Polimorfisme DNA

Compiled and modified by Prof. Sudjadi and Dr. Hermawan

 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Biologi
•  Setiap sel manusia dlm badan mengadung pasangan
DNA yg sama, kecuali sperma/telur
•  Urutan DNA setiap orang unik, walaupun ada kesamaan
99,8% dg orang lain, berbeda 0,2% dari 3,2 milyar
nukleotida menghasilkan orang yg tidak sama
•  Umumnya variasi terdapat pada daerah non-coding, junk
DNA
•  Mutasi pada daerah non-coding dapat ditoleransi tanpa
pengaruh pada manusia
•  Mutasi pada promoter, regulator, penyandi protein akan
berpengaruh pada individu.
 Genetik Populasi dan Allel
A.  Manusia merupakan organisme diploid,setiap individu
mempunyai alel per lokus.
B.  Individu dapat bersifat:
1.  Homozigot—dua kopi sama dalam hal panjang dan
urutan basanya.
2.  Heterozygot—sekuen dan dua kopi berbeda dalam
panjang atau urutan basanya.
C.  Pada suatu daerah dapat bersifat hipervariabel (biasa
digunakan untuk analisis forensik), sedangkan bagian
lainnya tidak variabel.
D.  Polimorfisme allelik dalam populasi terjaga karena
penyimpangan genetik atau seleksi alam.
 Polimorfisme DNA
•  Perbedaan urutan basa, dibandingkan dg
urutan basa standar baku yg terdapat paling
tidak 1% populasi.
•  Mungkin berpengaruh pada fenotip atau tidak
berpengaruh.
•  Istilah polimorfisme secara bahasa berarti
“mempunyai banyak bentuk/varian”
•  Polimorfisme urutan basa - terjadi pada urutan
pasang pada lokus tertentu
•  Polimorfisme panjang à variasi dalam panjang
pada lokus tertentu
 Sekuen DNA Polimorfik
•  Polimorfisme terdapat pada seluruh
genom.
•  Jika lokasi urutan polimorfik diketahui,
hal itu dpt digunakan sbg penanda/
marker utk penentuan lokasi gena lain
atau daerah genetik.
•  Setiap penanda polimorfik yang
mempunyai versi berbeda dimanakan alil.
 Polimorfisme Urutan Basa
16111
16126
16129
16184
16185
16187
16189
16192
16209
16223
16230
16261
C C G C C C T C T T A C T
C C A C C C T C T T A C T
T T G C C C T C T T A C T
C C G C C C T C T T A C T
T T G C C C T C T T A C T
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
Sistem penggolongan darah ABO

Sesuai dg jenis darah ABO maka

ada empat jenis darah:
A, B, AB atau O (nol).
Gol darah ABO

•  Sangat penting pada transfusi darah.

•  Tabel menunjukkan 4 fenotipe ABO (“gol darah") dan the

genotipenya.

Blood Antigens
Group Antibodies in Serum Genotypes
on RBCs

A A Anti-B AA or AO
B B Anti-A BB or BO
AB A and B Neither AB
O Neither Anti-A and anti-B OO
 Penurunan dan genetik ABO
•  Gena ABO adalah autosomal (gena ini tdk terdapat pd
sex chromosome)

•  Lokus gena ABO terdapat pada chromosom 9.

•  Gol A dan B dominan terhadap O

•  Gena gol A dan B co-dominant

•  Setiap orang mempunyai dua kopi gena yg menyandi gol

darah ABO (satu dari ibu dan satu dari ayah)
 Autosomal Chromosome

Allel utk gol darah pada

tempat sama, pada
A chromosome 9. Akan B
tetapi masing-masing
gena menyandi asam
amino berbeda shg
memberikan golongan BAGUS
darah berbeda BB/BO
AYU
AA/AO
Anak akan membawa satu allel dari
Bagus dan satunya dari Ayu.
Kemungkinan genotipe gol darah Ayu-Bagus

Parent A B O
Allele
A

O
Kemungkinan genotipe gol darah anak
BAGUS

Parent A B O
Allele
AYU
A AA AB AO

B AB BB BO

O OA BO OO

Anak AB, AO, OO, BO ??

Mengapa darah gol A tidak pernah diberikan
ke orang gol B?

Memberikan salah gol ABO dapat berakibat fatal.

Antibodi anti-A dalam gol B akan menyerang sel gol A

dan sebaliknya.

•  Darah gol O negatif ?

 Sistem Rhesus (Rh)

Ada antigen lain yg harus diperhatikan antigen Rh.

RBC yg "Rh positif" mengekspresi antigen diberi nama D

85% populasi adalah RhD positif, 15% populasi adalah

RhD negative.

Beberapa orang gol A mempunyai, dan dikelompokan

sebagai A+ ( A positif).

Demikian juga untuk gol B, AB dan O.

Gol darah Rh dan Kecocokan Rh
Seorang dg gol darah Rh- tidak mempunyai antibodi Rh
secara alami dalam plasma

Blood Alleles
Genotype
Type Produced

RR R
Rh positif
Rr R or r

Rh negatif rr r
Ada 8 golongan darah?
•  Seorang dg darah Rh- dapat menghasilkan antibodi
Rh dlm plasma jika dia menerima darah Rh+, antigen
Rh dapat memicu produksi antibodi Rh.

