9221- MULTIPLE-TUBE

FERMENTATION TECHNIQUE
FOR MEMBERS OF THE
COLIFORM GROUP
RUSMADI EKO PRIYONO
 9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

1. Sampel
Kumpulkan sampel seperti yang diarahkan pada Bagian 9060A,
menggunakan sampel wadah yang ditentukan dalam Bagian 9030B.19. Ikuti
pedoman QC untuk botol sampel yang dijelaskan dalam Bagian 9020B.5d.
Memastikan bahwa sampel memenuhi kriteria penerimaan laboratorium pada
saat diterima.
2. Kontrol Kualitas
Semua fase teknis fermentasi (9221B–G) membutuhkan kepatuhan terhadap
pedoman jaminan kualitas/kontrol kualitas (QA/QC) yang disajikan di Bagian
9020, termasuk, namun tidak terbatas pada,
QC analitik (Bagian 9020B.9), instrumentasi/peralatan (Bagian 9020B.4 dan
9030B), dan perlengkapan (Bagian 9020B.5). Mengacu pada Tabel 9020:I
untuk prosedur QC utama. Juga, perhatikan bagian-bagian yang
berhubungan dengan penyimpanan dan penyiapan media biakan dehidrasi
 CATATAN
Bagian 9060A Pengumpulan Sampel:
a. Wadah: bersih, steril, mulut luas, botol gelas kaca atau plastic atau katong plastic steril untuk uji
mikrobiologi; tutup botol tidak bocor dan nontoksik dan dapat disterilisasi ulang; untuk analisis
lumpur botol steril mulut lebar disposibel/sekali pakai
b. Deklorinasi: untuk menetralkan air yang mengandung klorin atau senyawa halogen lainnya.
Natrium Thiosulfat (Na2S2O3) adalah senyawa penetral senyawa halogen dan untuk
menghambat sifat bakteriosida selama transportasi sampel
c. Prosedur Sampling: Teknik pengumpulan sampel dilakukan untuk menjaga intergitas sampel.
Penanganan sampel yang tidak sesuai berakibat hasil analisis sampel di lab tidak valid.
d. Volume sampel: - minimum 100 mL utnuk sampel air potable, permukaan, rekreasi dan limbah;
- minimum 10 L untuk Cryptosporodium & Giardia dalam air mentah: - untuk air siap pakai
(finished water) sedikitnya 50-100 mL tergantung tipe filter nya; - volume lebih besar untuk
analisis bakteri pathogen, protozoa dan virus
Bagian 9030B.19 Botol sampel: botol dari logam, kaca dan plastic dengan ukuran sedikitnya 1
Inchi, mulut lebar, bisa disterilisasi ulang dan tutup tidak toksik (tutup ulir)
Bagian 9020B.5d, Botol sampel: mulut luas, pakai ulang, nonreaktif, gelas borosilat atau botol plastik dengan
tutup ulir dapat diautoklaf, dilapisi atau tidak bagian tutupnya.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Gunakan media dehidrasi komersial bila memungkinkan, dan

pastikan bahwa formulasi mereka cocok dengan yang ditentukan di
sini karena formulasi komersial dapat bervariasi. Media fermentasi
yang sudah disiapkan bisa disimpan dalam tabung atau botol yang
tertutup rapat hingga 3 bulan dalam kondisi gelap, jika suhu antara
1ºC dan 30°C dan penguapan kurang dari 10% volume aslinya.
Jika tabung itu didinginkan setelah sterilisasi, harus diinkubasi pada
semalam (16-24 jam) pada suhu kamar (20°C) sebelum digunakan
dan yang menunjukkan pertumbuhan atau gelembung harus
dibuang untuk menghindari hasil positif palsu.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Untuk menunjukkan kinerja media yang dapat diterima, kontrol biakan

