PENGUMPULAN SPESIMEN DALAM PEMERIKSAAN HEMATOLOGI DAN

HEMOSTASIS
1. menjelaskan pertimbangan jaminan kualitas yang berhubungan dengan pengambilan
spesimen darah dengan venipuncture, oleh tusukan kulit, dan dari kateter dalam
pemeriksaan hematologi dan hemostasis.
2. menggambarkan tindakan pencegahan yang diperlukan selama spesimen darah
pengolahan dan penanganan untuk memastikan hematologi dan hemostasis hasil tes
yang valid
Pengumpulan

spesimen darah yang tepat adalah langkah pertama dalam

memastikan hasil yang akurat dan dapat diandalkan dari pemeriksaan laboratorium
klinis. Bab ini berfokus pada aspek-aspek pengambilan spesimen darah yang dapat
mempengaruhi validitas hasil pemeriksaan hematologi dan hemostasis. Spesimen
darah untuk pemeriksaan hematologi dapat diperoleh dengan menggunakan metode
venipuncture , oleh tusukan kulit ( kapiler ), atau dari kateter, dengan memperhatikan
pemantapan mutu dari masing-masing metode ini. Terlepas dari metode yang
digunakan , pengumpulan spesimen membutuhkan pengetahuan tentang peralatan
yang diperlukan dan keterampilan teknis, mengutamakan kenyamanan dan
keselamatan pasien dan identifikasi spesimen, kesadaran dan kepatuhan terhadap
persyaratan keselamatan institusional, dan transportasi spesimen serta teknik
pengolahan yang tepat. Pengumpulan spesimen darah , atau proses pengambilan
darah, adalah keterampilan dipraktekkan oleh banyak anggota tim kesehatan termasuk
phlebotomists , teknisi laboratorium klinis, ilmuwan , dokter dan perawat. Istilah
phlebotomist yaitu setiap individu yang melakukan tindakan pengambilan darah dan
bertanggung jawab terhadap proses pengumpulan spesimen darah tersebut.
Kewaspadaan universal harus diikuti ketika mengumpulkan dan memproses semua
spesimen darah. semua phlebotomists harus mematuhi dan menjalankan tindakan
pencegahan ini.
PENGAMBILAN SPESIMEN DARAH DENGAN VENIPUNCTURE
Teknik yang paling umum digunakan untuk mendapatkan spesimen darah
adalah venipuncture. Bagian ini akan membahas tentang peralatan dan anti koagulan
yang digunakan dalam venipuncture, prosedur, dan hal-hal yang mempengaruhi
kualitas hasil pemeriksaan.
Peralatan

