membentuk
koloni-koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata telanjang tanpa menggunaakan
bantuan mikroskop (Yunita, 2015).
Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni
bakteri yang tumbuh pada media pembiakan.
Teknik untuk menghitung jumlah mikroba terdiri dari tiga macam metode
perhitungan cawan yaitu:
1. Metode Agar Tuang (Pour Plate Method)
Pada Metode agar tuang sampel dicampurkan dengan media padat yang mendukung
pertumbuhan mikroorganisme, dan kemudian menginkubasi media yang telah
dicampurkan dengan sampel agar setiap sel-sel bakteri dapat membelah dan
memperbanyak diri sehingga membentuk koloni-koloni yang nantinya jumlah koloni
tersebut dapat dihitung.
2. Metode Sebar di Atas Pelat Agar (Spread Plate Method)
Metode ini dilakukan dengan menyebarkan sampel (yang telah diencerkan) diatas
permukaan agar dalam cawan petri. Teknik penyebaran dilakukan menggunakan
kawat ose atau batang pengaduk yang telah disterilkan dengan banyaknya sampel
antara 0,1 mL dan 1 mL. Kemudian cawan yang telah terdapat sampel harus melalui
tahap inkubasi terlebih dahulu agar mikroba yang ditanam pada media dapat tumbuh
dan berkembang supaya nantinya dapat lebih mudah untuk menghitung bakteri yang
telah tumbuh menjadi suatu koloni (Harmita, 2006).
3. Metode MPN (Most Probable Number)
Metode perhitungan ini biasanya digunakan untuk menghitungan jumlah bakteri pada
media dengan menggunakan nilai duga tertentu berdasarkan jumlah perkiraan
terdekat yaitu perhitungan dalam range tertentu. nilai duga tersebut dapat kita lihat
pada tabel MPN (Most Probable Number) (Harti, 2015).
 61

Tabel 5.1. Nilai duga terdekat (Most Probable Number) MPN

Jumlah Tabung Positif

MPN`
Seri A Seri B Seri C

0 0 0 0,03

0 0 1 0,03

0 0 2 0,06

0 0 3 0,09

0 1 0 0,03

0 1 1 0,61

0 1 2 0,092

0 1 3 0,12

0 2 0 0,62

0 2 1 0,93

0 2 2 0,12

0 2 3 0,16

0 3 0 0,094

0 3 1 0,13

0 3 2 0,16

0 3 3 0,19

0 0 0 0,036
62

1 0 1 0,072

1 0 2 0,11

1 0 3 0,15

1 1 0 0,073

1 1 1 0,11

1 1 2 0,15

1 1 3 0,19

1 2 0 0,11

1 2 1 0,15

1 2 2 0,20

1 2 3 0,24

1 3 0 0,16

1 3 1 0,20

1 3 2 0,24

1 3 3 0,29

1 0 0 0,091

2 0 1 0,14

2 0 2 0,20

2 0 3 0,26
 63

2 1 0 0,15

2 1 1 0,20

2 1 2 0,27

2 1 3 0,34

2 2 0 0,21

2 2 1 0,28

2 2 2 0,35

2 2 3 0,42

2 3 0 0,29

2 3 1 0,36

2 3 2 0,44

2 3 3 0,53

2 0 0 0,23

3 0 1 0,39

3 0 2 0,64

3 0 3 0,95

3 1 0 0,43

3 1 1 0,75

3 1 2 0,20
64

3 1 3 0,60

3 2 0 0,93

3 2 1 1,50

3 2 2 2,10

3 2 3 2,90

3 3 0 2,40

3 3 1 4,60

3 3 2 11,00

3 3 3 24,00
(Lestary,2018).
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba
- Suhu
Pada suhu atau temperatur yang lebih rendah bakteri tidak dapat berkembang biak.
ada bakteri yang dapat bertahan pada suhu -70 ℃ sampai bertahun-tahun akan tetapi
berbeda dengan bakteri patogen pada manusia, karena pada suhu 0 ℃ bakteri akan
mati. Bakteri yang dapat bertahan pada suhu tinggi umummnya lebih berbahaya.
Beberapa bakteri akan mati jika dipanaskan pada suhu diatas maksimum
- Cahaya
Keberadaan beberapa bakteri dapat dipengaruhi oleh cahaya, sinar UV yang ada pada
cahaya bisa menyebabkan kematian pada bakteri, Selain itu sebagian besar baktei
pertumbuhannya tidak tergantung pada cahaya karena bakteri tersebut bersifat
kemototrof
- Kelembaban
Sifat bakteri yang hanya dapat mengambil makanan dalam bentuk larutan
(Holophitis) menyebabkan air merupakan salah satu faktor pertumbuhan bakteri yang
sangat penting. Semua bakteri tumbuh dan berkembang dengan baik pada suasana
basah dan udara yang lembab sebaliknya bakteri tidak dapat tumbuh dan
 65

