Bioteknologifarmasi PDF
Bioteknologifarmasi PDF
Bioteknologi Farmasi
FAR 40541
2 SKS
SASARAN PEMBELAJARAN:
Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi,
keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam
bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme,
teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika,
pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi,
dan penerapan bioteknologi dalam upaya
pemeliharaan kesehatan masyarakat.
PUSTAKA :
Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006
Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press.
Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E.
Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK)
Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text
Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland,
MA, USA
J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A
Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA
James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant
DNA, Scientific American Books, New York, USA
Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd
Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.
Pokok-pokok Bahasan
Pendahuluan
Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam
bidang farmasi,
Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi,
Teknologi bioproses
Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi:
fermentasi dan kinetikanya, proses hilir
Materi genetik
Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan
Terapi gen pada manusia,
Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang
farmasi,
Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.
Overview
Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi
Dampak bioteknologi terhadap bidang
farmasi
Rekayasa genetika-rekombinasi DNA
kloning gen
Aplikasi teknik molekular
Produk komersial dari mikroorganisma
Terapi Gen
BIOTEKNOLOGI FARMASI
Definisi:
BIOTEKNOLOGI:
- Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang
penting dan
Bermanfaat : protein dan enzim
-Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing
tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin
Diperlukan molecular basic knowledge
PATOFISIOLOGI PENYAKIT
DRUG ACTION
IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM
DAMPAK BIOTEKNOLOGI
TERHADAP BIDANG FARMASI
I. Obat obatan berupa protein dan peptide
stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat
obat yang berupa molekul, kecil
Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok
Profesi FARMASIS
Isu isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical )
Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat obat
dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.
RAKAYASA GENETIKA
Definisi
Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik
dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang
dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga
memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang /
diperbanyak di dalam sel inang yang baru.
KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan
membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan
memperbanyak molekul yang baru.
Kloning gen rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinan
Contoh : domba Dolly
RAKAYASA GENETIKA
Material genetik :
adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan
dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat
DNA : deoksi ribonucleic acid
RNA : ribonucleic acid
Vektor Kloning :
adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke
inang tertentu.
Gen :
adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.
ASPEK KLONING
- Menerobos barier alamiah suatu spesies
Insulin manusia diproduksi oleh E. coli E. coli sebagai pabrik
biologis
-Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif
potongan potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi
gen penyebab penyakit keturunan
Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/0897)
sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan
sel sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.
ASPEK KLONING
Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya
mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi
organisme, dalam hal ini galur galur yang produktif.
Mikroorganisme
Tanaman
Hewan
BIOREAKTOR
DEFINISI
Isolasi DNA
mengekstraksi molekul DNA dari sel
Memotong DNA ( digestion )
memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada
sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi
Menyambung DNA ( Ligation )
Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA
vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase
Transformasi
Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang
ISOLASI DNA
1.Penghancuran dinding sel : - mekanik
- enzimatis
2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat
- Triton X 100
3. Membersihkan debris sel
- sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven
organik
Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ;
atau proteinase-K
4. Presipitasi
- + alkohol sentrifugasi gradien CsCl ; elektro- + alcohol + NH4 asetat
lamda
+RE
DNA size
plasmid
plasmid
+RE
VEKTOR KLONING
PLASMID
bereplikasi diri ( self replicating )
utas ganda : d s
molekul DNA sirkulator
di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal
copy number ( Jumlah kopi per sel ):
high copy number 10 100 kopi / sel
low copy number 1 4 kopi / sel
medium copy number diantaranya
Ukuran : 1 s/d 500 kb
VEKTOR KLONING
Spektrum inang :
broad hostrange dapat bereplikasi pada sejumlah spesies
bakteri
narrow hostrange hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus
Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning :
Ukuran kecil
Mempunyai situs situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ),
tempat insert disisipkan / diklon.
Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi
sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert.
Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered
Contoh : pBR 322, pUC 19
PLASMID
-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri,
berbentuk sirkular, utas ganda.
- Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang
Eukariotik ( beberapa )
- Plasmid alami menyandikan :
1. Resistensi AB
2. Colicin = Bakteriosin
3. Virulensi
4. Aktivitas metabolit
STABILITAS PLASMID
kondisi optimum, stabil
medium tumbuh
- Mandiri tidak tergantung kromosom
ada gen ORI : untuk replikasi mandiri
- Plasmid rekayasa
Untuk teknologi DNA rekombinan
5 versus 3 overhang
Enzyme cuts
3
G
GAATTC
3 CTTAAG
G 5
5
G
3 CTTAA
5
3
5
5
3
AATTC 3
G 5
Generates 5 overhang
EcoRI
Escherichia coli
5 overhang
PstI
Providencia stuartii
3 overhang
GAATTC 3
3 CTTAAG 5
5
CTGCAG 3
3 CACGTC 5
Agarose Electrophoresis
3
6
4
1
6
20
1 : 2 ( s/d 1: 10 )
TRANSFORMASI
Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara
mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah
kompeten.