positif dan negatif harus diuji terlebih dahulu sebelum digunakan dan
ditentukan lain (lihat Tabel 9020:VI). Sterilitas, volume per tabung, dan pH
juga harus diverifikasi dan dicatat.
Untuk menunjukkan keterbandingan antara batch media, lakukan uji
penggunaan [Bagian 9020B.5f2].
Jika laboratorium beralih ke uji fermentasi Teknik tabung ganda, analis
idealnya pertama-tama harus melakukan uji paralel dengan metode
sebelumnya untuk menunjukkan keterapan (aplikabilitas) dan
komparabilitasnya. Hasil dari banyak studi kinerja coliform adalah tersedia
dalam literatur, dan tingkat hasil positif palsu dan hasil negatif dapat
berbeda di antara berbagai media. Pengguna harus hati-hati memilih
media dan prosedur yang paling sesuai dengan kebutuhan mereka.
 Tabel 9020:VI. Biakan kontrol yang disarankan untuk Uji
Mikrobiologi
Biakan kontrol Ket:
Kelompok 1 = tidak fermentasi
Positif Negatif Laktosa
Coliform Total Escherichia coli Staphylococcus aureus 1 2 = fermentasi Laktosa
Enterobacter aerogenes 2 Proteus vulgaris 3 tetapi tidak termotoleran
khusus
Klebsiella pneumoniae (ATCC Pseudomonas aeruginosa 1 3 = tidak fermentasi
4352) 4
Laktosa,, gunakan
Coliform E. coli E. aerogenes Laktosa terhidrilisa,
Termotoleran menunjukkan
K. pneumoniae mediumnya overcooked
(termotoleran) 4 = fermentasi Laktosa,
tetapi tidak
Escherichia coli E. coli (strain positif MUG) E. aerogenes menghidrolisa MUG
K. pneumoniae (termotoleran) ** = sensiti thd media
Enterococci # Enterococcus faecalis S. aureus ** asam Nalikdik Natrium
ϯ ϯ = sensitif thd media
Enterococcus faecium E. coli ϯ ϯ Natrium azida
 Bagian 9020B.5f2: Uji penggunaan evaluasi air reagen

Sebelum menggunakan sumber reagen-air baru, analis harus

membandingkan dengannya setara dengan lot yang sedang
digunakan(reference lot)
Catatan: Apabila tidak mungkin membandingkan sumber reagen-air
karena sistem sebelumnya mungkin tidak lagi tersedia.
Bila dilakukan maka dihitung dengan Student t test
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar
3. Fase Dugaan
Gunakan Lauryl Tryptose Broth pada uji fase tabung ganda ( multiple-tube)
ini, mengikuti pedoman QC dikutip dalam 9221B.2.
Reagen dan Media Biakan:
Lauryl Tryptose Broth (LTB) :
Tryptose.................................. ……………. 20.0 g
Lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.0 g
Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4). . ……2.75 g
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4). ........ 2.75 g
Sodium chloride (NaCl). . . . …………….. . . ……… 5.0 g
Sodium lauryl sulfate ………………………………… 0.1 g
Reagent-grade water (akuades) …………………….. 1 L
Tabel 9221: I. Preparasi Lauryl Tryptose Broth
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Tambahkan media dehydrasi dengan air (akuades), aduk

merata, dan panaskan sampai terlarut. Sebelum sterilisasi,
bagikan media kedalam tabung fermentasi yang
mengandung inverted vial (tabung Durham), untuk
mengcover tabung Durham sedikitnya setengah sampai
2/3 setelah sterilisasi. Sebagai alternatif, tanpa tabung
Durham dengan penambahan 0.01 g/L bromocresol
purple (BCP) ke dalam LTB (untuk menentukan produksi
asam, sebagai indikator hasil positif dari uji coliform). Tutup
tabung dengan tutup logam, atau plastik tahan panas.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Persiapkan sesuai dengan Tabel 9221:I, membuat LTB cukup

konsentrasinya dengan menambahkan 100-, 20-, atau 10-mL
porsi sampel ke media dengan tidak akan mengurangi
Konsentrasi bahan di bawah media standar. Autoklaf media
pada 121 ° C selama 12 hingga 15 menit.
Pastikan vial terbalik, jika digunakan, bebas dari gelembung
udara.
pH media LTB harus 6,8 ± 0,2 setelah sterilisasi.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