Pengumpulan specimen dengan system tabung evacuated .pengumpulan specimen

yang paling rutin digunakan adalah dengan menggunakan tabung kaca evacuated atau
tabung pengumpul terbuat dari plastik, dengan jarum yang lancip dan miring di kedua
ujungnya, dan pemegang jarum (lihat Gbr.2-1). Tabung evacuated (tidak mengandung
air) sehingga ketika sumbat karetnya ditusuk, darah secara otomatis tertarik ke dalam
tabung. Beberapa ukuran tabung evacuated yang tersedia, dan pemegangnya dalam
berbagai ukuran untuk mencocokkan diameter tabung yang digunakan. Sebagian
besar laboratorium, menggunakan tabung evacuated yang berukuran 5 atau 7 ml
untuk pengumpulan spesimen darah orang dewasa. Namun untuk pasien anak
umumnya digunakan tabung ukuran (2-3ml) biasanya cukup mengandung darah atau
serum untuk memenuhi sebagian persyaratan untuk pemeriksaan dan akan
mengurangi jumlah darah yang diambil dari orang dewasa sebesar 40% sampai 45%
jika mereka digunakan untuk dewasa pasien. Tabung bisa bebas dari zat aditif atau
dapat juga mengandung aditif yang berfungsi sebagai antikoagulan, pengawet,
penguat koagulasi, atau sebagai fasilitator untuk memisahkan sel dari serum atau
plasma. Zat aditif specific yang terkandung dalam tabung ditunjukkan dengan warna
stopper karet (lihat tabel 2-1). Informasi label tabung harus diperiksa dalam berbagai
situasi di mana warna stopper tabung yang sama mungkin mengandung aditif yang
berbeda. Tabung evacuated sebaiknya tidak digunakan setelah tanggal kadaluwarsa
yang tertera,udah lewat masa nya mungkin dapat kehilangan kekuatan vaccum atau
efektivitas aditifnya. Tabung untuk prosedur khusus juga tersedia (misalnya, tabung
khusus untuk Westergren penentuan laju endap darah;. Bab.9)
TINDAKAN PENCEGAHAN BAHAYA BIOLOGIS
Perhatian khusus diperlukan untuk menghindari resiko infeksi dari berbagai
patogen pada semua aspek dari praktik laboratorium serta prosedur keselamatan kerja,
yang dijelaskan dalam bab 24, hal ini harus dilakukan saat pengambilan darah.
Operator harus mengenakan plastik disposibel atau sarung tangan karet sekali pakai.
Diharapkan juga untuk memakai pelindung apron atau gaun, serta jika diperlukan
menggunakan kacamata pelindung. Sikap waspada diperlukan untuk mencegah
cedera, terutama ketika menggunakan jarum suntik, jarum dan lancet. Jarum suntik,
jarum dan lancet yang telah digunakan tidak boleh digunakan kembali. Peralatan yang
bersifat re-usable harus disterilisasi setelah digunakan (Lihat Bab 24 dalam buku
Practical Haematology).

METODE SYRINGE (JARUM SUNTIK)

Pengumpulan spesimen darah dengan menggunakan jarum suntik melibatkan
penggunaan plastik atau kaca jarum suntik dan jarum yang diproduksi khusus untuk
digunakan dengan jarum suntik. jarum suntik kaca harus dihindari karena koagulasi
terinisiasi ketika kontak darah permukaan kaca diobati. Penggunaan jarum suntik
memungkinkan phlebotomist untuk mengontrol jumlah tekanan yang dibutuhkan
untuk mengeluarkan darah dari vena. ini sangat membantu dalam sulit untuk menarik
pasien atau pasien anak-anak atau dalam kasus-kasus ketika pembuluh darah kecil
harus digunakan. ukuran jarum suntik terkecil harus digunakan untuk volume
spesimen darah yang diperlukan untuk menghindari tekanan yang berlebihan. Selain
runtuh pembuluh darah, tekanan yang berlebihan dapat menyebabkan hemolisis,
sehingga menghasilkan spesimen darah yang tidak dapat diterima. Untuk koleksi
anak, jarum suntik 3ml atau tuberkulin dapat digunakan.
Jarum
pemilihan ukuran jarum tergantung pada ukuran dan kedalaman dari vena
pasien dan jumlah darah yang bisa ditarik. jarum ditunjuk oleh
yang mengacu pada diameter dalam, atau bore jarum dan

nomor

gauge,

panjang. misalnya, jarum

21G1 memiliki sejumlah ukuran dari 21 dan 1 inci panjangnya dari ujung jarum
penyisipan ke dalam tabung jarum suntik. semakin tinggi gauge, diameter lebih kecil.
jarum yang are19 -23 mengukur biasanya digunakan untuk venipuncture rutin; 20 -22
jarum pengukur yang paling sering digunakan untuk orang dewasa, sedangkan

23

ukuran jarum dapat digunakan untuk vena pediatrik atau sulit. penggunaan jarum
pengukur

tinggi

telah

dilaporkan

sebagai

penyebab

hemolisis

selama

venipuncture. Spesimen hemolyzed tidak bisa diterima untuk hematologi dan

sebagian besar uji laboratorium lain.
Ukuran panjang jarum yang dipilih adalah preferensi individu. panjang
yang paling sering digunakan adalah 1 dan 1,5 inci. Jarum pendek lebih
Untuk mengontrol dan menyebabkan kecemasan kurang sabar.

