ELEKTROFORESIS

KAPILER
Kelompok :
Antonio Kautsar
Hasrudin
Definisi
Metode yang digunakan untuk memisahkan asam
amino, protein, lipid, karbohidrat dan nukleotida
yang berlangsung pada tabung kapiler seperti pada
kolom kromatografi gas (Harvey 2000).

2
Sejarah
1967: S Hjerten menggambar elektroforesis kapiler
menggunakan kolom bore 3mm.
1974 & 1979: R Virtanen & FEP Mikkers membuat yang
lebih advance
1981: JW Jorgenson & KD Lukacs menggunakan kolom bore
25m dan tegangan 30kV

3
Pendahuluan
Masalah pelebaran pita spt pada elektroforesis zona dapat diatasi,
seperti
– Perbedaan densitas antara sampel dan buffer
– Panas yang dihasilkan oleh arus melalui buffer
– Beragam konsentrasi sampel yang dapat menyebabkan
konduktivitas lokal
– Difusi molekular
– Laju parabolik dari cairan pada permukaan pergerakan
– Difusi eddy jika menggunakan gel
Partikel yang dipisahkan memiliki posisi yang sama dalam tabung
Perbedaan suhu antara pusat tabung dan dinding tabung dapat
diminimalisir
4
Instrumentasi
1. Injektor
2. Tabung Kapiler
3. Elektroda
4. Sumber tegangan
5. Detektor

5
Instrumentasi

Injeksi hidrodinamik menggunakan bantuan

perbedaan tekanan saat injeksi sampel pada
kolom kapiler.

ΔP: perbedaan tekanan (Pa)

d: diameter kapiler dalam (m)
t: waktu injeksi (det)
ή: viskositas bufer (kg.m-1dt-1)
L: panjang tabung kapiler (m)
103: faktor konversi m3 ke liter

6
Instrumentasi
Injeksi elektrokinetik menggunakan bantuan arus
listrik, sehingga ion dapat bermigrasi ke kolom
kapiler karena muatannya
Mol solut yg diinjeksi
n inj =
C: konsentrasi solut
t: waktu medan listrik diaplikasikan
r: jari-jari kapiler
μep: mobilitas elektroforetik solut
μeof: mobilitas elektroosmotik
E: medan listruk yang digunakan
ҡ buf: konduktivitas bufer
7
Instrumentasi
•Panjang tabung 10-100 cm
•Diameter internal 25-75µm
•Diameter luar 200-375 µm

8
Instrumentasi
O O O O O O O O O
Si Si Si Si Si Si Si Si Si
OH OH O OH O OH OH O OH
Na Na Na

Na Cl
Cl Na
Cl
Na
Na Na Na Na
O OH O OH O OH OH O OH

O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si O

Permukaan bermuatan negatif (Si2O - atau silanol)

9
Instrumentasi
ELEKTRODA
• Platinum foil
• Daerah buffer diselubungi flexiglass

SUMBER TEGANGAN
• DC Supply 20-30 kV (tegangan tinggi)

DETEKTOR
• Pada dasarnya detektor yang semua detektor yang
digunakan. Detektor tersebut meliputi: UV, dioda array,
fluorescence, refraktif indeks, elektrokimia dan lainnya

10
Instrumentasi

11
Aliran elektroforetik
Aliran ion-ion menuju listrik yang berlawanan

V ep = kecepatan perpindahan elektroforetik (m/s)

Parameter ini tidak hanya F = gaya keseimbangan
bergantung pada jenis muatan yang µEP = perpindahan elektroforetik (m2/V/s)
dibawa tetapi juga bergantung pada ŋ = viskositas larutan
diameter dan kecepatan elektrolitnya L = panjang tabung kapiler (m)
E = medan elektrik (V/m)
V= tegangan listrik (V)

12
Aliran elektroosmotik
Perpindahan sebagian besar cairan dalam pipa kapiler dari
anoda menuju katoda karena adanya medan elektrik

Aliran elektroosmotik (EOF): terjadi karena

muatan pada dinding kapiler di atas pH 3 dalam
medan listrik

pH > 3 gugus silanol pH < 3 gugus silanol

terdeprotonasi terprotonasi

13
Aliran elektroosmotik
Bagian dalam tabung kapiler bermuatan negatif dari ionisasi gugus silanol pada silika

Dipastikan kation dalam larutan akan terikat pada dinding bermuatan negatif  lapisan listrik double layer
•Statis  dalam
•Mobil  luar

Medan listrik dialirkan kation yang mobil akan menyebabkan pergerakan cairan ke katoda.