b. Prosedur:
1) Susun tabung fermentasi dalam barisan masing-masing lima atau sepuluh
tabung dalam rak tabung reaksi. Jumlah baris dan volume sampel dipilih
tergantung pada kualitas dan karakter air yang akan ditampung diperiksa.
Untuk air minum, 100 mL harus diuji. Gunakan lima porsi 20 mL, sepuluh
porsi 10 mL, atau satu porsi 100 mL (botol tunggal). Untuk air yang tidak
dapat diminum (nonpotable), gunakan lima tabung per pengenceran (10,
1, 0.1 mL, dst)
Saat membuat pengenceran dan mengukur volume sampel yang
diencerkan, ikuti tindakan penjelasan yang diberikan di Bagian 9215B.2.
Gunakan Gambar 9215:1 sebagai panduan menyiapkan pengenceran.
CATATAN
Bagian 9215B.2. Cara pngenceran sampel dengan metode cawan tuang untuk dpt (30-300)cfu
Gambar 9215:1 Panduan menyiapkan pengenceran.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Kocok sampel dan pengenceran 5 detik (sekitar 25 kali) dengan

kuat . Inokulasi setiap tabung dalam satu set lima dengan
ulangan volume sampel meningkat pengenceran desimal, jika
jumlah desimal sampel digunakan.
Campur bagian uji dalam media dengan agitasi lembut
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Prosedur:....

2) Segera inkubasi tabung atau botol yang telah diinokulasi,

kontrol biakan apapun, dan/atau blanko sterilitas pada suhu
35 ± 0,5°C. Setelah 24 ± 2 jam, putar setiap tabung atau
botol dengan lembut dan periksa apakah ada pertumbuhan,
gas, dan/atau reaksi asam (warna kuning) dan, jika terbukti
tidak ada gas atau reaksi asam, inkubasi kembali dan periksa
kembali pada akhirnya dari 48 ±3 jam. Catat ada tidaknya
pertumbuhan, gas, dan/atau produksi asam. Jika tabung
Durham dihilangkan, pertumbuhan dengan keasaman (warna
kuning) menandakan reaksi dugaan-positif
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

c. Interpretasi:
Deteksi reaksi asam (warna kuning) dan/atau gas dalam
tabung atau botol dalam waktu 48 ± 3 jam merupakan reaksi
dugaan-positif. Kirim tabung atau botol dengan reaksi
dugaan-positif ke Fase Konfirmasi (9221B.4).
Tidak adanya reaksi asam dan/atau pembentukan gas pada
akhirnya dari 48 ± 3 jam inkubasi merupakan uji negatif.
Kirim sampel air minum menunjukkan pertumbuhan tanpa
gas positif atau reaksi asam ke Fase Konfirmasi
(9221B.4).
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