Untuk

mudah
sistem

tabung dievakuasi, jarum yang tersedia untuk koleksi sampel tunggal dan multi. jarum
sampel multi-harus digunakan jika

lebih dari satu tabung darah perlu dikumpulkan

untuk mencegah kebocoran darah ke pemegang jarum selama perubahan tabung.

jarum sampel tunggal atau kupu-kupu (bersayap infus set) jarum yang

diproduksi

khusus untuk jarum suntik. adapter juga tersedia yang memungkinkan jarum kupukupu untuk digunakan dengan standar tabung koleksi dievakuasi dan pemegang (lihat
gambar 2-1 dan 2-2). Pengaturan ini meningkatkan kontrol selama venipuncture sulit
dan

memungkinkan pengisian langsung dari tabung pengumpul.

Antikoagulan
Ketika darah dikumpulkan dalam tabung kaca tanpa aditif, koagulasi biasanya
terjadi dan serum dapat dipisahkan dari sel darah dengan sentrifugasi berikutnya.
Namun, beberapa pemeriksaan laboratorium, termasuk yang dilakukan di
hematologi.

Memerlukan darah utuh atau plasma, dalam hal antikoagulan

harus tercampur

langsung dengan darah untuk mencegah pembekuan.

Antikoagulan yang

paling umum digunakan untuk prosedur hematologi adalah

asam ethylenediaminetetraacetic (EDTA), natrium sitrat, dan heparin. Konsentrasi

yang tepat dari antikoagulan untuk volume darah diambil sangat penting, Dan
kesalahan yang signifikan dapat terjadi jika rasio darah ke antikoagulan tidak
benar.
EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
Garam kalium dari EDTA adalah antikoagulan yang paling umum digunakan
dalam hematologi. Pembekuan darah dihambat oleh chelation atau mengikat ion
kalsium. Konsentrasi antikoagulan optimal adalah 1,5 mg / ml darah (lihat tabel
2). Jumlah ini tidak

memiliki

efek

buruk

pada

jumlah

sel

rutin

2dan

mempertahankan morfologi sel ketika film darah dibuat dalam waktu 2 jam dari
koleksi. Perlu dicatat bahwa mungkin ada tabung di pasar dengan lebih rendah,
konsentrasi EDTA tidak dapat diterima. di

sisi lain, EDTA berlebihan menginduksi

sel darah merah (RBC) penyusutan, menyebabkan nilai hematokrit dan laju endap
darah menjadi palsu menurun. EDTA mencegah agregasi platelet dan karena
adalah antikoagulan pilihan untuk jumlah

itu

trombosit. Itu bukan antikoagulan

yang memuaskan untuk pengujian koagulasi karena menghambat reaksi fibrinogentrombin dan faktor V tidak stabil dalam kehadirannya

Natrium Sitrat

antikoagulan pilihan untuk kebanyakan pengujian hemostasis trisodium sitrat . plasma

sitrat mempertahankan labil faktor pembekuan V dan VIII lebih baik daripada
antikoagulan lain untuk studi agregasi platelet . spesimen plasma sitrat juga lebih
sensitif terhadap efek heparin dan karena itu lebih disukai untuk tes untuk memantau
terapi heparin . di masa lalu , baik natrium sitrat dan natrium oksalat digunakan
sebagai antikoagulan untuk pengujian hemostasis . keduanya menghambat koagulasi
dengan mengikat kalsium terionisasi , tetapi ketika oxalated plasma recalcified dalam
sistem tes, kompleks larut atau endapan yang terbentuk yang dapat mengganggu
deteksi titik akhir oleh instrumen yang mengukur perubahan densitas optik . untuk
alasan ini sodium oksalat tidak dianjurkan untuk pengujian hemostasis . natrium sitrat
tersedia dalam konsentrasi 3,2 % ( 0109 M ) OR 3,8 % ( 0129 M ) dalam tabung
koleksi dievakuasi . rasio darah ke antikoagulan sitrat sangat penting untuk hasil tes
koagulasi valid. rasio standar sembilan bagian dari darah ke salah satu bagian dari
antikoagulan ( 9:1) . rasio ini memuaskan untuk spesimen dengan jumlah yang relatif
meningkat dari sitrat terikat dalam campuran sitrat - plasma menyebabkan
perpanjangan palsu kali pembekuan , terutama untuk waktu protrombin ( PT ) dan
waktu tromboplastin parsial ( PTT ) tes . hal ini terjadi karena jumlah standar kalsium
digunakan untuk recalsify plasma dalam prosedur ini tidak memadai untuk
menonaktifkan sitrat terikat berlebihan selain memulai pembekuan spesimen.
HEPARIN
Heparin adalah mukopolisakarida asam yang bertindak dengan antitrombin III
dan