GFP
TRANSFORMASI
E.coli sebagai sel inang :
> sudah dimodifikasi genetik, antara lain :
> Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi
sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi
contoh : E.coli DH5, E.coli HB101
TRANSFORMASI
Electroporation
Electrical shock yang menyebabkan membran
menjadi permeabel terhadap DNA
Calcium Chloride/Heat Shock
Chemically-competent cells mengambil DNA
setelah heat shock
Electroporation
Electric shock
SELEKSI
E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap
E.coli yang tidak membawa rekombinan
Macam seleksi : ( 4 )
1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan )
perlu teknik cawan replika (replica plating)
2. seleksi warna koloni : X gal , memanfaatkan gen lacZ
yang menghasilkan enz. galactosidase.
Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi -gal biru
3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli
DHS ( inang )
4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization
REPLICA PLATING
Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN
Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)
BLOCK
PRESS
= Transforman
AMPR
AMP LATE
REPLICA PLATING
Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh
Kain
Beludru
BLOCK
PRESS
BLOCK
AMP LATE
AMP LATE
BLOCK
BLOCK
TET PLATE
AMP LATE
REPLICA PLATING
Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin
Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh
TETRES NONRECOMBINANTS
GROW
TET PLATE
TETRES NONRECOMBINANTS
AMP LATE
TET PLATE
Pemetaan :
Manfaat ER dalam biologi molekuler.
Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs situs
Enzim restriksi.
Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ):
pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.
Non medical :
-Agriculture
-Specialities
-Non-medical Diagnostic
Contoh : INDIGO pewarna jeans
INDIGO
-diekstraksi dari tanaman
-batubara
-rekombinan DNA
Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans
DIAGNOSTIK MOLEKULER
Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus
virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul molekul kecil.
Pharmaceutical biotechnology
Diabetes
Haemophilia
Stroke
Growth failure
Anaemia
Viral infection
Insulin
Factor VIII
Tissue plasminogen activator
Human growth hormone
Erythropoietin
Interferon
Isolasi cDNA
Engineering (Rekayasa)
Isolasi cDNA
Strategi I:
Isolasi protein target
Sintesis oligonukleotida
Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari
pustaka genom atau pustaka cDNA
Engineering
Strategi untuk mendesain protein protein, dengan cara mengatur
kombinasi domain domain fungsional suatu protein, atau dengan
cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action
suatu protein.
D-Sorbitol
L-sorbose
L- ascorbic Acid
Satu tahap fermentasi mikroba sejumlah tahap tahap
kimia
Dari penelitian penelitian biokimia mengenai lintasan lintasan
metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan
kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG
Acetobacter
Gluconobacter
Erwinia
D. glucose
Corynebacterium
Brevibacterium
Arthrobacter
2,5-DKG reduktase
2,5 DKG
2 KLG
1 lintas metabolisme
TERAPI GEN
Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan
terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau
mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap
sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi.
TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler
manusia menentukan kecacatan pada level gen,
dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan
simtom penyakit genetik yang spesifik
PENDEKATAN
Protein yang terlibat
Isolasi dan karakterisasi
Sekuensing asam amino
Investigasi sekuen penyandi
Buat pelacak spesifik
Isolasi gen target dari pustaka genom
Gen remedial
Konstruksi pada vektor virus
di bawah promotor khusus
yang spesifik menginfeksi
sel khusus (sel target)
Antisense therapy
Dirancang untuk pencegahan;
- penurunan ekspresi gen tertentu,
- bekerja pada tahap translasi (mRNA)
Ada 2 cara:
A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas)
B.Menggunakan gen antisense yang diklon
Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak
ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang
ditranskripsikan (utas sense).
antisense
oligonukleotida
TCGACTA
mRNA
AGCUGAU
Base pairing
AGCUGAU
TCGACTA
No translation
transcription
mRNA
AGCUGAU
mRNA sense
mRNA antisense
UCGACUA
Base pairing
AGCUGAU
TCGACTA
No translation
Uk.
DNA > 5000 BP