ELEKTROFORESIS KAPILER

Capillary Electrophoresis (CE)

apt. Refsya Azanti Putri, M.S.Farm

ELEKTROFORESIS??
Collected DNA samples of hair, blood, or skin
DNA Profiling & Fingerprinting
from the crime scene to identify the suspect
by looking at the unique pattern in the DNA
analysis.
How does the DNA Profiling Works?
 DEFINITION

Electrophoresis
Is a separation method based on
the different rate of migration of
charged species in an applied
electric field
 TYPES OF MOLECULES THAT CAN BE SEPARATED

• Inorganic anions & cations

• Amino acids
• Drugs
• Vitamins
• Proteins (enzymes, hormones &
antibodies)
• Nucleic acids (DNA & RNA)
• Nucleotides
 ADVANTAGES DISADVANTAGES
• Offers new selectivity, an alternative • Cannot do preparative scale
to HPLC separation
• Easy and predictable selectivity • Species that are difficult to dissolve
• High separation efficiency (105 to 106
theoretical plates)
• Small sample sizes (0,1 – 10 nl)
• Fast separation (1 to 45 min)
• Can be automated
• Quantitation (linear)
• Easily coupled to MS
 KONSEP

• Digunakan (kebanyakan) untuk pemisahan molekul bermuatan

• Didasarkan atas perbedaan pada:
• Pergerakan/migrasi molekul di dalam larutan (eletrolit
pembawa atau buffer)
• Dibawah pengaruh medan listrik
• Tidak ada kesetimbangan partisi antara fase gerak dan fase diam
• Bukan metode kromatografi
• Hasil yang diperoleh disebut “elektroferogram”
INSTRUMENTATION
How does the Capillary
Electrophoresis work?
MECHANISMS

Electroosmotic Flow (EOF)

Movement/Direction of the bulk solution

Electrophoretic mobility
Separation of charged species
MECHANISMS

Electroosmotic Flow (EOF)

Is the movement of the separation buffer
through the silica capillary as a result of the
existence of a zeta potential at the
solvent/silica interface.
Keuntungan penggunaan kapiler:
• Menghindari efek pemanasan akibat arus
listrik
• Resistensi listrik yang tinggi dari kapiler
memungkinkan penggunaan medan listrik
yang sangat tinggi (100-500 V/cm)
• Perbandungan yang besar dari luas
permukaan terhadap volume kapiler dapat
dengan efisien mendissipasi panas yang
dihasilkan
• Penggunaan medan listrik yang besar
menghasilkan waktu analisis yang singkat
dengan efisiensi dan resolusi pemisahan yang
tinggi
Pengaruh pH pada EOF

• The inside wall of the capillary is covered

by silanol groups (SiOH) that are fully
protonated (SiO-) at pH < 3
• Partially deprotonated at pH > 3
• Fully deprotonated at pH > 9
 Pengaruh pH pada EOF
• Pada pH > 7 permukaan silika
bermuatan negatif

• Sebagian Kation dari larutan

buffer terikat ke permukaan
silika bermuatan negatif →
Fixed layer

• Sehingga masih dapat

menarik kation dari larutan
buffer → Diffuse layer
 Electroosmotic Flow

Electroosmotic Flow (EOF)

• Excess cations in the diffuse • EOF can be reversed by chemically binding compound
layer flow towards the catode carrying a positive charge to the silica surface
Electroosmotic Flow

Electroosmotic Flow (EOF)

Electroosmotic Flow
Electroosmotic Flow

Besarnya ζ ditentukan oleh muatan

pada permukaan kapiler. Muatan ini
Besarnya EOF dapat dinyatakan sebagai
bergantung pada pH → besarnya EOF
kecepatan (VEOF) atau mobilitas (µEOF)
bervariasi tergantung pada pH

VEOF = (ɛ ζ η) E VEOF = kecepatan EOF

atau µEOF = mobilitas EOF
µEOF = (ɛ ζ η) ζ = potensial zeta
ɛ = tetapan dielektrik
η = viskositas larutan
Cara mengontrol Kecepatan EOF
How do we separate anions, cations,
and neutral species in capillary
electrophoresis?
2nd MECHANISMS

Electrophoretic mobility (µep)

Is the separation of charged species based on
the equation that we have already learned.
 KONSEP
Pemisahan dengan elektroforesis didasarkan atas perbedaan kecepatan
komponen dalam suatu medan listrik.
Besarnya kecepatan suatu ion (ion velocity) dapat dituliskan sebagai:
V = µep . E ……………….. (1)
Dimana:
V = kecepatan ion
µep = mobilitas elektroforetik
E = medan listrik yang ditetapkan
Medan listrik (E) merupakan fungsi dari tegangan listrik dan Panjang kapiler (V/cm)
Mobilitas eletroforetik (µe), untuk ion dan medium tertentu, konstan dan khas
untuk masing-masing ion
 KONSEP
Mobilitas ion ditentukan oleh gaya listrik yang dialami molekul
dibandingkan dengan friksi (gesekan) dengan medium.