4. Fase Konfirmasi
Media biakan:
Gunakan tabung fermentasi media BGLB untuk fase konfirmasi,
mengikuti pedoman QC yang dikutip dalam 9221B.2.(Bahan & Media
Biakan)
Brilliant Green Lactose Bile Broth:
Pepton ..................................................10,0 g
Laktosa..................................................10,0 g
Oxgall ................................................... 20,0 g
Hijau cemerlang ................................... 0,0133 g
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar
Tambahkan bahan dehidrasi ke dalam air, aduk rata, dan panaskan sampai larut.
Sebelum sterilisasi, bagikan media BGLB ke dalam tabung fermentasi dengan vial
terbalik (tabung Durham), pastikan volume media cukup untuk menutupi tabung
Durham setidaknya setengah sampai dua pertiga setelah sterilisasi. Tutup tabung
dengan penutup logam atau plastik tahan panas. Media di autoklaf pada 121 ° C
selama 12 hingga 15 menit. Pastikan bahwa tabung Durham bebas dari gelembung
udara. pH media seharusnya 7.2 ± 0.2 setelah sterilisasi.
b. Prosedur :
Segera semua tabung atau botol dugaan yang menunjukkan pertumbuhan, dengan
sejumlah gas, atau reaksi asam dalam waktu 24 ± 2 jam inkubasi dilanjutkan ke
Fase Konfirmasi. Jika tabung atau botol dugaan tambahan menunjukkan
fermentasi aktif atau reaksi asam pada akhir masa inkubasi 48 ± 3 jam, segera
lanjutkan ini ke tahap konfirmasi. Untuk mengkonfirmasi koloni coliform dugaan
yang tumbuh pada media padat menggunakan media fermentasi, lihat Bagian
9222B.4g. (Verifikasi Coliform)
 Bagian 9222B.4g. (Verifikasi Coliform)
Verifikasi Coliform: Kadang-kadang pada media tipe Endo, mikroba non- coliform
dapat menghasilkan koloni kilap yang khas, dan koloni atipikal (berwarna merah
muda, merah tua, atau koloni berinti tanpa, kemilau) mungkin coliform; sehingga
verifikasi semua jenis koloni tipikal dan
atipikal dianjurkan. Verifikasi semua koloni aktif pada media Endo dengan cara
mengusap seluruh membran atau mencuplik minimal lima koloni khas dan lima
koloni atipikal dari yang diberikan biakan filter membran. (Lihat Bagian 9020B.9.)
Berdasarkan kebutuhan dan jenis sampel, laboratorium dapat memasukkan lebih
ketat. Tindakan QC (misalnya, untuk sampel yang tidak dapat diminum, verifikasi
setidaknya satu koloni dari masing-masing tipe koloni tipikal atau atipikal dari
yang diberikan baiakn filter membran, atau verifikasi 10% sampel positif).
Sesuaikan hitungan berdasarkan hasil verifikasi. Verifikasi dilakukan dengan
fermentasi laktosa (EC-ECMUG Broth); untuk Coliform alternatif dengan Rapid
test dan sistem multi-test komersiel
b. prosedur ........
Goyangkan atau putar tabung atau botol dugaan secara perlahan untuk
menunjukkan pertumbuhan gas atau asam untuk meresuspensi organisme.
Dengan loop steril berdiameter 3,0 hingga 3,5 mm, transfer biakan satu atau
lebih loop penuh ke tabung fermentasi yang berisi media BGLB.
Sebagai alternatif, masukkan aplikator kayu yang steril setidaknya 2,5 cm
ke dalam biakan, segera keluarkan, dan masukkan aplikator ke dasar
tabung fermentasi yang berisi media BGLB. Angkat dan buang aplikator.
Ulangi untuk semua tabung dugaan-positif setidaknya.
Analis dapat secara bersamaan menginokulasi media BGLB dengan
koliform total dan media EC Broth untuk coliform termotoleran (tinja) (lihat
9221E) atau media EC-MUG Broth untuk Escherichia coli (lihat 9221F).
Namun, jika menggunakan loop yang sama atau batang aplikator kayu
untuk menginokulasi biakan ke dalam lebih dari satu media, inokulasi
terakhir pada media yang paling menghambat (BGLB).
 9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar
Segera inkubasi tabung media BGLB yang telah diinokulasi pada suhu
35°±0,5°C. Sejumlah gas yang terbentuk dalam tabung Durham dari Tabung
fermentasi media BGLB setiap saat dalam waktu 48 ± 3 jam merupakan fase
terkonfirmasi positif. Untuk memperkirakan densitas coliform, hitung nilai MPN
dari bilangan Tabung BGLB positif seperti yang dijelaskan dalam 9221C.
c. Prosedur alternatif:
Gunakan alternatif ini hanya untuk air tercemar atau air limbah diketahui
memberilkan hasil yang positif secara konsisten.
Jika semua tabung dugaan positif dalam dua atau lebih pengenceran berturut-
turut dalam waktu 24 jam, kemudian dilanjutkan hanya kepada fase tabung
pengenceran tertinggi (inokulum sampel terkecil) dalam semua tabung positif,
bersama dengan tabung positif lainnya dari pengenceran yang lebih tinggi.
Lanjutkan semua tabung Fase Konfirmasi yang mana menunjukkan gas atau
pertumbuhan asam diproduksi dalam 24 sampai 48 jam.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

