P O LY M ER A S E C H A IN

R EA C TIO N (P C R )

P engertian P C R
Reaksi Polimerase Berantai atau

dikenal sebagai Polymerase Chain

Reaction (PCR), merupakan suatu
proses sintesis enzimatik untuk
melipatgandakan suatu sekuens
nukleotida tertentu secara in vitro.
Metode ini dikembangkan pertama
kali oleh Kary B. Mulis pada tahun
1985.

 Pada awal perkembanganya metode

ini hanya digunakan untuk

melipatgandakan molekul DNA,
tetapi kemudian dikembangkan lebih
lanjut sehingga dapat digunakan
pula untuk melipatgandakan dan
melakukan kuantitas molekul mRNA.

K om ponen K om ponen
PCR
1. DNA cetakan
2. Oligonukleotida primer
3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
4. DNA Polimerase
5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

D N A cetakan
DNA cetakan, yaitu fragmen DNA

yang akan dilipatgandakan. Fungsi

DNA templat di dalam proses PCR
adalah sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru
yang sama. Templat DNA ini dapat
berupa DNA kromosom, DNA plasmid
ataupun fragmen DNA apapun asal
di dalam DNA templat tersebut
mengandung fragmen DNA target
yang dituju.

O ligonukleotida prim er
Oligonukleotida primer, yaitu suatu

sekuen oligonukleotida pendek (15 25

basa nukleotida) yang digunakan untuk
mengawali sintesis rantai DNA. Primer
yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu
oligonukleotida yang mempunyai sekuen
yang identik dengan salah satu rantai
DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan
oligonukleotida yang kedua identik
dengan sekuen pada ujung 3OH rantai
DNA cetakan yang lain.

D eoksiribonukleotida trifosfat (dN TP)

campuran dNTP adalah larutan air

pada pH 7,0 yang mengandung

dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masingmasing pada konsentrasi akhir baik
10mm atau 25mm. dNTP yang siap
digunakan merupakan solusi yang
dirancang untuk menghemat waktu
dan untuk menyediakan
reproduktifitas yang lebih tinggi
dalam aplikasi PCR dan lainnya.

D N A Polim erase
DNA polymerase yang digunakan

dalam PCR adalah fragmen Klenow

DNA polymerase I yang berasal dari
Escherichia coli (Mullis dan Fallona,
1989). Fragmen Klenow adalah DNA
polymerase yang telah dihilangkan
aktivitas eksonuklease (5 3)-nya.

 Taq DNA Polimerase

Taq DNA polymerase yang beraasal

dari bakteri Thermus aquaticus BM,

yaitu suatu strain yang tidak
mempunyai endonuklease retriksi
TaqI. Taq DNA polymerase tersusun
atas satu rantai polipeptida dengan
berat molekul kurang lebih 95 kD.

Tth D N A polim erse

Enzim DNA polimerse lain yang juga

dapat digunakan untuk melakukan

PCR adalah Tth DNA polimerse.
Enzim ini diisolasi dari eubakteri
thermofilik Thermus thermophilus
HB8. Tth DNA polimerse mempunyai
prosesivitas yang tinggi dan tidak
mempunyai aktivitas eksonuklease
3 5. Enzim ini menunjukkan
aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada
suhu 25 ) dan suhu sekitar .

Pw o D N A polym erase
Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi

dari archaebacterihiperthermofilik
Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA
polymerase mempunyai berat
molekul sekitar 90 kD. Enzim ini
mempunyai prosesivitas polimerasi
5 3 yang tinggi, mempunyai
aktivitas eksonuklease , dan tidak
menunjukkan aktivitas eksonuklease

Sifat enzim
1) Cloning produk PCR
2) Studi polimorfisme alel dalam
transkrip RNA individual
3) Karakterisasi mutasi yang jarang
di dalam suatu jaringan
4) Karakterisasi status alel suatu sel
tunggal atau DNA molekul tunggal
5) Karakterisasi populasi sel dalam
suatu kultur

Pfudan TliD N A polym erase

DNA polymerase lain yang dapat

digunakan untuk PCR adalah Pfu

DNA polymerase dan Tli DNA
polymerase. Pfu DNA polymerase
diisolasi dari Pyrococcus furiosis,
mempunyai berat molekul 92 kD,
aktif pada suhu dan mempunyai
aktivitas eksonuklease

PCR buff
er dan konsentrasi
M g2+
Konsentrasi ion magnesium dalam

PCR buffer merupakan faktor yang

sangat kritikal, karena kemungkinan
dapat mempengaruhi proses
annealing primer, temperatur
dissosiasi untai DNA template, dan
produk PCR. Hal ini disebabkan
konsentrasi optimal ion Mg2+ itu
sangat rendah.

P eralatan K husus yang

D igunakan dalam P C R
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel

electrophoresis unit (Hoefer)

2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah
peralatan laboratorium yang digunakan untuk
analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan
DNA tertentu.
4. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge
tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini
memiliki sebuah thermal block dengan lubanglubang untuk memasukkan tabung campuran
PCR.

Tahapan P roses P C R
Denaturasi

Denaturasi merupakan proses

memisahkan DNA menjadi utas
tunggal. Tahap denaturasi DNA
biasanya dilakukan pada kisaran
suhu 92 95 oC. Denaturasi awal
dilakukan selama 1 3 menit
diperlukan untuk meyakinkan bahwa
DNA telah terdenaturasi menjadi
untai tunggal.

 Annealing

Annealing merupakan proses

penempelan primer. Tahap annealing
primer merupakan tahap terpenting
dalam PCR, karena jika ada sedikit
saja kesalahan pada tahap ini maka
akan mempengaruhi kemurnian dan
hasil akhir produk DNA yang
diinginkan.

 Extension

Extension merupakan proses

pemanjangan DNA. Dalam tahap
extension atau sintesis DNA, enzim
polimerase bergabung bersama
dengan nukleotida dan pemanjangan
primer lengkap untuk sintesis sebuah
DNA utas ganda. Reaksi ini akan
berubah dari satu siklus ke siklus
selanjutnya mengikuti perubahan
konsentrasi DNA.

A plikasi P C R
PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA

dari berbagai macam sumber misalnya

fragmen DNA kuno dari gajah purba
(mammoth) berbulu yang telah membeku
selama 40.000 tahun; DNA dari sedikit darah;,
jaringan, atau air mani yang ditemukan di
tempat kejadian perkara kriminal; DNA dari sel
embrionik tunggal untuk diagnosis kelainan
genetik sebelum kelahiran dan DNA gen virus
dari sel yang diinfeksi oleh virus yang sulit
terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk.,
2004:395).

K elebihan dan K elem ahan

PCR
Kelebihan

1. Memiliki spesifisitas tinggi

2. Sangat cepat, dapat memberikan
hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian
mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi
tidak harus hidup
5. Mudah di set up

 Kelemahan
1. Sangat mudah terkontaminasi
2. Biaya peralatan dan reagen mahal
3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum

tervalidasi untuk semua penyakit infeksi

(misalnya infeksi pasif atau laten)
4. Teknik prosedur yang kompleks dan
bertahap membutuhkan keahlian khusus
untuk melakukannya.

D aftar P ustaka
John E. Smith. (1985).Prinsip

bioteknologi.Jakarta: Gramedia.
Triwibowo, . (2010).Teori dan
Aplikasi PCR. Yogyakarta: Penerbit
ANDI.
Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G.
Mitchell. (2002).Biologi jilid 1.
Jakarta: Erlangga