𝑮𝒂𝒚𝒂 𝒍𝒊𝒔𝒕𝒓𝒊𝒌 (𝑭𝑬)

µe = ………………………. (2) Dimana:
𝑮𝒂𝒚𝒂 𝒈𝒆𝒔𝒆𝒌 (𝑭𝑭)
q = muatan ion
FE = q.E ………………………………………..(3) η = viskositas larutan
dan r = jari-jari ion
v = kecepatan ion
FF = 6πηrv …………………………………. (4)
 KONSEP
Selama proses elektroforesis terjadi kesetimbangan antara kedua gaya
(FE dan FF) sehingga,
q E = 6πηrv ………………………. (5)
Persamaan (7) menunjukkan
bahwa spesi berukuran kecil 𝒒𝑬
V= ………………. (6)
dengan muatan yang besar 6πηr
akan memiliki mobilitas
𝑽 𝒒𝑬 𝒒𝑬 𝟏 𝒒
elektroforetik yang besar µep = = :E= x =
𝑬 6πηr 6πηr 𝑬 6πηr
𝒒
µep = ……. (7)
6πηr Keterangan:
q = muatan ion
η = viskositas larutan
r = jari-jari ion
V = kecepatan migrasi ion
µep =mobilitas elektroforetik
 Ionic charge Fractional retarding force Stokes radius
Is the radius of a hard
sphere that diffuses at
the same rate as that
++ + solute

+ -

n n

- -

-- +

Depend on:
Size, shape, and viscocity
medium
Sample Introduction
Techniques in CE
 Hydrodynamic Injection
Used a pressure or vacuum
difference between the two ends
of the capillary

Electrokinetic Injection
Used a voltage difference
between the two ends of the
capillary
Electropherogram &
Detection method in CE
How do extract information out of an
electropherogram of CE?
The Electropherogram
 Migration time (tm)
Time it takes for solute to migrate
from the point of introduction to
the detector

How do we find the migration rate, Vtotal of a solute?

What are the factors that may affect the migration time, tm?

Length of the capillary Voltage applied

 Example Calculation
A certain solution in a capillary has an electroosmotic mobility of 1.3 x 10-8 m2/Vs at pH 2
and 8.1x 10-8 m2/Vs at pH 12. How long will it take a neutral solute to travel 52 cm from
the injector to the detector with 27 kV applied across the 62 cm long tube?

At pH 2

At pH 12
 Detector

• Detector are placed at the cathode

since under common conditions,
all species are driven in this
direction by EOF
• Detectors similar to those under in
LC, typically UV absorption,
fluorescence, and MS.
: sensitive detectors are needed
for small concentrations in CE.
• The general layout of an
electropherogram.
Detector

• Laser-induced fluorescence) is a very popular CE detector with

better sensitivity
• Direct absorbance (UV-Vis detector) can be used for organics
• Indirect absorbance methods is commonly used for inorganic
solute, where adding ionic chromphore (eg. Chromate) in the
electrophoresis buffer
• Mass spectrometry can also be used for detection
Qualitative and Quantitative Analysis

Sequantial spiking method : perform the second

measurement by adding one of the predicted solutes
into the buffer solution → greated peak area
Other CE separation
principles
Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

Also known as free-solution CE

(FSCE), is the simplest form of CE.

The separation mechanism is based

on differences in the charge and
ionic radius of the analytes

The separation relies principally on

the pH controlled dissociation of
acidic groups on the solute or the
protonation of basic functions on the
solute.
 Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
Is the adaptation of traditional gel electrophoresis into the capillary using
polymers in solution to create a molecular sieve also known as replacable
physical gel.

The separation mechanism is based

on the size of gel in CGE

This technique is commonly

employed in protein analysis, DNA
sequencing, and genotyping.
Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
• Merupakan metode elektroforesis beresolusi tinggi yang digunakan untuk
pemisahan protein berdasarkan titik isoelektrik.
• Titik isoelektrik adalah saat pH asam amino berada pada bentuk amfoter
(zwitter ion), dimana kelarutan protein menurun, dan akan mengendap. Pada
saat titik isoelektrik jumlah kation dan anion yang terbentuk jumlahnya sama.
• Pada CIEF, suatu gradien pH dalam kapiler dihasilkan dengan menggunakan
amfolit (molekul yang memiliki gugus asam dan basa/zwitter ion).
• Setelah kapiler diisi dengan campuran analit dan amfolit, terbentuk gradien
pH dalam kapiler
• Larutan bersifat basa pada katoda dan larutan asam pada anoda
 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)

• Pada saat diberi medan listrik, protein

dan amfolit bermuatan akan bermigrasi
hingga mencapai daerah (zona) dimana
keduanya menjadi netral (pada PI) →
disebut focusing
• Proses focusing ditandai dengan arus
listrik yang terjadi dan selesainya proses
ini menyebabkan tidak adanya lagi arus
yang mengalir. Migrasi protein pada suatu gradien pH
• Selanjutnya, zona-zona analit yang telah hingga mencapai nilai pI (isoelektrik)
terpisah dimobilisasi ke detector
dengan memberikan tekanan didalam
kapiler
PUSTAKA
TERIMA KASIH