1

ANALISAHASILTRANSFORMASI
DENGANMENGGUNAKANPCRKOLONIDANRESTRIKSI

PENDAHULUAN
PolimeraseChainReaction(PCR)
PCR adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target
tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA
target dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam
thermocycler.PanjangtargetDNAberkisarantarapuluhansampairibuannukleotidayangposisinya
diapitsepasangprimer.Primeryangberadasebelumtargetdisebutprimerforwarddanprimeryang
berada setelah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian
molekul DNA baru disebut sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut
dalamteknikPCR,diperlukanjugadNTPsyangmencakupdATP(nukleotidaberbasaAdenine),dCTP
(nukleotidaberbasaCytosine)dandTTP(nukleotidaberbasaThymine)(Muladno,2002).
PCRadalahsuatumetodeyangmenggunakankomponenkomponenreplikasiDNAuntukmereplikasi
suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk
mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Dua primer
oligonukleotida pendek digunakan untuk mengapit daerah DNA yang akan diamplifikasi. Primer
menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA
molekul.PrimermenetapkanlimitdaerahyangakandiamplifikasidanDNApolymerasemereplikasi
DNA diantara primer menggunakan empat deoksiribonukelotida (dGTP, dATP, dCTP, dTTP) yang
disediakan di dalam tabung reaksi dengan penambahan dNTPs. Di dalam sebuah siklus amplifikasi
(=replikasi),DNAtemplatedidenaturasipadatemperaturetinggi,annealingprimerdilakukandengan
menurunkan temperature dan DNA polymerase memperpanjang DNA dari primer. Pengulangan
siklusdenaturasi,annealingprimer,dansintesisDNAmenghasilkanDNAmelaluiamplifikasisecara
eksponensial. Sekitar 25 sampai 40 siklus pada umumnya digunakan di dalam thermalcycler, yaitu
sebuahinstrumenyangsecaraotomatismengontroltemperaturedanwaktu.SuatuDNApolymerase
khusus Taq polymerase, yang diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang
hidup di hot spring yang stabil pada temperature tinggi digunakan untuk mendenaturasi DNA
template. Produk yang dihasilkan dari PCR dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose
(Barnum,2005).
BeberapakomponenyangpentingyangdibutuhkandalamreaksiPCRadalah:DNAtarget,
primer, enzim Taq DNA polymerase, deoksinukleoside triphosphat dan larutan penyangga (buffer).
MolekulDNAyangtargetnyaakandilipatgandakanjumlahnyadapatberupauntaitunggalatauuntai

ganda.Jumlahyangdigunakandalam prosesPCRtidakterlaluberpengaruhterhadapkualitashasil
PCR,tetapijumlahdalamukuranpikogramsudahcukup.DAlammenentukanjumlahini,dapatpula
dilakukan ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga
diperoleh kualitas PCR yang paling baik. Apabila target yang digunakan berupa total DNA genom,
sebaiknya DNA tersebut dipotong terlebih dahulu dengan enzim tertentu sehingga potongan DNA
yang dihasilkan masih berukuran cukup besar, misalnya enzim Sal I atau Not I yang mempunyai
sedikit situs pemotongan di dalam total DNA genom. Primer atau oligonukleotida sebaiknya
berukuranpalingpendek16basadanbiasanyaberkisarantara1824basa(Muladno,2002).

Restriksi
Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs
spesifik.Sepertidiketahui,didalamBioteknologiterdapatduakategorienzimyangberperandalam
proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi DNA dan penyiapan DNA
rekombinan(dimanaduamolekulDNAdikombinasikan).DNAspesifikataugendiisolasi/diambildari
DNA dengan memotong sugarphosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang
berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah
tanpaadanyaduajenisenzim,yaitu:enzimrestriksiendonukleaseyangberperansebagaigunting
untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang
merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar
phosphat backbone DNA pada kedua utasnya. Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di
dalammolekulDNA.Urutanyangspesifiktersebutpadaumumnyaterdiridari46pasangbasadan
bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang
sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama yaitu 5 3 (Suharsono dan
Widyastuti,2006).
Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempattempat
tertentudariurutanbasatersebut.EnzimrestriksimemotongDNAdoublestrandsdenganmemutus
ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari
deoksiribonukleotidayangberbatasandengannya.Terdapatduatipehasilpemotongan,ujungrata
(bluntend)danujungkohesif(stickyend).Ujungrata(bluntend)dihasilkanketikaduautasmolekul
dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak
berpasangan.Ujungkohesif(stickyend)dihasilkanketikasetiapmolekulDNAdipotongpadaposisi
yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3) menggantung dengan beberapa nukleotida.
Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa

pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif (Suharsono dan Widyastuti,
2006).
ALATDANBAHAN
Alat
MesinPCR,Elektroforesis,Geldock

