Laporan Praktikum

Struktur dan Fungsi Subseluler

Hari/Tanggal
Waktu
PJP
Asisten

: Senin/ 3 Mei 2010

: 08.00 11.00 WIB
: Ramdan Hidayat, M.Si.
: Sapto Guntoro
Akmal
Resti Siti M
Amelinda Irena

FRAKSINASI SUBSELULAR
Kelompok 10
Dewi Eriyanti
Wira Dharma
Nadia Adi Pratiwi

G84080073
G84080074
G84080035

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

Pendahuluan
Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau
bagian-bagian tertentu. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot,
massa jenis dari tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar biasa
disebut Pelet sedangkan fraksi yang lebih ringan akan berada dibagian diatas yang
biasa disebut Supernatan. (http://inherent.brawijaya.ac.id). Salah satu contoh
fraksinasi ialah fraksinasi subseluler. Fraksinasi subseluler ialah pemecahan sel
melalui homogenasi dan pemisahan organel-organel dari yang satu degan lainnya
menggunakan alat setrifs. Fraksinasi biasanya dilakukan pada suhu rendah,
biasanya 4C untuk meminimalisasi degradasi enzim-enzim yang ada terhadap
komponen sel serta mempertahankan struktur dan fungsi dari organel.
Menurut Girsang et al. (2003) terdapat dua macam prinsip sentrifugasi
yang didasarkan atas : 1) massa, ukuran atau panjang partikel dan 2) densitas
partikel. Sentrifugasi zona merupakan contoh sentrifugasi didasarkan atas massa
dan ukuran partikel. Dalam sentrifugasi ini, partikel berbeda ukuran akan terpisah
pada lapisan-lapisan (zona) yang berbeda. Jenis kedua adalah sentrifugasi
berdasarkan pada keadaan yang setimbang, sentrifugasi keseimbangan gradiendensitas. Sentrifugasi jenis ini bekerja berdasarkan prinsip partikel dan cairan
yang berada pada level keseimbangan densitas (disebut keadaan isopiknik).
Teknik sentrifugasi keseimbangan gradien-densitas dapat memisahkan molekulmolekul dengan perbedaan densitas sampai 0,02 g/ml. Misal : DNA dan RNA
yang perbedaan densitasnya dalam larutan cesium klorida (CsCl) berturut-turut
adalah 1,3; 1,6-1,7 dan 1,75-1,8 gr/ml. Percobaan ini akan memisahkan organel
inti, dan mitokondria . untuk memisahkan organel-organel tersebut dilakukan
dengan

sentrifugasi

kecpatan

diferensial

(sentrifugasi

gradient

densitas

keseimbangan),kecepatan gravitasi sentrifus yang digunakan untuk isolasi inti

berbeda dengan yang digunakan untuk isolasi mitokondria. Homogenat awal yang
digunakan berasal dari homogenisasi hati tikus yang bauru diambil saat
pembedahan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan gravitasi tertentu. Proses
ini bertujuan memecah sel tanpa merusak organelnya, dengan langkah awal
merusak membran plasma dan dinding sel jika sel tersebut memilikinya (Artika
2010).

Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan melatih mahasiswa melakukan preparasi
homogenat sel hati tikus dari hewan uji yang akan digunakan untuk fraksinasi
subselular. Selain itu terampil melakukan fraksinasi pada kecepatan gravitasi
sentrifus yang berbeda untuk isolasi inti dan mitokondria dari homogenate yang
telah disiapkan sebelumnya.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah sentrifus, tabung sentrifus, tabung reaksi,
pipet Mohr, Erlemeyer, gelas piala, bulp, pipet tetes, batang pengaduk, kain blacu,
homogenizer, vial besar, dan vial kecil. Gunting, pinset, serta alat bedah hewan
lainnya juga digunakan pada percobaan ini.
Bahan yang digunakan adalah tikus putih, larutan sukrosa 0.25M-EDTA 1
mM, larutan sukrosa 0.34M-EDTA 1 mM, larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl 2 3 mM.
Eter, es batu dan akuades juga digunakan sebagai pelarut tambahan untuk
sentrifugasi.
Prosedur Percobaan
Preparasi homogenat sel hati tikus. Tikus percobaan jantan dimasukan ke
dalam toples dan ditambahkan kapas yang telah ditetesi eter untuk membus tikus.
Tikus ditelentangkan setelah terbius, kemudian bulu-bulu bagian perut dipotong
dan dibersihkan dengan alkohol.
Pembedahan dilakukan dengan pisau dan pinset yang tajam. Organ hati
diambil dan dimasukan ke dalam gelas piala yang berisi larutan sukrosa 0.34MEDTA 1 mM, organ hati dikeringkan dengan tisu, kemudian ditimbang dengan
cepat, dan dimasukkan kembali ke dalam gelas piala yang sama.
Organ hati dipotong-potong dan dihancurkan dengan bantuan gunting,
larutan sukrosa-EDTA akan berubah menjadi warna darah, larutan yang ini
dibuang beserta bahan-bahan yang mengapung, proses penghancuran dan
pembilasan ini diteruskan sampai larutan sukrosa-EDTA dingin hampir tidak
bewarna.
Potongan organ hati ditimbang 3-5 gram, kemudian dipindakan ke dalam
gelas piala yang lain dan ditambahkan larutan sukrosa-EDTA dingin. Campuran
ini dihomogenisasikan dengan bantuan homogenizer (alat penggerus jaringan).

Homogenat yang dihasilkan dipindahan ke dalam tabunng sentrifus untuk

ditimbang bobotnya. Sebagian homogenat disimpan ke dalam vial yang diberi
label homogenat dan sebagian sisanya ditambahkan larutan sukrosa-EDTA
dingin. Campuran ini disentrifugasi pada 700g selama 10 menit. Supernatan yang
dihasilkan dipisahkan untuk isolasi mitokondria dan pelet digunakan untuk isolasi
fraksi inti.
Isolasi fraksi inti. Pelet yang dihasilkan dari prpasi sebelumnya disuspensi
dengan larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2 3 mM. Suspensi disaring dengan kain
blacu dan dicuci dengan larutan sukrosa-CaCl2. Jaringan ikat dan pengotor yang
tertinggal di kain blacu dibuang. Filtrat yang dihasilkan, disentrifugasi pada 1500g
selama 10 menit. Supernatan dibuang dan peletnya diresuspensi dengan larutan
sukrosa -CaCl2. Hasil resuspensi diindahkan ke dalam vial yang diberi label
fraksi inti kemudian dibekukan.
Isolasi fraksi mitokondria. Supernatan yang diperoleh pada preparasi sel
hati tikus disentrifugasi pada 5000g selama 15 menit. Pelet dipindahakn secara
kuantitatif, kemudian ditambahkan larutan sukrosa 0.34M-EDTA 1 mM.
campuran ini dipindahkan kedalam tabung sentrifus yang lain. Pelet dihaluskan
dengan bantuan batang pengaduk secara manual. Volume campuran ini
dicukupkan menjadi 40 ml dengan pelarut sukrosa-EDTA untuk disentrifugasi
pada 2400 g selama 10 menit. Pelet hasil sentrifugasi diresuspensi dengan larutan
sukrosa-EDTA dan dpindahkan ke dalam vial yag telah diberi label fraksi
mitokondria kemudian dibekukan.
Hasil Percobaan
Tabel 1 Bobot hati dan volume homogenat
Meja

Bobot hati (gr)

Volume homogenat (ml)

8.5713

19

5.8890

15

8.96

28.8

8.63

20.21

Perhitungan :
Preparasi homogenat hati tikus
RPM

g
1.119 * 10 5 * 10.8cm

= kecepatan (gravitasi)

= jari-jari (10.8cm)