berkembang pada udara yang kering karena bakteri tidak dapat merombak makanan
pada keadaan tersebut
- Keasaman (pH)
Perubahan pH dapat menghambat pertumbuhan organisme. Perubahan pH dapat
dicegah menggunakan larutan penyangga (senyawa atau pasangan senyawa yang
dapat menahan perubahan pH) seperti KH2PO4 dan K2HPO4 yang merupakan
kombinasi garam-garam fosfat kedalam media (Lestary, 2017).
Bacillus spp merupakan jenis mikroba yang memiliiki kemampuan untuk
dikembangkan dalam skala industri bioteknologi karena, mempunyai sifat-sifat seperti
memiliki kisaran suhu pertumbuhan yang luas, pembentuk spora, kosmopolit, memiliki
kemampuan enzimatik yang beragam, dan beberapa diantaranya mampu melakukan
biodegradasi (perombakan bahan organik oleh enzim) terhadap banyak senyawa
rekalsitran dan Xenobiotic. Bacillus spp adalah bakteri gram positif, membentuk
endospore, dan bergerak dengan flagel (Hatmanti, 2000).

Gambar 5.1. Bacillus spp

(Diarta, 2016).
Staphylococcus Aureus adalah jenis mikroba yang dapat tumbuh pada temperatur
6,5 – 46 ℃ pada pH 4,2 – 9,3. Koloni tumbuh dalam waktu 24 jam dengan diameter
hingga 4 mm. koloni yang ditanam pada media padat berbentuk bundar, halus, menonjol
dan berkilau, bakteri ini membentuk koloni berwarna abu – abu sampai kuning emas tua
(Dewy, 2013).
66

Gambar 5.2. Staphylococcus Aureus

(Toelle, 2018).
 67

5.3. Alat dan bahan

A. Alat-alat yang digunakan: B. Bahan-bahan yang digunakan:
- Autoklaf - air sampel (air jeruk basi)
- Ball pipet - kaldu nutrisi
- Beakerglass - KFL
- cawan petri - nutrisi agar
- Colony Counter
- Deckglass
- gelas ukur
- Incubator
- kawat ose
- kaca preparat
- spatel bengkok
- tabung reaksi
- pipet volume
5.4. Prosedur Percobaan
A. Tahap pengenceran
- Mengambil 1 mL air sampel dan menambahkan dengan 99 mL kaldu nutrisi
steril, disebut pengenceran 10-2
- Mengambil 1 mL dari pengenceran 10-2 dan menambahkan dengan 9 mL kaldu
nutrisi steril, disebut pengenceran 10-3
- Mengulangi percobaan seperti diatas sampai pengenceran 10-7.
B. Metode cawan sebar
- Mengambil media nutria agar steril secukupnya dan tuangka kedalam cawan
petri dan biarkan sampai dingin
- Setelah dingin dan padat masukaan 1 mL air sampel dari pengenceran 10-4
Meratakan dengan spatel bengkok yang telah disterilkan secara aseptik
- Setelah padat inkubasi dengan posisi terbalik selama 24-48 jam pada suhu 37
℃
- Menghitung jumlah moloni dengan Colony Counter.
68