Bahan
Bakteri rekombinan hasil transformasi, Xgal, IPTG, primer forward, primer reverse dan
enzimrestriksi

METODE
PolimeraseChainReaction
SatukoloniputihyangtumbuhpadamediaLA,ampicilin,Xgal,IPTGdisuspensikankedalam
tabung PCR yang telah berisi 8,5 l ddH2O kemudian di kocok. Tusuk gigi yang digunakan untuk
memindahkanbakterikedalamtabungPCRkemudiandigoreskankembalipadamediabarusebagai
stok.TabungPCRkemudiandiisidengancampuranPCRyangterdiridari1uldNTPrimer2M,0,5ul
PrimerF10M,0,5ulPrimerR10M,0,4ulDMSO,1ul10xBufferTag,0,1ulTagDNApolsehingga
total larutan yang diperoleh adalah 3,5 ul. Lakukan PCR dengan kondisi Pra PCR pada suhu 94oC
selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 menit, annealing (penempelan) pada suhu
56oCselama30detik,pemanjangan72oCselama1,5menit,pascaPCR72oCselama5menit,semua
proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus selama 2,5 jam. Hasil PCR kemudian di elektroforesis
selama30menit.

Restriksi
Restriksidilakukandenganmenggunakan2ulplasmid(50g/ml),2ul10xbufferEcoRI,0,5
ulenzimEcoRI10U/uldan15,5ulddH2O,sehinggalarutansampelyangdiperolehadalah20uldi
dalammasingmasingtabung.Kemudian,larutandiinkubasipadasuhu37oCselama2jam,kemudian
dielektroforesisselama30menit.

HASILDANPEMBAHASAN
Hasil

Dari hasil elektroforesis dapat diperoleh foto gel agarose seperti pada gambar 1. Dari

penampakan yang terlihat pada foto diketahui bahwa hasil restriksi dengan menggunakan enzim

restriksi Eco RI terbentuk dua pita pada gel, sedangkan dengan menggunakan PCR koloni tidak
terbentukpita.

Gambar1.Gelagarosehasilelektroforesispadapemeriksaangeninsertdenganmenggunakan
metodePCRkolonidanenzimrestriksi.

Pembahasan
Enzim restriksi Eco RI berfungsi untuk memotong plasmid pada dua titik sehingga plasmid
terbagi menjadi dua bagian DNA. Dua bagian tersebut adalah vektor yang berada paling dekat
dengansumuryangpasanganbasanyalebihbesardangeninsertyangjauhdarisumurdanpasangan
basanyalebihkecil.Makadenganterbentuknyaduapitapadagelelektroforesisdapatdisimpulkan
bahwaprosesrekombinasiberhasilkarenabakteriyangditransformasikan(dalamkasusinihampir
semuabakteriberwarnaputihyangdiambil)mengandunggeninsert(Gdarikedelai)didalamnya
sehinggabakteristokdapatdigunakansebagaibakterirekombinanyangdapatmengekspresikangen
Gdarikedelai.

TidakterbentuknyapitapadagelagarosehasilelektroforesiskoloniPCRmenandakanbahwa

kolonibakteriyangdiambiltidakmengandunggeninsert.Padahal,padaprinsipnya,tujuandariPCR
koloni adalah untuk mengamplifikasi gen insert yang berada pada plasmid dari bakteri dengan
menggunakanprimeryangspesifikdarigenGdarikedelaisehinggageninsertteramplifikasidan
ketikadilakukanelektroforesisakanmembentukpitapadagelagarose.Pitayangterbentukhanya

satukarenaamplifikasihanyadilakukanpadageninsert.Tidakterbentuknyapitadapatdiakibatkan
primer yang digunakan tidak menempel pada Ori sehingga DNA polymerase tidak melakukan
replikasi sehingga gen insert tidak teramplifikasi mungkin primer yang digunakan sudah tidak lagi
berfungsisebagaimanamestinyakarenapengaruhlamanyapenyimpanan.

KESIMPULAN

DalamkondisiyangbertentanganmakadapatdisimpulkanbahwaprosesDNArekombinasi

berhasil apabila dilihat dari hasil elektroforesis dengan menggunakan metode restriksi dimana
denganmenggunakankoloniPCR,prosesDNArekombinasitidakberhasil.

DAFTARPUSTAKA

Barnum,SusanR.2005.BiotechnologyanIntroduction,2ndedition.ThomsonBrooks/Cole,
USA.323pages.

Muladno.2002.SeputarTeknologiRekayasaGenetika.PustakaWirausahaMudadanUSESE
Foundation,Bogor.123halaman.

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen.
Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Lembaga Penelitian dan
PemberdayaanMasyarakatIPBdenganDIKTIDIKNAS,Bogor.