MAKALAH PENGUJIAN REAL-TIME PCR UNTUK

DETEKSI DAN KUANTITASI DNA BABI DAN SAPI

DALAM CAMPURAN GELATIN DAN KAPSUL GELATIN
KELOMPOK 2 A

ANGGOTA :
SANI PRADASARI AFIFAH (1112102000004) A
AYU NOPITA (1112102000007) A
DWI HARYATI (1112102000009) A
KHAERUNNISA APRIANI (1112102000023) A

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM

STUDI FARMASI UIN SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
MARET 2015

PENDAHULUAN
Kehidupan seorang muslim berkaitan erat dengan konsep halal dan haram. Konsep ini
bersifat menyeluruh karena tidak hanya diaplikasikan pada makanan dan minuman, namun
juga untuk memperole nafkah, tata cara berpakaian, dan berkomunikasi dengan makhluk hidup
lainnya (Riaz dan Chaudry, 2004).
Dewasa ini teknologi pengujian dan keaslian suatu produk mengalami kemajuan yang
pesat. Banyak metode analisa yang telah dikembangkan dan menawarkan hasil yang cepat dan
dan otentik, salah satunya adalah metode berbasis DNA. Metode analisa dengan menggunakan
DNA memiliki beberapa keuntungan, yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada pada
suatu individu dengan informasi genetik yang identik. DNA merupakan molekul yang stabil
dalam proses ekstraksi dan analisa DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipe sampel
yang berbeda (Jain, 2004).
Real Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real
Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (QPCR/qPCR) yang digunakan sebagai teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul
DNA hasil amplifikasi tersebut. Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR (Polymerase
Chain Reaction), namun berbeda dengan instrumen PCR konvensional, dengan Real-Time
PCR, kita dapat mengamati proses penggandaan DNA target secara real-time dari satu siklus
PCR ke siklus selanjutnya tanpa perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat
hasilnya. Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada RealTime sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap
siklus reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses
elektroforesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut.
Kelompok kami, yaitu 2A, mendapatkan jurnal yang memuat tentang pengujian Realtime PCR untuk deteksi dan penghitungan DNA babi dan sapi dalam campuran gelatin dan
kapsul gelatin. Deteksi dan kuantitasi bahan dari spesies sapi dan babi dalam gelatin dan kapsul
gelatin diperlukan untuk perhatian kesehatan dan untuk beberapa alasan religius. Perhatian
pada produk sapi yang digunakan dalam gelatin telah berkembang sejak adanya Bovine
Spongiform Encephalophaty (BSE), yang dikenal sebagai penyakit sapi gila.
PCR kuantitatif (juga disebut qPCR atau PCR real time) penggunaannya telah
meningkat untuk deteksi yang cepat, sensitif dan spesifik pada DNA spesies yang spesifik
dalam berbagai produk yang diproses. Alat ini dapat mendeteksi DNA sapi dan babi serendah 1
pg/mL. Oleh karena itu, alat qPCR spesifik pada spesies babi dan sapi dideskripsikan disini
sebagai alat uji DNA yang simpel, dapat diandalkan dan sensitif untuk penentuan dan
kuantitasi spesies asal dari produk yang sangat diproses.

ALAT DAN BAHAN

Alat dan bahan yang digunakan untuk pengujian ini, yaitu :
1. Gelatine Porcine
2. Gelatine Bovine
3. Gelatin Capsule Porcine
4. Gelatin Capsule Bovine
5. Nuclease free water
6. MasterPure DNA Purification Kit
7. Isopropanol
8. Larutan Glycogen
9. Porcine dan Bovine Genom DNA
10. Probe porcine 5-(FAM)CCC AAC CCC CAA ACT GTC TCC T (ZEN)- 3
11. Probe Bovine 5-(FAM) TCC ACT GTT TCC CCA TCT ATT TGC CA (ZEN)3
12. Primer porcine 5-ATT TCC ATC CCA CAG CCC-3 (Forward) dan 5-AAC AGA
TGC TGA CTC ACA GAC-3 (Reverse)
13. Primer Bovine 5-CTA AGA TCA TGG CAT CAG GTC C- 3 (Forward) dan 5CCC CAA AAT AAA GTC AGC CAC- 3 (Reverse)
14. Genomic DNA Bovine
15. Genomic DNA Porcine
16. Larutan glycogen
17. Larutan isopropanol
18. Carrier tRNA
19. PCR Real Time

METODELOGI PENELITIAN

ya dengan persentase 0%,1%, 5%, 10%, 20% dan 40 % (w/w), dengan total berat campuran 2000 m
sul Gelatin babi dan gelatin sapi dicampurkan satu dengan yang lainnya dengan persentase 50 % (w

n menambahkan 40 mL nuclease-free water dan diinkubasi pada suhu 65C selama 30 menit sampa

Ambil 300 L larutan gelatin kemudian diisolasi menggunakan MasterPure DNA Purification.

ahkan campuran tersebut dengan larutan isopropanol, gliserol, dan carrier tRNA agar terjadi presip

Tambahkan larutan pelisis sel yang berisi proteinase K.

gan menguji genom DNA porcein dan bovine pada konsentrasi 1 mg/mL pada qPCR dengan melaku

Pengujian DNA yang telah diisolasi dengan pcr real time sebanyak 40 siklus.