5. Fase Pelengkap
Uji pelengkap seperti yang dijelaskan di sini tidak
diperlukan untuk analisis sampel air minum. Untuk
sampel air yang tidak dapat diminum yang dikumpulkan
berdasarkan Clean Water Act, persyaratannya bahwa
10% dari semua tabung total-coliform-positif dilakukan
uji pelengkap pada berbasis musiman lama tidak ada
lagi.
Uji pelengkap ini sebagai rekomendasi QC dan dilakukan
saat hasil ujinya tidak menentu/meragukan.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Sebagai pengujian tambahan untuk coliform termotoleran

(tinja) dan/atau E. coli diperlukan uji coliform positif,
pengujian lebih lanjut menggunakan media EC dan/atau
EC-MUG Broth dianggap sebagai uji pelengkap.
Untuk tujuan QC, jika tidak ada sampel air minum positif
yang diterima dalam kuartal, kemudian analisis
setidaknya satu sampel sumber air positif untuk
konfirmasi bahwa media merespons dengan tepat.
9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Untuk memverifikasi keberadaan bakteri coliform dan untuk

memberikan data QC untuk analisis sampel air yang tidak dapat
diminum, gunakan uji pelengkap pada setidaknya satu sampel
positif per kuartal. Jika tidak sampel positif terjadi dalam satu
kuartal, lakukan pemeriksaan QC menggunakan sampel positif
yang diketahui.
Analis dapat secara bersamaan menginokulasi media dugaan-positif ke
dalam media BGLB untuk konfirmasi coliform total dan media ECBuntuk
coliform termotoleran (fekal) (9221E) atau media EC-MUGB untuk
Escherichia coli (9221F) sepanjang media BGLB diinokuasi terakhir.
 9221 B. Teknik Fermentasi Koliform Total Standar

Hasil Positif dihasilkan dari inkubasi dalam media EC dan/atau EC-MUGB pada
peningkatan suhu (44,5°± 0,2°C) dapat dianggap sebagai uji pelengkap.
Biakan media BGLB positif paralel dengan biakan media EC atau EC-MUGB
negatif menunjukkan adanya coliform k nonfecal. Tabung EC atau EC-MUG
positif paralel dan biakan negatif pada media BGLB menunjukkan adanya
masing-masing coliform atau E. coli termotoleran (tinja). Alternatifnya, uji
pelengkap untuk total coliform positif dapat dilakukan sebagai berikut.
a. Media Biakan dan Reagen: Ikuti pedoman QC dikutip dalam 9221B.2.
1) LES Endo Agar—Lihat Bagian 9222B.2a. Gunakan cawan Petri100-
x 15 mm.
2) MacConkey Agar:
Pepton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17g
Proteosa pepton .............................. ................ 3 g
Laktosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10g
 6. Bibliography
• HUCKER, G.J. & H.J. CONN. 1927. Further Studies on the
Methods of Gram Staining; Tech. Bull. No. 128. N.Y. State
Agricultural Experiment Station, Geneva, N.Y.
• COWLES, P.B. 1939. A modifified fermentation tube. J.
Bacteriol. 38:677.
• SKERMAN, V.B.D. 1967. A Guide to the Identifification of the
Genera of Bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
• EVANS, T.M., C.E. WAARVICK, R.J. SEIDLER & M.W.
LECHEVALLIER. 1981. Failure of the most-probable-number
technique to detect coliforms in drinking water and raw water
supplies. Appl. Environ. Microbiol. 41:130.
• GERHARDS, P., ed. 1981. Manual of Methods for General
Bacteriology. American Soc. Microbiology, Washington, D.C.
• U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY.
2000. National primary drinking water regulations. 40
CFR Parts 141, and 142; Fed. Reg. 65(8):1950.
• GARRITY, G.M., ed. 2005. Part B: The
gammaproteobacteria. In Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology, 2nd ed.; Volume 2: The Pro
• teobacteria. Springer, New York, N.Y.
• U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY.
2005. Manual for the Certification of Laboratories
Analyzing Drinking Water; EPA 815-R- 05-004. Off.
Ground Water and Drinking Water Tech. Support
Ctr.,
• Cincinnati, Ohio.
• U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY.
2012. Guidelines for Establishing Test Procedures
for the Analysis of Pollutants Under the Clean Water
Act; Analysis and Sampling Procedures: Final Rule.
40 CFR Parts 136, 260, et al.; Fed. Reg.
77(97):29797
 SKEMA CONTOH UJI MPN KOLIFORM (5 TABUNG)