menghambat reaksi dari semua protease serin koagulasi . konsentrasi optimal

adalah 15 sampai 20 U / ml darah . Heparin tidak memuaskan untuk film darah

preparationecause menyebabkan distorsi morfologi trombosit dan leukosit . di
samping . sebuah colorition kebiruan di latar belakang film bernoda darah dengan
noda Romanowsky akan terjadi karena pH -nya . heparin adalah antikoagulan pilihan
untuk uji kerapuhan osmotik jika darah defibrinated tidak digunakan dan untuk uji
retensi paltelet . Namun , darah heparinized tidak boleh digunakan untuk studi
koagulasi karena heparin ini efek penghambatan pada trombin . heparin juga dapat
menyebabkan kesalahan dalam menghitung sel otomatis . misalnya , trombosit dari
beberapa

individu

akan

mengaglutinasi

Pertimbangan Pemantapan Mutu venipuncture

di

hadapan

heparin

1) Pantangan puasa
tidak diperlukan untuk prosedur hematologi rutin , namun perlu dicatat bahwa film
darah yang terbuat dari darah yang diambil dari orang tak lama setelah ia telah makan
lemak akan memiliki lubang kecil di seluruh film yang disebabkan oleh kilomikron
2) Prosedur Persiapan Pasien
proses mengeluarkan darah menyebabkan stres dan kecemasan pada banyak pasien ,
yang dapat mengubah nilai-nilai uji laboratorium tertentu termasuk ketinggian sel
darah putih ( WBC ) count. Phlebotomist karena itu harus berusaha untuk meredakan
ketakutan tersebut dengan berkomunikasi dengan pasien secara tenang,

profesional

, dan meyakinkan . kepercayaan pasien dapat diperoleh dengan meminta

kerjasama.

bila memungkinkan. pasien harus diyakinkan bahwa meskipun tusukan itu

sendiri

mungkin

sedikit

menyakitkan,

itu

akan

menjadi

lebih

cepat.

Posisi pasien
Posisi pasien harus dicatat pada permintaan karena nilai caount darah dapat bervariasi
tergantung pada apakah pasien duduk atau berbaring. misalnya, hematokrit dapat
menurun rata-rata 8% karena hemodelution ketika seorang pasien berbaring.
sebaliknya, ketika seorang pasien turun dari tempat tidur, hemokonsentrasi terjadi.
jenis yang sama ini variasi terjadi dengan jumlah WBC.
Pemilihan lokasi
Secara umum vena dari fossa antecubital akan digunakan untuk venipuncture rutin.
ketika memilih situs, beberapa faktor harus dipertimbangkan. Daerah dengan
hematoma, luka bakar, bekas luka, atau edema harus dihindari. koleksi dari pembuluh
darah di lengan di sisi mana mastektomi dilakukan adalah kontraindikasi karena
kemungkinan lymphostasis. Jika seorang pasien yang menerima infus (iv) infus,
spesimen harus diambil dari lengan yang berlawanan. Situasi tertentu dapat
menghalangi koleksi dari lengan yang berlawanan. dalam situasi seperti ini, darah
harus diambil di bawah situs iv dari vena selain satu dengan garis iv dan setelah
cairan iv telah dihentikan selama 2 menit. Penghentian iv hanya boleh dilakukan oleh
perawat pasien atau dokter. 5 ml darah harus dikumpulkan dan dibuang sebelum
pengambilan spesimen untuk menghindari potensial pengenceran sampel dengan
cairan iv. bukti menunjukkan bahwa spesimen darah dapat diterima untuk hematologi
dan profil biokimia serum untuk semua analit kecuali glukosa dan fosfor dapat ditarik

