DNA Sequencing

Peta Konsep

Pengertian Sequencing
Sequencing adalah penentuan urutan basa
DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif
pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam
nukleat memungkinkan kita mengetahui kode
genetic dari molekul DNA.

Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA sequencing menggunakan metode PCR
(Polymerase Chain Reaction) sebagai
pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan
basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan
(template) untuk kemudian diamplifikasi
menggunakan enzim dan bahan-bahan yang
mirip dengan reaksi PCR, namun ada
penambahan beberapa pereaksi tertentu.
Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Komponen-komponen yang terlibat

dalam proses squencing meliputi:
Beberapa kopi dari template DNA utas tunggal
Primer yang sesuai (sepotong DNA yang dapat berpasangan
dengan DNA template yang bertindak sebagai titik mulai
untuk replikasi)
DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA,
menambahkan nukleotid baru pada ujung 3 dari template)
Suatu kolam berisi nukleotida normal

Sekuen DNA membawa informasi

DNA

Transcription

mRNA

Translation

Protein

Utas DNA
2-deoxyribose (sugar)

Ujung 5
C

Ujung 3
G

Bases

A (adenine) komplementer dengan T (thymine)

C (cytosine) komplementer dengan G (guanine)

DNA utas ganda

 Sequencing merupakan metode menentukan urutan

basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada
sepotong DNA.

Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang

akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.
Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan
perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya
protein non fungsional
Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada
organisme

Terdapat dua teknik sequencing:

Maxam & Gilbert, menggunakan chemical sequencing
Sanger, menggunakan dideoxynucleotides.
Sequencing yang modern menggunakan prinsip teknik Sanger.
Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide
triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada
karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada
deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).
Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam
reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan
bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena
3OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida
berikutnya tidak ada.

Deoxy vs dideoxy

DNA Sequencing

A lot of modern DNA

sequencing is based
upon the following
modified nucleotides.
Metode Sanger dideoxy ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel
1980

Sintesis
DNA

Karena tidak ada

OH, replikasi
berhenti

Metode Sanger memerlukan

DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai
template DNA
Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan
dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point
untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan
nukleotida baru ke ujung 3 dari template
Sejumlah nukeotida normal
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau
dengan pewarna fluorescent)

 Template DNA direplikasi melibatkan

nukeotida normal tetapi secara random
dideoxy (DD) nukleotida diambil
(dipasangkan).
Penambahan dideoxy nukeotida
menyebabkan reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang
bervariasi , masing-masing berhenti pada
DDnukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda
bergerak dengan kecepatan yang berbeda
selama elektroforesis, maka urutannya
dapat ditentukan.

Dideoxy DNA
Sequencing

DNA Sequencing
Metode original
dengan
menggunakan
radiolabeled DNA.
Sejumlah kecil
dideoxy
nucleotides
ditambahkan ke
reaksi polymerase
DNA.

DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari
satu utas DNA dalam
reaksi.
2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.

DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari
satu utas DNA dalam
reaksi.
2. Tidak semua
nukeotida adalah
dideoxy.
Sehingga multiple
terminated products
dihasilkan (tanda panah
merah)

DNA Sequencing
Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang
dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan
dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser
saat DNAs melewati jendela detektor.
Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang
terlihat dibawah ini.

DNA sequencing
Automated DNA sequencing pada automated
DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif
tidak digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy
dikerjakan dalam satu tabung tunggal.
Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna
flourescent yang berbeda.
Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang
disintesa korespon dengan warna yang berikatan
pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk
menghentikan sintesis fragmen.
Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur
pada gel dan dielektroforesis.

DNA Sequencing
Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan
ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna
yang berikatan dengan fragmen saat mereka
melewati gel.
Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan
warna yang keluar dari gel.

Capillary tubes
Reagents

Sample tray
goes here

Inside the sequencer

Perbandingan sequence
DNA sequence alignment memasangkan dua DNA
sequences untuk memaksimalkan kesamaannya
1. AACG dan AACG

AACG
| | | |

AACG
AAGG
| |

2. AAGG dan AACG

AACG
1 mismatch

3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC

AACG - GT ATGC
ATCG G GT -TGC

2 gaps

Best alignment memasangkan dua sekuens dengan

sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps
Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2;
tiap mismatch/ gap: -1
AACG
| | | |

AACG
score = 8

AAGG
| |

AACG

score = 5

AACG - GT A TGC
ATCG G GT - TGC
score = 16