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Uji perkembangan alat qPCR yang spesifik untuk babi dan sapi
Untuk mengetahui ketelitian dan keakuratan alat qPCR terhadap genom DNA babi dan
genom DNA sapi dapat dilakukan dengan cara menguji campuran antara genom DNA sapi dan
DNA babi yang telah diketahui kadarnya. Sebelumnya, untuk mencari kadar DNA babi dan
DNA sapi dalam suatu campuran harus dilakukan pembuatan kurva standar baik kurva standar
DNA babi maupun kurva standar DNA sapi. Hal ini dapat dilakukan dengan cara melakukan
pengenceran 10 kali dari genom DNA babi maupun DNA sapi dimulai dari 1 pg/ml sampai 107
pg/ml. Kemudian masing masing konsentrasi di masukkan ke dalam alat qPCR dan dilihat
hasilnya lalu dibuat kurva kalibrasi, kurva kalibrasi yang baik memilki linieritas yang linier
ditandai dengan niali R (regresi linier) yang mendekati 0,9999. Berikut ini hasil dari kurva
kalibrasi DNA babi (gambar A) dan DNA sapi (gambar B).

Dari hasil diatas diketahui bahwa pada nilai regresi linier DNA babi dan DNA sapi
samasama bernilai R2 = 0,9981, sedangkan slope DNA babi -3,3987 dan DNA sapi -3,5248.
Berdasarkan literatur nilai amplifikasi yang efisien bernilai antara 90 110% (Adam, 2006).
Nilai amplifikasi ini dapar dicari dengan cara memasukkan nilai slope kedalam formula
(efisiensi = 10-1/slope) 1), efisiensi qPCR DNA babi dan sapi yaitu 97 % dan 92%, hal ini berarti
bahwa DNA babi dan DNA sapi sangat efisien untuk dilakukan pengujian menggunakan qPCR.

3.2 Deteksi dan penghitungan secara kuantitatif bahan babi dan sapi di dalam gelatin
menggunakan qPCR.

Untuk mengetahui keefektifan dan keakuratan alat qPCR dalam mendeteksi dan
memberikan informasi mengenai kadar kandungan sapi dan babi dalam gelatin dalam jumlah
yang besar dilakukan percobaan dengan cara mencampurkan gelatin babi dan gelatin sapi yang
sebelumnya telah diketahui kadarnya yang tidak dapat dibedakan secara visual. Campuran
gelatin sapi dan babi dicampurkan kemudian dibuat seri konsentrasi 0%, 1%, 5%, 10%, 20%,
dan 40% (w/w). Berikut hasil dari percobaan antara campuran babi dan sapi dengan
konsentrasi yang berbeda:

Tabel 1 : Tabel campuran gelatin babi dan sapi, dengan konsentrasi gelatin babi (porsine) yang lebih
banyak

Tabel 2. Gambar campuran gelatin babi dan sapi, dengan konsentrasi gelatin sapi (bovine)
yang lebih banyak

Pada gambar diatas terlihat bahwa pada konsentrasi gelatin sapi 100% dan babi 0%,
DNA sapi dalam gelatin sapi yang terdeteksi pada qPCR 100% sedangkan DNA babi 0,00%.
hal ini menunjukan bahwa q PCR sangat efektif dan akurat dalam mendeteksi dan menunjukan
kadar suatu bahan meskipun dalam suatu campuran.

Gambar 1. Contoh perhitungan bovine 0% dan porcine 100%

Pada gambar diatas terlihat bahwa pada konsentrasi gelatin sapi 0% dan babi 100%,
DNA sapi yang terdeteksi pada qPCR 0,00% sedangkan DNA babi 100%. hal ini menunjukan
bahwa qPCR mampu membedakan DNA sapi dan DNA babi pada suatu campuran sapi dan
babi dengan sangat baik.
3.3. Pengujian qPCR untuk mendeteksi dan menghitung kandungan babi dan sapi dalam
gelatin kapsul.
QPCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengetahui kadar suatu bahan
gelatin kapsul. DNA yang terdeteksi dalam gelatin kapsul (DNA babi dalam gelatin kapsul
babi : 1.10 pg/mg, DNA sapi dalam gelatin kapsul sapi : 0.30 pg/mg). Hasil menunjukan bahwa
DNA babi maupun DNA sapi yang terdeteksi pada gelatin kapsul sangat kecil, hal ini mungkin
terjadi karena degradasi DNA pada saat pembuatan gelatin kapsul.
Pada pencampuran sapi dan babi dalam kapsul gelatin dengan persentase 50 : 50, hasil
menunjukan bahwa kadar sapi dalam kapsul gelatin sebesar 45% dan kadar babi dalam kapsul
gelatin sebesar 55%. Hal ini menunjukan bahwa alat qPCR memiliki kesensitifan yang masih
dapat diterima dalam gelatin kapsul.

KESIMPULAN

Alat QPCR dapat digunakan sebagai alat untuk mengonfirmasi ada atau tidaknya suatu
spesies tertentu dalam gelatin dan kapsul gelatin dengan jumlah yang besar.
Uji qPCR spesifik pada spesies babi dan sapi dijelaskan disini sebagai alat yang simpel,
dapat diandalkan, dan uji DNA yang sensitif untuk menentukan spesies asli pada suatu
produk yang diproses tinggi.
Kuantitas DNA yang ditentukan mungkin tidak selalu mewakili jumlah bahan babi dan
sapi yang spesifik karena data kuantitatif yang diperoleh hanya akan menjadi perkiraan.
Hal tersebut disebabkan oleh tingkat degradasi DNA yang terjadi dan jumlah kopian
DNA hewan yang satu dengan hewan yang lain dalam spesies yang sama dapat
bervariasi.

DAFTAR PUSTAKA

Cai, Hui, et al. (2011). Real-time PCR assays for detection and quantitation of porcine
and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Elsevier Inc.Volume 25.
Evira Vivikananda. (2014). Deteksi DNA babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan
Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). Skripsi Sarjana
pada FKIK UIN Jakarta: tidak diterbitkan.