di bawah garis iv selama infus atau dari jarum iv setelah infus iv telah dihentikan
selama 2 menit dan sejumlah kecil darah pertama dibuang. Pada semua kasus ketika
mengambil spesimen dari bawah situs iv, phlebotomist harus mematuhi prosedur yang
direkomendasikan oleh laboratorium individu. Dari sisi mana spesimen diambil harus
dicatat pada formulir tes permintaan, Vena yang sulit untuk menemukan dapat dibuat
lebih menonjol dengan lembut memijat lengan dari pergelangan tangan ke siku

dan

pemanasan atau menekan situs tusukan. Tangan yang kuat memompa oleh pasien,
namun dapat mengakibatkan hemokonsentrasi dan harus dihindari.
Penggunaan Tourniquet
Beberapa bentuk torniket tersedia. yang paling umum digunakan adalah pice lentur
lateks datar. torniket velcro, seraket, dan manset tekanan darah adalah jenis
tambahan. Yang seraket (Propper perusahaan manufaktur, inc, long island, NY)
terbuat dari kain dan dijamin menggunakan sabuk pengaman seperti alat (gambar 21). Hal ini memungkinkan phlebotomist untuk sebagian melepaskan tekanan
vena, mencegah hemokonsentrasi, tanpa mengeluarkan tourniquet dari lengan
pasien. Tourniquet dapat dengan mudah diperketat jika diperlukan. Tourniquet tidak
boleh dibiarkan selama lebih dari 1 menit karena penggunaan yang terlalu lama
dapat menyebabkan hemokonsentrasi dan peningkatan aktivitas fibrinolitik. Jika
tourniquet yang tersisa di lengan selama lebih dari 1 menit ketika menemukan
vena, itu harus dihapus dan diterapkan kembali setelah 2 menit telah berlalu.
untuk menghindari aplikasi yang berkepanjangan, boleh dilakukan pengulangan
kembali tourniquet hanya setelah situs tersebut telah dibersihkan dan hanya sebelum
penyisipan jarum. Selama pengumpulan tourniquet harus dihapus sesegera mungkin
setelah aliran darah yang memadai ke dalam perangkat koleksi telah ditetapkan.

Aseptik sisi venipuncture

Sisi venipuncture harus dibersihkan secara menyeluruh dengan alkohol persiapan pad
komersial atau bola kapas atau kasa direndam dalam 70% isopropanol.
Mengeringkan area dengan kasa steril atau dengan udara. Sisa alkohol di lokasi
venipuncture, selain dapat menyebabkan rasa sakit pada pasien, juga dapat
menyebabkan hemolisis.
Pengumpulan Spesimen

Tabung pengumpul evacuated biasanya tidak akan mengisi sepenuhnya, sehingga

sebagian terisi kecil tetap. Namun, tabung harus diisi sebanyak vakum mereka
memungkinkan untuk menghindari rasio yang tidak tepat darah ke aditif. Tabung
dievakuasi mengandung antikoagulan atau addtives lain harus dicampur segera
(terutama jika K2EDTA digunakan) setelah pengangkatan dari pemegang atau setelah
mengisi dengan jarum suntik dengan lembut inversi 5 sampai 10 kali. Jika beberapa
tabung dikumpulkan, satu tabung bisa dicampur sementara yang lain hanya diisi
dengan

darah.

