METODE PENELITIAN

1. Alat dan Bahan

Alat yang elemayer 250 mL, beaker gelas 100 mL, mikro pipet, tabung sentrifugasi,
petridish, jarum ose,labu takar 10 mL dan 100 mL, ice bath, vial, dan tabung reaksi.
Instrumen yang digunakan High Performa Liquid Cromatography detektor flouresens,
UV-Vis double beam,
Bahan yang digunakan dalam penelitian Kultur Bakteri Lactobacillus brevis, MRS
broth, MRS Agar.
2. Metode penelitian
2.1. Peremajaan dan penumbuhan kultur
Medium peremajaan terdirin dari MRS broth dan MRS agar. Sebanyak 5,22
gram MRS broth ditimbang ditimbang dalam beaker gelas dilarutkan dalam 50 mL
akuades. Larutan dihomogenkan dengan bantuan microwave, setelah larutan menjadi
kuning jernih dipindahkan kedalam tabung reaksi sebanyak masing masing 10 mL.
Bagian atas tabung ditutup dengan kapas dan alumunium voil.
Medium agar dibuat dari MRS agar, medium dibuat dengan menimbang 6,82
gram agar dan dilarutkan dalam akuades sebanyak 100 mL. Pelarutan dibantu
dengan microwave hingga medium menjadi kuning bening. Kedua medium di
autoklaf pada suhu 120 °C tekanan 1 atm 2 jam. Alat gelas diautoklaf dalam oven
dengan suhu 121 °C, dilapisi kertas.
Kultur hidup kemudian dipindahkan kedalam medium broth dan di inkubasi
pada suhu 37 °C selama 1x 24 jam. Pemindahan kultur dilakukan di dalam Laminar
Air Flow (LAF) untuk menghindari kontaminan. Medium agar disiapkan dalam
petridish dan dibiarkan mengeras. Setelah 24 jam medium broth yang mengeruh
dipipet 1 ml dan diletakan dimedium agar. Kultur diratakan dengan menggunakan
jarim ose. Medium agar yang telah berisi kultur diinkubasi selama 72 jam dengan
suhu 37°C.
2.2. Identifikasi bakteri
Identifikasi dilakukan secara makroskopik melihat penampakan tanpa
bantuan mikroskop. Penampakan dicatat dan didokumentasikan. Secara mikroskopik
dilakukan identifikasi bentuk dan pewarnaan gram. Dalam tahap pewarnaan gram,
disiapkan kaca preparat dan dioleskan bakteri kultur, setelah 1 menit ditambahkan
dengan beberapa tetes kristal violet dan diamkan kembali 1 menit. Sisa pewarna
 dibilas dengan air mengalir hingga bersih, dan ditambahkan dengan iodin sebagai
pewarna kedua. Preparat didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air
mengalir. Sebagai peluntur cat ditambahkan dengan alkohol 90 % dan dibilas
kembali dengan akuades. Pewarna keempat safarin ditambahkan dan didiamkan
selama 1 menit kemudian dibilas dengan akuades. Preparat dikeringkan dengan
kertas saring. Kemudian dilakukan pengamatan dibawah mikroskop dengan
perbesaran 10x dan 100x. Gram positif menunjukan sel berwarna ungu dan gram
negatif tidak.

Hasil Pengamatan :

a. Pengamatan Makroskopik
Hasil pengamatan makroskopik bakteri Lactobacillus brevis memperlihatkan koloni
berbentuk bulat yang berjauhan. Bentuk ini dinamakan effuse dengan sedimentik
pada medium broth menunjukan sifat bakteri anaerob.