Kecepatan untuk homogenisasi hati tikus = 700g

700
1.119 * 10 5 * 10.8cm
RPM 2406.7 2400rpm
RPM

Isolasi fraksi inti

Kecepatan yang digunakan = 1500g
1500
1.119 * 10 5 * 10.8cm
RPM 3523.04 3500rpm
RPM

Isolasi fraksi mitokondria

Kecepatan yang digunakan = 24000g
24000
1.119 * 10 5 * 10.8cm
RPM 14092.19 14000rpm
RPM

Pembahasan
Fraksinasi sel ialah pemisahan sel menjadi organel dan molekul , biasa
dilakukan dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan tahap pertama dalam
fraksinasi , memisahkan organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip
sentrifugasi adalah memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan
sentrifugasi yang rendah atau sebaliknya (http://www.scribd.com). Percobaan ini
menggunakan tikus, karena hewan ini termasuk mamalia. Jenis kelamin tikus
yang diuji adalah jantan,bkan tikus betina dikarenakan tikus betina mengalami
fase hormonal (seperti menstruasi pada perempuan) yang mempengaruhi keadaan
organel-organel. Galur tikus yang biasa digunakan untuk fraksinasi subselular
galur Whistar jantan yang merupakan cikal bakal galur tikus Sparangue Dawley.

Tikus Whistar memiliki ciri-ciri kepala lebar, berdaun telinga panjang, dan
berekor panjang. Tikus jenis ini dikembangkan oleh Wishtar University sebagai
model percobaan mahluk hidup yang umum digunakan di laboratorium sejak
tahun 1906 (Dahab dan Yesham 2005).
Organ yang diambil adalah hati, organ ini memiliki banyak sel yang
didalamnya paling banyak mengandung mitokondria. Mitokondria berfungsi
sebagai organel respirasi dan pembentuk ATP dan enzim-enzim respirasi terutama
berada pada mitokondria. Organ hati yang telah diambil, dibersihkan dengan
larutan EDTA-dingin, selain untuk membersihkan organ hati, larutan ini juga
berfungsi sebagai pengkelat logam seperti Mg+ pada hati, mengendapkan protein
pengotor yang tidak diingikan yang terdapat pada organ hati. Sukrosa berfungsi
sebagai larutan isotonik agartekana osmosis sel terjaga. Larutan yang dipaka
iharus dingin agar tidak merusak organel-organel sel, memperlambat gerakan
termal molekul enzim yang terdapat pada hati tikus sehingga mencegah dan
menghambat reaksi enzimatik (Avilla dan Harris 1992).
Bobot hati hasil penimbangan adalah 8.63 gram. Hati dipotong-potong dan
dibersihkan dengan larutan sukrosa-EDTA dingin, kemudian dihomogenisasi agar
organel utama dalam organ dapat terpisahkan tanpa merusak sel (Campbell 2002).
Sentrifugasi dilakukan telah homogenat dihasilkan dengan kecepatan yang
berbeda-beda untuk homogenasi homogenate awal, isolasi fraksi inti, isolasi fraksi
mitokondria. Homogenisasi homogenate awal dilakukan pada kecepatan 700g
selama 10 menit menghasilkan pelet dan supernatan. Pelet disuspensi dengan
larutan sukrosa-CaCl2 yang berfungsi sebagai buffer yang berperan dalam
pencegahan rusaknya sel tehadap perubahan pH kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 1500g untuk mendapatkan fraksi ini. Supernatan hsil sentifugasi
homogenat awal disentrifugasi dengan kecepatan 5000g selama 15 menit. Pelet
mitokondria diresuspensi dengan larutan sukrosa-EDTA dan dibekukan di dalam
vial. Superatan yang dihasilkan dapat disentrfugasi lebih lanjut untuk
mendapatkan fraksi mikrosom. Bagan 1 merupakan bagan yang menggambarkan
hasil yang akan didapatkan jika melakukan fraksinasi dengan kecepatan yang
berbeda setiap sentrifugasi.