Tidak

mencampur

atau

kocok

kuat-kuat

karena

dapat

menyebabkan hemolisis. Ketika mengumpulkan beberapa tabung, penting untuk

melakukannya dalam urutan yang benar. urutan sebagai berikut. urutan berikut ini:
1) tabung kultur darah steril
2) tabung nonadditive
3) tabung yang berisi antikoagulan (mengumpulkan spesimen sitrat pertama diikuti
oleh

heparin,

EDTA,

dan

Oksalat

atau

fluoride

studi telah menyarankan bahwa urutan menarik dari beberapa tabung aditif ini penting
karena aditif dalam satu tabung dapat mencemari spesimen dikumpulkan ke dalam
tabung aditif berikutnya. sumber kesalahan di venipunctures diringkas dalam tabel 2-3
Bila menggunakan jarum suntik pertimbangan dasar yang sama seperti untuk metode
tabung dievakuasi berlaku. Namun, darah harus ditransfer dari syiringe ke tabung
dievakuasi. untuk non-hemostasis menguji jarum suntik dengan

hati-hati

dimasukkan melalui tabung stopper, memungkinkan vakum untuk mengambil darah

perlahan-lahan ke dalam tabung.
Tabel. 2-3
Sumber Kesalahan Dalam Venipuncture
1 . kesalahan dalam persiapan venipuncture
- Identifikasi pasien yang tidak benar
- Kegagalan kepatuhan pasien terhadap pembatasan diet
- Tidak menenangkan pasien sebelum pengumpulan darah
- Penggunaan peralatan yang tidak tepat dan persediaan
- Metode tidak pantas pengumpulan darah
2 . kesalahan dalam prosedur venipuncture
- tidak mengeringkan area tusukan setelah membersihkan

dengan alkohol
- Jarum bevel menyisipkan sisi
- Penggunaan jarum yang terlalu kecil, menyebabkan hemolisis
- Venipuncture di area yang tidak diperbolehkan (ex: diatas iv)
- berkepanjangan aplikasi tourniquet
- salah order tabung draw
- tidak mencampur darah dalam tabung berisi aditif segera
- Menarik kembali jarum suntik plunger terlalu tegas
- tidak melepaskan tourniquet sebelum penarikan jarum
3 . kesalahan setelah venipuncture selesai
- Kurang penekanan ke area bekas venipuncture
- Getaran kuat dari anticoagulan spesimen darah
- Memaksa darah melalui jarum suntik ke tabung
- Mislabeling tabung
- Kesalahan pelabelan yang tidak preventif penyakit menular
- Kesalahan input tanggal, waktu , dan inisial pada permintaan
- Transportasi lambat spesimen ke laboratorium

Darah tidak harus dipaksa melalui jarum suntik karena hal ini dapat menyebabkan
hemolisis. Jika tabung non dievakuasi digunakan, jarum suntik dan tabung cap
dikeluarkan dan darah dibiarkan mengalir perlahan di sisi tabung. karena ada
apotensial untuk aktivasi koagulasi dalam jarum suntik, urutan mengisi tabung
dievakuasi setelah koleksi jarum suntik berbeda dari yang diikuti ketika mengisi
tabung langsung menggunakan jarum dan dudukan. Dalam kasus terakhir, perangkat
pengumpulan kultur darah diisi pertama diikuti dengan antikoagulan yang
mengandung tabung dalam urutan yang tercantum di atas. Akhirnya, mengisi setiap
tabung non antikoagulan yang mengandung yang akan diproses untuk koleksi serum.