Gambar 1penampakan makroskopik koloni Lactobacilus brevis

Gambar 2Gambar makroskopik Lactobacillus brevis dengan medium MRS Agar miring
b. Pengamatan Mikroskopik
Hasil pengamatan dengan perbesaran 10 x tidak dapat terlihat wujud dari bakteri
Lactobacillus brevis. Pada perbesaran 100 x terlihat sel bakteri Lactobacillus brevis
berbentuk batang pendek. Hasil pewarnaan gram menunjukan hasil gram positif
dengan warna sel batang ungu (violet)

Gambar 3 pengamatan Mikroskopik Lactobacillus brevis dengan perbesaran 10x

 Gambar 4 Pengamatan mikroskopik Lactobacillus Brevis dengan perbesaran 100 x

Gambar 5 Pengamatan Mikroskopik Lactobacillus Brevis dengan perbesaran 100 x setelah

pewarnaan gram

2.3. Perhitungan jumlah koloni dan kurva pertumbuhan

 Perhitungan coloni bakteri dilakukan dengan menggunakan metode Optical
density dengan standar Mc.Farland. langkah pertama dilakukan pembuatan standar
Mc.Farland 1, 2, 3, 4, 5. Larutan standar terdiri dari BaCl dan H2SO4 dengan
perbandingan tertentu menunjukan jumlah koloni bakteri. Larutan yang telah dibuat
divorteks dan diukur panjang gelombang maksimumnya. Pengukuran absorbansi
larutan standar dilakukan pada panjang gelombang 500-600 nm. Hasil absorbansi
dibuat kurva linier dan dilakukan pengukuran sampel mikroba. Pembuatan kurva
pertumbuhan dilakukan selama 3 hari. Pengukuran absorbansi dilakukan setiap 2
jam pada hari pertama, kedua dan ketiga.

Hasil Pengamatan :

Pengukuran Absorbansi standar Mcfarland dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer

Uv-vis dengan hasil ditunjukan tabel 1. Nilai absorbansi sampel Lactobacillus Brevis dengan
medium MRS Broth adalah sebesar 0,361. Dengan faktor pengenceran 1. R 2 kurva kalibrasi
dari hasil plot data standar MCFarland dengan absorbansi adalah 0,9998 dengan persamaan
linier y = 0,0263x + 0,0034. Total koloni Lactobacillus Brevis 13,5970 x 108 CFU.

Tabel 1. Hasil pengukuran spektrofotometer uv-vis standar MCFarland.

Approximate
1% Bacterial
McFarland STD 1% BaCl H2SO4 Suspensi X 108 Absorbansi
1,0 0,10 9,9 3 0,082
2,0 0,20 9,8 6 0,162
3,0 0,30 9,7 9 0,239
4,0 0,40 9,6 12 0,322
5,0 0,50 9,5 15 0,397
 0.45

0.4
f(x) = 0.0263333333333333 x + 0.00340000000000001
0.35 R² = 0.999820573779421

0.3
Absorbansi

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
2 4 6 8 10 12 14 16
Konsentrasi standar McFarland

Gambar 6. Kurva Kalibrasi Standar MCFarland

Kurva pertumbuhan Lactobacillus brevis menunjukan fase log terjadi pada 24 jam pertama
kemudian fase stationer pada 26 jam- 48 jam. Fase akhir stationer merupakan puncak dari
Lactobacillus brevis menghasilkan senyawa metabolot skunder. Hasil tersebut dijadikan dasar
lama fermentasi substrat selanjutnya.

Tabel 2. Hasil Pengukuran Absorbansi Lactobacillus brevis pada fase pertumbuhan

pengukura
hari Jam n Abs
2 1 0,072
4 2 0,082
day 1 6 3 0,104
22 4 0,361
24 5 0,399
26 6 0,674
28 7 0,692
day 2 30 8 0,749
46 9 0,749
48 10 0,772
54 11 0,703
day 3 56 12 0,659
 72 13 0,407
74 14 0,243
day 4 76 15 0,179

0.9
0.8
0.7
0.6
Absorbansi

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Waktu (Jam)

Gambar 7 kurva pertumbuhan bakteri Lactobacilus brevis