Kecepatan yan digunakan untuk homogenisasi homogenat awal adalah

700g, unuk isolasi fraksi inti digunakan kecepatan 1500 g, sedangkan isolasi
fraksi mitokondria digunakan sentrifus berkecepatan 5000 g. Kecepatankecepatan dalam satuan gravitasi (g) ini dikonversikan ke dalam satuan rpm. Hasil
perhitungan menunjukan untuk homogenisasi awal digunakan kecepatan 2400
rpm, untuk isolasi fraksi inti 3500 rpm, dan untuk isolasi fraksi mitokondria
digunakan kecepatan 14000 rpm.
Bagan 1 Homogenisasi dan hasilnya
HOMOGENAT
600g, 3 menit

Pelet

Supernatan

(nukleus)

6000g, 8
menit

Pelet

Supernatan

(mitokondria,kloroplas,

40000g, 30
menit

lisosom,peroksisom)

pelet

Supernatan

(membrane plasma,badan golgi

Retikulum endoplasma)

100000g, 90
menit

Pelet

Supernatan

(Ribosom)

(Sitosol)

Gambar 1 Homogenisasi dan hasilnya dengan sentrifugasi kecepatan diferensial

Bagan 2 menunjukan langkah yang dilakukan untuk mendapatkan fraksi

inti dan fraksi mitokondria.
Bagan 2 Fraksinasi subselular hati tikus
HOMOGENAT hati
tikus

Pelet

Supernatan

Resuspensi

Fraksi inti

Sentrifugasi

Buang
supernatan

Pelet

Supernata
n

Mikrosom

sitosol

Resuspensi
Sentrifugasi

Mitokondria

Buang
supernatan

Tidak dilakukan di dalam praktikum

Gambar 2 Langkah isolasi fraksinasi subselular

Simpulan
Prinsip fraksinasi subselular adalah pemisahan organel-organel sel
dengan sentrifugasi pada kecepatan yang berbeda-beda. Homogenat berasal dari
organ hati tikus jantan dengan bobot organ hati 8.63 gram dan volume homogenat
20.21 ml. sentifugasi dilakukan dengan kecepatan 2400 rpm untuk homogenisasi
awal, 3500 rpm untuk isolasi fraksi inti, dan 14000 rpm saat isolasi fraksi
mitokondria. Larutan sukrosa-EDTA dan larutan sukrosa-CaCl2 yang digunakan
dijaga dalam keadaan dingin agar organel-organel di dalam sel tidak rusak.
Daftar Pustaka
Anonim. Dasar-dasar Isolasi Protein. http://inherent. brawijaya. ac. id/ biomol/
materi/ Lecture13/.pdf.html [9 Mei 2010]
Anonim. Biologi Sel. http://www.scribd.com/biologi sel.pdf.html [9 Mei 2010].
Artika IM, Safithri M. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler.
Bogor: Departemen Biokimia.
Avila JL, Harris JR.1992. Subsellular Biochemistry. New York: Plenum Press.
Campbell NA, Reece, Mitchell. 2002. Biologi jilid I, Edisi Kelima. Rahayu
Lestari, penerjemah. Erlangga: Jakarta.
Dahab GM, Hesham YD. 2005. Effect of Angiotensin Converting Enzyme
Inhibitors Captopril and Lisinopril on Collagen Synthesis by Cultured rat
liver Cell. Saudi Pharmaceutical Journal 37:39. [terhubung berkala].
http://www.biochemj.org.[9 Mei 2010]
Girsang M, et al. 2003.Teknik Sentrifugasi untuk Meningkatkan Penemuan
Bakteri Tahan Asam (BTA) dari Sputum Penderita TBC Melalui Metode
Zielh-Neelsen.

[terhubung

http://www.litbang.depkes.go.id/media/index. [9 Mei 2010].

berkala].