Sampel Air Media BGLB

Penambahan
Sampel Air ke
Lauryl Tryptose
Broth (LTB)
LTB

27° C, 24 jam
4 2
Fase/Uji
Konfirmasi

Fase/Uji Dugaan/Presumptive
 Hasil Uji Konfirmasi: 4 - 2 - 0
dengan merujuk ke Tabel MPN % tabung
Hasilnya = 22 MPN/100 mL

Tabel 9221:V. Contoh memilih 3 kombinasi

hasil positif dari 5 pengenceran

Tabel MPN untuk 5 Tabung (10 mL, 1 mL, 0,1 mL)

VALIDASI - VERIFIKASI
(9020B.10 - 9020B.11)
 VERIFIKASI (9020B.10)
Verifikasi adalah proses umum yang digunakan untuk menentukan apakah
metode dan analis sama-sama berkinerja seperti yang diharapkan memberi-
kan data yang andal (yaitu, menentukan tingkat positif palsu dan negatif
palsu). Jika persentase verifikasi untuk pasokan air tertentu atau matriks
rendah, diperlukan pelatihan, baik metode pengujian lain atau lebih.
Sebagian besar, prosedur konfirmasi/verifikasi untuk air minum berbeda dari
yang lain perairan karena persyaratan peraturan khusus. Mikroba sering
didefinisikan melalui metode atau operasi, bukan taksonomi.
Positif palsu terjadi ketika sumur positif, tabung fermentasi, atau koloni
dihitung sebagai bakteri target ditransfer ke media konfirmasi dan hasilnya
negatif.
Negatif palsu adalah ditentukan ketika koloni atipikal atau media dari sumur
negatif atau tabung fermentasi memberikan hasil konfirmasi positif.
 VERIFIKASI (9020B.10)

Ringkasan singkatnya; informasi lebih lanjut mungkin ditemukan dalam diskusi yang sesuai dari
mikroba tertentu atau kelompok mikroba.
a. Metode fermentasi tabung ganda (MTF):
1) Prosedur Coliform Total (Bagian 9221B)
a) Air minum—Lakukan pengujian hanya sampai Fase Konfirmasi. Uji pelengkap tidak diperlukan.
Jika hasil positif biasanya tidak terjadi dalam seperempat (kuartal), lakukan analisis setidaknya
satu sampel air sumber positif untuk mengonfirmasi media tersebut, prosedur laboratorium, dan
peralatan menghasilkan respons yang sesuai (untuk tujuan QC dan pemeliharaan keahlian
analis). Untuk sampel dengan riwayat susah pertumbuhanya dan tanpa gas dalam tabung pada
Fase Dugaan, lanjutkan uji tabung melaluinya Fase Konfirmasi untuk memeriksa respons bakteri
koliform negatif palsu. Lakukan verifikasi utnuk setiap coliform termotoleran (tinja) atau E. coli
yang positif
b) Jenis air lainnya—Verifikasi dapat dicapai dengan melakukan Fase Pelengkap pada frekuensi yang
ditetapkan oleh laboratorium (mis., 10% sampel positif, satu sampel per pengujian berjalan, atau
persentase tertentu dari beban kerja laboratorium normal). Untuk laboratorium besar
menganalisis sejumlah besar sampel setiap hari, 10% sampel positif mungkin menjadi beban yang
tidak perlu; pilih persentase yang lebih rendah yang sesuai.
VERIFIKASI ANGKA PALING MUNGKIN
KOLIFORM PADA AIR MINUM
 MEDIA DAN MIKROBA BAKU

1. Media
Media pengencer : Pepton Salt
Solution (PSS), Peptone
Water, BPW
Media uji penduga :
Lauryl Tryptose Broth (LTB)
Media uji penegasan :
Brilliant Green Lactose Bile 2 %
Broth (BGLB)
2. Mikroba Baku
Bakteri target: Escherichia coli (ATCC 25922)
 PERLAKUAN SAMPEL