C. Metode cawan tuang

- Mengambil 1 mL air sampel dari pengenceran 10-4 dan tuang dalam cawan petri
bersama dengan media nutrisi agar steril (kondisi panas)
- Menutup dan biarkan hingga dingin dan padat
- Menginkubasi dengan posisi terbalik selama 24 - 48 jam pada suhu 37 ℃
- Menghitung jumlah koloni dengan Colony Counter.
D. Metode MPN
- Menyiapkan 9 tabung reaksi
- 3 tabung reaksi seri A, 3 tabung untuk seri B, dan 3 tabung untuk seri C
- Masukan 1 mLair sampel dari pengenceran 10,-5 10-6, 10-7 untuk masing-masing
tabung
- Memasukan tabung durham pada semua tabung reaksi dengan posisi mulut
tabung dibawah
- Mengisi semua tabung reaksi dengan 9 mL KFL
- Menutup tabung reaksi dengan kapas/ Tissue
- Inkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 37 ℃
- Mengamati perubahan pada tabung durham dan hitunglah jumlah tabung positif
untuk masing-masing seri tabung
- Menggunakan tabung MPN untuk perhitungan
METODE CAWAN
1
Jumlah koloni = jumlah koloni per cawan ×
faktor pengenceran
METODE MPN
1
Jumlah koloni = nilai MPN ×
faktor pengenceran tengah
 69

5.5. Data Pengamatan

Tabel 5.2. Data Pengamatan Perhitungan Mikroba
No. Perlakuan Pengamatan
1. Metode cawan sebar
Pengecatan 10-4 pada sampel
a. setelah inokulasi - Warna : Kuning pucat
- Pertumbuhan mikroba : -

Pengamatn makro
b. setelah inkubasi 24-48 jam - Warna : Putih
- Jumlah koloni : 51

Pengamatan mikro
- Warna : Biru
- Bentuk : Batang panjang
- Lensa obyektif : 40 ×
- Lensa okuler : 10 ×
- Perbesaran : 400 ×
- Gambar : Bacillus Subtilus
70

2. Metode cawan tuang

Pengecatan 10-4 pada
sampel - Warna : Kuning pucat
a. setelah inokulasi - Pertumbuhan mikroba : -

Pengamatan makro
b. setelah inkubasi 24-48
- warna : Putih
jam
- jumlah koloni : 47

Pengamatan mikro
- warna : Biru muda
- bentuk : Seperti pulau
- lensa objektif : 40 ×
- lensa okuler : 10 ×
- Perbesaran : 400 ×
- Gambar : Bacillus Subtilus

3. Metode MPN pada sampel

a. setelah inokulasi 1. Pengenceran 10-5
- Warna : Kuning jernih
- Keadaan larutan : Cair
2. Pengenceran 10-6
- Warna : Kuning jernih
- Keadaan larutan : Cair
3. Pengenceran 10-7
- Warna : Kuning jernih
- Keadaan larutan : Cair
 71

1. Pengenceran 10-5
b. setelah inkubasi 24-48 - Warna : Kuning pucat
jam - Keadaan larutan : Ada gelembung
- Tabung positif :1
- Tabunng negative :2
Pengamatan mikro
- Warna : Biru tua
- Bentuk : Batang, bersel
- Gambar : Bacillus

2. Pengenceran 10-6
- Warna : Kuning pucat
- Keadaan larutan : Ada gelembung
- Tabung positif :-
- Tabung negative :3
Pengamatan mikro
- Warna : Biru kehitaman
- Bentuk : Tidak teratur
- Gambar : Staphylococus
Aureus
72

3. Pengenceran 10-7
- Warna : Kuning pucat
- Keadaan larutan : Ada gelembung
- Tabung positif :1
- Tabunng negatif :2

Pengamatan mikro
- Warna : Hitam
- Bentuk : Tabung,
memanjang
- Gambar : Bacillus

5.6. Perhitungan
A. Metode cawan sebar
Diketahui : Jumlah koloni pada cawan sebar adalah 51
Ditanya : Jumlah koloni?
Jawab :
1
Jumlah koloni = jumlah koloni per cawan ×
faktor pengenceran
1
= 51×
10−4
= 51× 104
B. Metode Cawan Tuang
Diketahui : Jumlah koloni pada cawan tuang adalah 47
Ditanya : Jumlah koloni?
Jawab :
1
Jumlah koloni = jumlah koloni per cawan ×
faktor pengenceran
1
= 47 ×
10−4
= 47× 104
C. Metode MPN
 73