PENGUMPULAN SPESIMEN METODE TUSUKAN KAPILER

Pertimbangan Jaminan Kualitas - Tusukan Kapiler

Darah vena lebih disukai untuk kulit atau spesimen kapiler tusukan untuk sebagian
besar tes hematologi. Namun, ada beberapa situasi di mana tusukan kulit harus
digunakan untuk mendapatkan spesimen darah. bayi, terutama borns baru, memiliki
volume darah lebih kecil dibandingkan orang dewasa, menggambar darah dengan
venipuncture rutin setiap hari dapat dengan cepat menyebabkan anemia rumah sakitdiinduksi. tusuk kulit juga merupakan sarana yang jauh lebih aman pengumpulan
darah. venipuncture seringkali sulit dan bahkan berbahaya bila dilakukan pada anak-a
nak sangat kecil dan bayi. untuk orang dewasa, tusuk kulit mungkin diperlukan karena
obesitas, luka bakar, atau pembuluh darah yang sangat kecil atau rusak parah, atau
ketika cairan iv mengalir ke satu-satunya vena diakses. tusuk kulit juga digunakan
untuk menyimpan pembuluh darah pasien yang menerima kemoterapi dan pada orang
tua bila memungkinkan. darah yang dikumpulkan oleh tusukan kulit merupakan
campuran dari kapiler, vena, dan darah arteri dan juga berisi interstitial dan cairan
intraseluler, oleh karena itu, nilai-nilai laboratorium diperoleh mungkin berbeda dari
yang diperoleh pada spesimen vena. misalnya, jumlah eritrosit, hematokrit,
hemoglobin, dan platelet yang rendah pada tusukan kulit harus dicatat pada daftar
permintaan. mengacu pada referensi standar untuk prosedur yang tepat
Sumber Kesalahan
Spesimen hemolyzed merupakan sumber umum kesalahan, terutama dalam spesimen
darah yang diperoleh dari tusukan kulit bayi. eritrosit bayi lebih rentan dibandingkan
orang dewasa, dan nilai-nilai hematokrit mereka jauh lebih tinggi, sehingga risiko
hemolisis agak lebih besar. sumber penting lainnya dari kesalahan termasuk
kegagalan untuk mengeringkan situs sepenuhnya setelah membersihkan dengan
alkohol, tusukan kulit terlalu dalam, kegagalan untuk menghapus penurunan pertama
darah, memijat kuat atau memerah susu dari daerah menyebabkan hemolisis, dan
menangkap disengaja gelembung udara dalam tabung kapiler atau unopette (Becton
dickinson, rutherford, NJ) pipet yang digunakan untuk pengumpulan jumlah spesimen
yang tepat (misalnya, untuk menghitung trombosit) aliran darah yang memadai untuk
pengumpulan volume spesimen yang diperlukan. meremas berlebihan bisa
mencairkan spesimen, dengan cairan jaringan sehingga hasil tes tidak valid. juga
harus berhati-hati untuk menggunakan lanset tidak lebih dari 2,4 mm untuk tusukan
tumit

bayi

untuk

menghindari

risiko

osteomyelitis

sejumlah perangkat yang tersedia saat ini yang memungkinkan jumlah yang lebih

besar dari darah kapiler yang akan dikumpulkan yang dapat dengan mudah
dikumpulkan dalam tabung kapiler atau Unopettes; ini termasuk microtainer dan
microvette, capiject dan samplette. perangkat ini mungkin aditif bebas atau
mengandung aditif mirip dengan tabung koleksi dievakuasi. saat menggunakan
perangkat ini sangat penting untuk mengikuti petunjuk produsen tepat untuk mengisi
volume maksimum dan minimum dan pencampuran. jika instruksi ini tidak diikuti,
hasil tes kemungkinan akan berubah karena rasio yang tidak tepat aditif untuk
spesimen atau antikoagulan tidak efektif

urutan imbang juga penting whe

mengumpulkan spesimen oleh punture kulit. spesimen untuk jumlah trombosit

pengguna harus dikumpulkan terlebih dahulu. film darah perifer dapat dilakukan
berikutnya, jika diperlukan, diikuti dengan pengisian perangkat antikoagulan
mengandung. EDTA anticoagulated tabung harus diisi terlebih dahulu, diikuti dengan
tabung antikoagulan lain yang mengandung. kontainer yang akan diproses untuk
koleksi serum harus diisi lalu.