1. Sampel Negatif: Sampel tanpa tambahan apapun (konsentrasi 0 koloni/mL).

2. Sampel Positif: Sampel ditambah inokulum suspensi bakteri target

Masing-masing kelompok dikerjakan sebanyak 10 x ulangan

 UJI PENDAHULUAN
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

9 mL
pengencer

Suspensi 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

bakteri E.coli
1 McFarland/
BHIB 5 mL
PCA
estimasi populasi
9 x 107 cfu/mL

9000 cfu 900 cfu 90 cfu 9 cfu

 CARA MEMBERIKAN CEMARAN
Penimbangan sampel : @ 10 g atau 25 g untuk masing-masing ulangan sampel
negatif dan sampel positif

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

9 mL
pengencer

E.coli 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Dalam @ 1 mL
BHIB
est. 9 x 107 cfu/mL est. 9 x 10 cfu --> Sampel positif
 Jumlah presumptive

+ -

Terkonfirmasi + a b a+b

Terkonfirmasi - c d c+d

a+c b+d n

Keterangan :
a = Jumlah presumptive positif terkonfirmasi positif
b = Jumlah presumptive negative terkonfirmasi positif
c = Jumlah presumptive positif terkonfirmasi negative
d = Jumlah presumptive negative terkonfirmasi negative
n = Jumlah keseluruhan uji
 Jumlah presumptive
Konfirmasi Total
Positif Negatif
Positif 90 0 90
Negatif 0 60 60
Total 90 60 150

DATA 1:
% Sensitivitas = a/(a+b) x 100% = 90/90 x 100% = 100 %

% Spesifisitas = d/(c+d) x 100% = 60/60 x 100% = 100 %

% Tingkat positif palsu = c/(a+c) x 100% = 0/90 x 100% = 0 %

% Tingkat negatif palsu = b/(b+d) x 100% = 0/60 x 100% = 0 %

Presisi : % RSD 10 x ulangan

Akurasi : % konsentrasi spiking dengan hasil aktualnya
 CONTOH: HASIL VERIFIKASI METODE 5 TABUNG
(PER 100 ML SAMPEL AIR)(data 1)
ULANGAN 10 mL 1 mL 0,1 mL Tabung Positif Nilai MPN
1 5 2 2 9 70
2 5 2 1 8 94
3 5 2 3 10 120
4 5 3 1 9 110
5 5 3 2 10 140
6 5 2 2 9 94
7 5 3 1 9 110
8 5 3 1 9 110
9 5 3 0 8 79
10 5 4 0 9 130
50 27 13 90
 Jumlah presumptive
Konfirmasi Total
Positif Negatif
Positif 93 0 93
Negatif 0 57 57
Total 93 57 150

DATA 2:
% Sensitivitas = a/(a+b) x 100% = 93/93 x 100% = 100 %

% Spesifisitas = d/(c+d) x 100% = 57/57 x 100% = 100 %

% Tingkat positif palsu = c/(a+c) x 100% = 0/93 x 100% = 0 %

% Tingkat negatif palsu = b/(b+d) x 100% = 0/57 x 100% = 0 %

Presisi : % RSD 10 x ulangan

Akurasi : % konsentrasi spiking dengan hasil aktualnya
 CONTOH: HASIL VERIFIKASI METODE 5 TABUNG
(PER 100 ML SAMPEL AIR)(data 2)

ULANGAN 10 mL 1 mL 0,1 mL Tabung Positif Nilai MPN

1 5 2 2 9 94
2 5 2 2 9 94
3 5 2 3 10 120
4 5 3 2 10 140
5 5 3 1 9 110
6 5 2 2 9 94
7 5 3 2 10 140
8 5 3 0 8 79
9 5 3 1 9 110
10 5 4 1 10 170
50 27 16 93
 Terima kasih
ada pertanyaan atau pernyataan ?
INFORMASI TAMBAHAN
Validasi/verifikasi metode uji mikrobiologi secara kuantitatif
(ISO 16140)