DNA SEQUENCING

Sequencing merupakan penentuan urutan basa

DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif

pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat
memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari
molekul DNA

Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang

akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

Prinsip Dasar DNA

sequencing

DNA sequencing menggunakan metode

PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai
pijakannya. DNA yang akan ditentukan
urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai
cetakan (template) untuk kemudian
diamplifikasi menggunakan enzim dan
bahan-bahan yang mirip dengan reaksi
PCR, namun ada penambahan beberapa
pereaksi tertentu. Proses ini
dinamakancycle sequencing

Yang membedakan cycle sequencing

dengan PCR biasa adalah:
1. Primer yang digunakan hanya satu
untuk satu arah pembacaan, tidak dua
(sepasang) seperti PCR
2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide
Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs
dengan menghilangkan gugus 3-OH pada
ribosa

Terdapat dua teknik sequencing:

1. Maxam & Gilbert, menggunakan chemical
sequencing
Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang
didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik
oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi,
metode ini sekarang jarang digunakan

Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide

triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada
karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH
pada deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

Dideoxynucleotides

merupakan penghenti rantai. Dalam

reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan
sintesis akan berhenti karena 3OH yang diperlukan untuk
penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.

Deoxy vs dideoxy

DNA Sequencing

A lot of modern DNA

sequencing is based
upon the following
modified nucleotides.
Metode Sanger dideoxy ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel
1980

Sintesis
DNA

Karena tidak ada

OH, replikasi berhenti

Metode Sanger memerlukan

DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai

template DNA
Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang
berpasangan dengan template DNA dan berfungsi
sebagai starting point untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA,
menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari
template
Sejumlah nukeotida normal
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel
(radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida

normal tetapi secara random dideoxy (DD)
nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan
reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang
bervariasi , masing-masing berhenti pada
DDnukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak
dengan kecepatan yang berbeda selama
elektroforesis, maka urutannya dapat
ditentukan.

Dideoxy DNA
Sequencing

DNA Sequencing
Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang
dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan
dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser
saat DNAs melewati jendela detektor.
Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang
terlihat dibawah ini.

DNA sequencing
Automated DNA sequencing pada automated
DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif
tidak digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy
dikerjakan dalam satu tabung tunggal.
Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna
flourescent yang berbeda.
Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang
disintesa korespon dengan warna yang berikatan
pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk
menghentikan sintesis fragmen.
Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur
pada gel dan dielektroforesis.

DNA Sequencing
Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke
gel dan mendeteksi dan mencatat warna yang
berikatan dengan fragmen saat mereka melewati
gel.
Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan
warna yang keluar dari gel.

Capillary tubes
Reagents

Sample tray
goes here

Inside the sequencer

Sebuah print out hasil sequencing

Perbandingan sequence
DNA sequence alignment memasangkan dua DNA
sequences untuk memaksimalkan kesamaannya
AACG

1. AACG dan AACG

| | | |

AACG
AAGG
| |

2. AAGG dan AACG

AACG
1 mismatch

3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC

AACG - GT ATGC
ATCG G GT -TGC

2 gaps

Best alignment memasangkan dua sekuens dengan

sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps
Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2;
tiap mismatch/ gap: -1
AACG
| | | |

AACG
score = 8

AAGG
| |

AACG

score = 5

AACG - GT A TGC
ATCG G GT - TGC
score = 16

Sequence-alignment programs

BLAST: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/