• Seorang dg darah Rh+ dapat menerima darah Rh-.

 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Jenis Polimorfisme DNA

•  RFLP: restriction fragment length

polymorphisms
•  VNTR: variable number tandem repeats (20
to >50 base pairs), minisatelit
•  STR: short tandem repeats (2–8 base pairs),
mikrosatelit
•  SNP: single-nucleotide polymorphisms
 DNA satelit
1.  Dua kelas utama:
a.  DNA satelit: sekuen terulang berurutan (sekitar
10% genom).
b.  DNA terulang berseling (sekitar 5–20% genom),
tersebar pada seluruh genom, dan dibagi:
1)  SINES (short interspersed elements)
merupakan sekuen dg panjang kurang dari 500
bp.
2)  LINES (long interspersed elements) merupakan
sekuen dg panjang lebih dari 500 bp.
2.  Terdapat sekitar sentromer dan juga tersebat
diseluruh genom. belum diketahui fungsinya.
3.  VNTR dan STR
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Restriction fragment-length
polymorphism (RFLP)
–  RFLP merupakan jenis polimorfisme DNA yang
digunakan untuk map genetik
–  Perubahan pada sekuen menyebabkan perubahan
lokus endonuklease (terbentuk lokus pemotongan
atau hilang)
–  RFLP dideteksi dengan pemotongan enzim
endonuklease kemudian dihibridisasi dengan
pelacak berlabel
–  Saat ini: amplikon PCR, dipotong dengan enzim
dan elektroforesis gel agarosa (PCR-RFLP)
Genotyping RFLP’s
 Restriction Fragment Length
Polymorphisms
Adanya RFLP dapat dilihat dari perubahan
ukuran fragmen.
1 2

A B C
The

1 2 Fragments visualized Probe

+ + B +/+ +/- -/+ -/-
+ - (B+C)
- + (A+B)
- - (A+B+C)
Southern blot
Genotype Fragments visualized I II III band patterns
I ++/+- B, (B+C)
II +-/-+ (A+B), (B+C)
III ++/-- B,(A+B+C)
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Variable number of tandem
repeats (VNTR)

–  Sekuen pendek (20-50 nulleotida) terulang dengan jumlah

pengukangan berbeda-beda
–  VNTR muncul terutama karena unequal crossing-over
–  terutama di telomer dan pada daerah hypervariable
–  Deteksi dengan PCR dan elektroforesis, atau hibridisasi atau
dengan elektroforesis kolom
VNTR

Probe
Unequal crossing-over
Aplikasi dari VNTR dan STR
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 STR: Short tandem repeats

–  Sekuen sangat pendek (2-6 nukleotida) terulang

dengan jumlah pengulangan bervariasi
–  Terjadi karena untai salah berpasangan selama
sintesis DNA
–  Terdistribusi luas, saat ini merupakan standar untuk
percobaan mapping
–  Deteksi dengan PCR dan elektroforesis (gel atau
kolom), diotomisasi dengan penanda berfluoresensi
Slipped-strand mispairing
DNA triple repeats – human disease

•  Fragile x syndrome, lemah mental, GCC

•  Hantington’s disease
–  CAG : GLUTAMIN
–  PENDERITA 36 -82 KOPI
 Human Identity Testing with Multiplex STRs

AmpFlSTR® SGM Plus™ kit

DNA Size (base pairs)

D3
amelogenin D8 TH01
D19 VWA D21 D16
Two different individuals

D18 D2
FGA

probability of a random
match: ~1 in 3 trillion Results obtained in less than 5
amelogenin D3
hours with a spot of blood the
size of a pinhead
D19
D8 VWA D16
D21 D18 D2
FGA
TH01

Simultaneous Analysis of 10 STRs and Gender ID

 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
 Single Nucleotide Polymorphism
•  Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), diucapkan
“snip,” merupakan variasi genetika ketika satu
nukleotida (., A, T, C, or G) berubah dan diwariskan.
–  SNP: Variasi satu basa DNA b yg terdapat >1%
–  Mutasi: Variasi satu basa DNA yg terdapat <1%

94% CTTAG CTT 99.9% CTTAG CTT

6% CTTAGTTT 0.1% CTTAGTTT

SNP Mutation
Single nucleotide polymorphism
(SNP)
–  Juga perubahan satu basa, tetapi tidak dikenali
oleh endonuklease
–  SNP terdistribusi luas pada genom, terjadi sekitar
satu dalam 500-1000 bp
–  Untuk ukuran genom manusia 3300 Mb, berati ada
sekitar 4-5 juta SNP pada genom manusia
–  SNP diidentifikasi dengan DNA sekuensing,
hibridisasi spesifik-alel atau ekstensi primer
spesifik-alel.
Why are SNPs Important?
•  Allel gena yg berhubungan dg kesehatan
•  Penanda genetik yg berhubungan dg gena
(dan pd lokus non-transkripsi yg
mempengaruhi kesehatan)
•  Pharmacogenomics
Metode umum untuk SNP genotyping
Amplifikasi alel-spesifik
 Outline
1.  Introduction to DNA polymorphism
2.  Blood type determination
3.  Polymorphisms
a. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
b. Variable Number Tandem Repeat (VNTR)
c. Short tandem repeat (STR)
d. Single nucleotide polymorphism (SNP)
4. Application of Polymorphism
Penggunaan polimorfisme DNA

–  Farmakogenomik
–  Identifikasi individu (sidik jari DNA)
–  Forensik
–  Pemahaman lebih baik tentang mekanisme
penyakit genetik (misal, pengulangan triplet,
delesi atau penyusunan ulang)
Apa hubungan antara polimorfisme DNA
dan “marker genetik”?