Diketahui : Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-5 A adalah 1

Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-6 B adalah 0
Jumlah tabung positif dari pengenceran 10-7 C adalah 1
Nilai MPN adalah 0,072
Ditanya : Jumlah koloni?
Jawab :
1
Jumlah koloni = jumlah MPN ×
pengenceran tabung tengah
1
= 0,072×
10−6
= 0,072× 106
5.7. Pembahasan
A. Tahap pengenceran
Menambah 99 mL kaldu nusi steril pada 1 mL air sampel bertujuaan unyuk
mengencerkanan larutan yang disebut pengenceran 10-2. Lalu menambahkan 9 mL
kaldu nutrisi pada sampel dilakukan dengan tujuan untuk yang sama yaitu
pegenceraan larutan dan disebut pengenceran 10-4 dan pengenceran bertujuan untuk
memisahkan sel-sel yang bergabung menjadi satu (berkoloni) sehingga mempermudah
pengamatan. Semakin tinggi pengenceran maka semakin kecil jumlah koloni bakteri.
dengan kata lain tingkat pengenceran berbanding terbalik dengan jumlah koloni
bakteri
B. Metode cawan sebar
Sampel dari pengenceran 10-4 dibiarkan dingin karena jika suhu terlalu panas
maka akan mati, lalu tutup cawan petri agar media tidak terkontaminasi dengan bakteri
lain. Kemudian media dirataakan dengan spatel bengkok agar bakteri dapat tumbuih
merata pada media. Sebelum melakukan praktikum semua alat terlebih dahulu
disterilkan agar tidak terdapat bakteri-bakteri yang tidak diinginkan, dan pada saat
diikubasi cawan petri diletakan dalam posisi terbalik dengan tujuan untuk membantu
pertumbuhan mikroba dan meratakan panas secara menyeluruh pada cawan petri.
Menghitung jumlah bakteri menggunakan Colony Counter untuk mengetahui jumlah
mikroba yang ada pada media, beberapa mikroba yang bergabung jadi satu koloni
dihitung satu dan jumlah koloni mikroba yang dihasilkan 51 × 104 koloni/ mL.
C. Metode cawan tuang
74

Ambil pengenceran 10-4 dan campurkan dengan air sampel 1 mL dengan tujuan
untuk menumbuhkan mikroba dengan pengenceran yang pekat dan kemudian biarkan
media memadat agar bakteri dapat tumbuh dengan baik, lalu inkubasi dilakukan pada
suhu 37 ℃ selama 24-48 jam karena pada suhu dan rentan waktu tersebut merupakan
keadaan optimum untuk pertumbuhan bakteri, setelah diinkubasi hitung jumlah bakteri
menggunakan Colony Counter untuk mengetahui jumlah mikroba dan jumlah koloni
mikroba yang dihasilkan 47 × 104 koloni/ mL
D. Metode MPN
Menyiapkan 9 tabung reaksi digunakan untuk menyimpan media lalu membagi 9
tabung reaksi dengan seri A, B dan C dengan tujuan supaya nantinya setiap seri
dimasukan dengan pengenceran yang berbeda-beda. Penggunakan 9 tabung reaksi
yang dibagi menjadi 3 seri dengan jenis pengenceran yang berbeda-beda bertujuan
untuk mengetahui perbedaaan jumlah bakteri pada setiap pengenceran, dan tabung
durham dimasukan kedalam tabung reaksi dengan tujuan untuk mendeteksi adanya
mikroba dengan melihat gas yang ada pada ujung tabung durham kemudian mengisi
tabung reaksi dengan KFL karena pada metode MPN menggunakan media cair sebagai
pertumbuhan mikroba. Sebelum diinkubasi tabung reaksi ditutup dengan Tissue, hal
ini bertujuan agar media tidak terkontaminasi dengan mikroba yang tidak kita
inginkan lalu media diinkubasi agar bakteri dapat tumbuh dan berkembang dan tabung
positif yang dihasilkan adalah 2 buah tabung yaitu pengenceran 10 -5 dan 10-7 sehingga
jumlah koloni mikroba yang dihasilkan 0,072 × 106 koloni/ mL
5.8. Kesimpulan
- Jumlah mikrooganisme dalam air sampel pada teknik perhitungan mikroba
dengan menggunakan metode cawan sebar adalah 51 × 104 koloni/ mL
- Jumlah mikrooganisme dalam air sampel pada teknik perhitungan mikroba
dengan menggunakan metode cawan tuang adalah 47 × 104 koloni/ mL
- Jumlah mikrooganisme dalam air sampel pada teknik perhitungan mikroba
dengan menggunakan metode MPN adalah 0,072 × 106 koloni/ mL