µEOS = perpindahan elektroosmotik (m2/V/s)

V EOS = kecepatan perpindahan elektroforetik (m/s)
L = panjang tabung kapiler (m)
E = medan elektrik (V/m)
V= tegangan listrik (V)

14
Dasar pemisahan

Perhatikan:
µeof : mobilitas Elektroosmotik (EOF)
yang bertambah secara vektorial
µep: mobilitas analat atau mobilitas
elektroforetik (EMF)
µeap: mobilitas aktual= µep + µeof

15
Dasar pemisahan
Pemisahan berdasarkan rasio ukuran muatannya

 Spesi bermuatan (+) mencapai katoda

paling cepat karena EOF & EMF
arahnya sama
 Spesi netral bergerak ke katoda dengan
kecepatan ditentukan oleh aliran
elektroosmotik
 Spesi bermuatan (-) bergerak paling
lambat karena EOF & EMF berbeda
arah

16
Dasar pemisahan

17
Dasar pemisahan

18
PA R A M E T E R I D E N T I F I K A S I
Analisis kualitatif:
 Waktu migrasi (tM atau Mt)
tM = L L= panjang tabung kapiler
v tot v tot = mobilitas total (E x (ep + eof))
E = medan listrik

tM = l L L= panjang tabung kapiler

µep. V l = panjang kapiler efektif
V = Tegangan listrik

Analisis kuantitatif
 Luas daerah di bawah kurva

19
Jenis elektroforesis kapiler

Sampel yang
Jenis CE Prinsip pemisahan
diaplikasikan
Capillary zone CZE Muatan dan ukuran Ion
electrophoresis
Capillary isoelectric CIEF Isoelektric point Zwitter-ions
focussing
Micellar electrokinetic MEKC Muatan dan Ion, ion pasangan,
chromatography lipofilisitas dan spesies netral

Capillary gel CGE Ukuran (BM) Ion

electrophoresis

20
aplikasi
teknik penentuan asam amino bebas
(Mustafa, 2007; Song, 2013, dan Cui et al., 2014; )

kromatografi cair kinerja

1
tinggi (HPLC)

2 kromatografi gas (GC)

Kedua metode ini memiliki kekurangan yaitu
membutuhkan peralatan yang mahal, waktu analisis yang
panjang dan persiapan sampel yang ekstensif

3 Metode HPLC fase terbalik (RP -

HPLC)
sulit dipisahkan dari puncak pelarut

4 Capillary electrophoresis method with

U V- d e t e c t i o n f o r a n a l y s i s o f f r e e
amino acids concentrations in food
( O m a r, d k k 2 0 1 7 )
CE telah dianggap sebagai teknik
pemisahan yang kuat untuk asam
amino dan peptida dalam sampel
kompleks
 aplikasi

material elektrolit dan larutan standar Instrumentasi

- L-alinein (98%) - NBD-Cl 98%,

- L-asparagine (98%) pemisahan asam
- Etanol Larutan buffer borat amino menggunakan
- L-glutamin (99%), - asetonitril
- L-proline (99%), 100 mM (pH 8,5).dan sistem elektroforetik
- arium larutan stok NBD-Cl Beckman P / ACE MDQ
- L-serine (99%) - air ultrapurepro borat
- Lvaline (98) %) 100 mM CE dengan detektor
- natrium hidroksida PDA (475 nm)
- kentang - tepung gandum
- terong - tepung sorghum
- Buncis
 aplikasi

Ekstraksi asam amino bebas dari sampel makanan

Sampel

- Ditimbang (3,0 g)
- Dihomogenkan
- Dimasukkan dalam tabung sentrifuga
- Ditambahkan 10 mL etanol 80%
- Diguncang selama satu menit