–  Marker genetik merupakan suatu karakter yang

dapat ditelusuri dalam suatu keluarga
–  Marker polimorfisme DNA pada germ-line
merupakan marker genetik,
–  DNA juga melakukan perubahan somatik,
polimorfisme seperti itu terjadi pada jaringan
somatik tidak selalu diturunkan: contoh--tumor
1. Pharmacogenomics

•  Penggunaan informasi urutan DNA utk

mengukur/ memperkirakan reaksi obat
terhadap seseorang.

•  Uji klinik lebih cepat

•  Efek samping obat berkurang
 Some Facts and Statistics

•  59% obat yg menyebabkan Adverse Drug

Reaction (ADRs) dimetabolisme oleh enzim
polimorfi
•  Banyak obat yg merupakan substrat enzim
polimorfi
•  Polimorfi terjadi pada transporter, reseptor, dan
berbagai target terapi juga berhubungan dengan
variabilitas interindividual dlm respon obat
 Some Gene Products Interact with Drugs

•  Ada protein yg mengaktifkan obat atau menginaktifasi

•  Ada protein yg dpt langsung menaikkan atau

menghalangi aktifitas obat .

•  Ada gena yg mengatur efek samping obat

 Akibat polimorfisme
metabolisme obat transport obat

Kepekaan thdp kepekaan

Polimorfisme
penyakit reseptor

Adverse Drug Responders/

Reaction Non-responders
 Polymorphic Enzymes

Enzim Cytochrome P450 :

CYP 2D6
CYP 2C19
CYP 2C9
UDP-Glucuronosyl Transferase:
UGT 1A1
TPMT = Thiopurine S-Methyltransferase
CYP2D6 vs dosis Nortriptyline

Normal CYP2D6 : 150 mg/hari

Mutan CYP2D6 : 10-20 mg/hari

Thiopurine-S-Methyltransferase (TPMT)
•  Thiopurine merupakan obat peny kanker
–  Acute lymphoblastic leukemia
•  Enzim TPMT utk memetabolisme
thiopurine
–  azathioprine, mercaptopurine (6-MP)
•  Polimorfisme pada gena TPMT
menurunkan aktivitas enzim TPMT
•  Penurunan aktivitas TPMT dapat
mengakibatkan keracunan obat
Warfarin Metabolism

•  Prevent the formation of

blood clots or to prevent
blood clots from becoming
larger
•  Often prescribed to
patients with irregular heart
beats and after heart
attacks or heart valve
replacement surgery
•  Acts as a vitamin K
antagonist
Warfarin Metabolism (Pharmacokinetics)
•  Jalur utama utk menghentikan efek farmakologi melalui
metabolisme S-warfarin dlm hati oleh CYP2C9

•  CYP2C9 SNPs mengubah metabolisme warfarin:

CYP2C9*1 (WT) – normal—fast metabolism
CYP2C9*2 (Arg144Cys) - low/intermediate
CYP2C9*3 (Ile359Leu) - low

•  Alel CYP2C9 terdapat pada frekuensi alel minor signifikan

Europa: *2 - 10.7% *3 - 8.5 %
Asia: *2 - 0% *3 - 1-2%
Amerika-Africa: *2 - 2.9% *3 - 0.8%
2. STR-PCR
•  Genotip STR diturunkan.

Child’s alleles

Mother’s alleles

Father’s alleles

•  Satu alel diturunkan bapak/ibu.

3. VNTR
4. Deteksi penyakit

Apa hubungannya antara variasi dalam

DNA dan variasi dalam protein?
–  Jika mutasi protein atau polimorfisme, ada perubahan sekuen
DNA
•  Contoh: Hb A/S
–  Jika sekuen DNA berubah, belum tentu berpengaruh pada
urutan protein
•  Perubahan urutan DNA mungkin terjadi pada daerah yang
tidak ditranslasi
•  Walaupun pada daerah yang ditranslasi, perubahan sekuen
tadi masih menghasilkan kodon sinonim
–  <10% perubahan protein menghasilkan perubahan fungsi protein
tsb
4. Deteksi penyakit
GLUTAMAT VALIN

•  Kodon glutamat : GUU, GUC, GUA, GUG

•  Kodon valin : GAA, GAG
•  Pengenalan CvnI :
•  Pengenalan MstII: -CCTNAGG
PCR-RFLP
 Question? Thanks.
adam_apt@ugm.ac.id