- Dihomogenkan pada suhu kamar (1 jam)

- Disentrifugasi (4000 rpm) selama 5,0 menit

residu filtrat

-Direkonstitusi 100 mM borat buffer

- Dipindahkan ke vial kaca
pH 8.5
- Diuapkan sampai kering
- Divortex selama 1.0 menit

hasil hasil
 aplikasi

Pengoptimalan NBD-Cl asam amino standar dan asam

amino bebas dalam sampel makanan

sampel ekstrak

- Ditambahkan NBD-Cl (40 mM

- Ditambahkan 100 mM borate buffer pH 8.2.
- Dinkubasi 700C selama 60 menit
- Dihentikan oleh pendinginan dalam air es
- Disaring ke dalam botol auto sampler CE

Hasil pengamtan

24
 aplikasi
Metode Validasi

linieritas Presisi akurasi LOD LOQ

larutan standar
campuran asam sampel makanan Kurva kalibrasi
amino pada lima melakukan lima dengan konsentrasi 10 dibangun dengan
konsentrasi yang suntikan berturut- mg / L dicampur memplot area
berbeda tingkat turut 7,5 mg / L dengan asam amino puncak turunan
mulai dari 2,5 campuran asam standar yang memilki asam amino terhadap
hingga 40 mg / L amino standar konsentrasi 100 mg / L konsentrasi asam
yang diderivatisasi kemudian ditambahkan amino.
dengan NBD-Cl 9 mL etanol 80%
aplikasi
Pengaruh pH pada reaksi derivatisasi
Hasil

Gambar. 1. Elektroforogram yang diperoleh pada pH derivatisasi yang berbeda. Konsentrasi asam amino 10 mg / L. Kondisi derivatisasi:
konsentrasi NBD-Cl 30 mM, waktu reaksi 40 menit, 100 mM buffer borat, suhu reaksi 60 ºC. Puncak: proline; valin; glutamine; alanin;
asparagin; serine
 aplikasi

Hasil

Gambar 3 Pengaruh waktu

Gambar 2 Pengaruh suhu
reaksi pada derivatisasi
Fariasi suhu 50-900C
puncak tertinggi diamati
pada 700C kecuali untuk
proline pada 500C
reaksi pada derivatisasi
studi optimasi yang
dioptimalkan :pH buffer 8,5,
suhu reaksi pada 700C, waktu dalam proses
waktu reaksi selama 60 derivatisasi 10 hingga 80
menit dan konsentrasi NBD- menit puncak asam amino
Cl 40 mM. meningkat dengan
meningkatnya waktu reaksi
hingga 60 kecuali prolin

gambar 4 konsentrasi NBD-Cl

pada derivatisasi

konsentrasi NBD-Cl 10-50

mM daerah puncak turunan
asam amino meningkat
dengan meningkatnya
konsentrasi NBD-Cl hingga
40 mM
aplikasi
pH buffer pemisahan asam amino dalam sistem CE
Hasil

Gambar. 5. Pengaruh pH buffer pada pemisahan enam campuran asam amino setelah derivatisasi dengan NBD-Cl. Kondisi CE: 100
mM borat buffer dengan pH buffer berjalan berubah dari 8,5 menjadi 10; tegangan pemisahan 25 kV; sampel injeksi 10 detik di bawah
tekanan 0,5 psi; suhu kapiler diatur pada 25 ºC.
aplikasi

Penerapan metode
Hasil

Gambar 6. Electropherograms dari buncis sample (A) unspiked (B) penambhan enam asam amino campuran pada
konsentrasi 10 mg / L sebelum dan sesudah spiking
aplikasi TABEL 1 persamaan kurva kalibrasi penambahan standar, koefisien regresi, batas deteksi (LOD) dan
batas kuantifikasi (LOQ) untuk asam amino.

Hasil

TABEL 2 Recovery (n = 3) untuk penentuan asam amino dalam sampel makanan

aplikasi

Hasil
TABEL 4. Konsentrasi asparagin dalam bahan baku makanan dan akrilamida dalam produk
makanan