PENGAMBILAN SPECIMEN DARI kateter

Phlebotomist paling tidak mengumpulkan sediaan darah dari kateter berdiamnya.
Namun, phlebotomist harus menyadari tuntutan khusus untuk koleksi tersebut untuk
membantu anggota lain dari tim kesehatan memberikan laboratorium dengan
spesimen yang cocok . umumnya volume tertentu darah harus dibuang (volume
buangan ) sebelum mengisi tabung spesimen .
penelitian telah menunjukkan perubahan yang signifikan dalam hasil tes hematologi
ketika volume membuang kurang dari jumlah yang optimal dianjurkan. hematokrit
secara signifikan lebih tinggi dan lebih rendah ketika WBC menghitung volume
membuang kurang dari empat kali kateter volume ruang mati. Dalam hasil studyPTT
lain inversly sebanding dengan membuang volum dihapus dari jalur arteri heparinized
.

volume membuang tergantung pada panjang dan diameter kateter. Mengumpulkan

darah dari kateter untuk spesimen hemostasis tidak dianjurkan. Namun jika itu tidak
dapat dihindari, mungkin perlu untuk membuang sebanyak 30 ml, terutama jika
waktu trombin pembekuan ( Bab.49 ) akan ditentukan.
PENGUMPULAN SPESIMEN UNTUK PEMERIKSAAN KOAGULASI

Pertimbangan Pemantapan Mutu

Bagian ini berfokus pada aspek proses mengeluarkan darah yang secara khusus
berlaku untuk mendapatkan dan memproses spesimen darah untuk hemostasis.
Venipuncture nontraumatic adalah tujuan setiap saat spesimen darah yang
dikumpulkan, tetapi penting untuk mendapatkan hasil yang valid dari pengujian
hemostasis. Perhatian utama adalah penghapusan aktivasi prematur dari proses
koagulasi sebelum spesimen dapat dievaluasi dalam prosedur pengujian tersebut.
penyebab aktivasi tersebut termasuk kontaminasi spesimen dengan tromboplastin
jaringan, kontainer, suhu yang tidak tepat, dan hemolisis.
Tromboplastin jaringan adalah gumpalan-mengaktifkan zat ampuh ditemukan dalam
cairan yang melarikan diri dari sel terluka dan ruang jaringan. ketika jaringan
mengalami trauma atau pembuluh darah terganggu atau dipotong, zat ini
mengaktifkan koagulasi jalur ekstrinsik (chap.47) dan menyebabkan hasil tes
erronous. bahkan sedikit kontaminasi dengan tromboplastin jaringan sudah cukup
untuk mempengaruhi hasil. hemolisis adalah pelepasan hemoglobin dari sel darah
merah pecah ke dalam plasma. sel darah merah hemolyzed bertindak seperti
tromboplastin jaringan untuk mengaktifkan faktor pembekuan plasma. ketika
hemolisis terjadi dalam darah, masalah teknis dengan proses pengumpulan biasanya
penyebabnya. efek permukaan kaca pada hemostasis yang terkenal. faktor kontak
(prekalikrein-fletcher, XII dan XI) diaktifkan prematur melalui kontak dengan kaca,
menyebabkan pemendekan waktu koagulasi tes yang digunakan untuk menilai baik
intrinsik dan ekstrinsik koagulasi jalur. bahan dianjurkan untuk mengumpulkan,
mengangkut, dan menyimpan spesimen darah untuk pengujian hemostasis adalah
plastik, polystyrene, atau kaca berlapis silicon.
Venipuncture yang buruk dapat menyebabkan hasil tes yang salah. Fakta bahwa
darah yang diperoleh dengan teknik pengumpulan yang salah, sering tidak
memuaskan untuk studi biokimia atau sitologi dapat menyebabkan phlebotomist
untuk percaya bahwa hal yang sama berlaku untuk studi untuk pembekuan darah .
idealnya , seseorang yang akrab dengan tes koagulasi harus mendapatkan darah untuk
studi pembekuan , atau anggota dari laboratorium koagulasi harus mengawasi koleksi.
Pilihan lain akan mengambil darah tersebut secara terpisah daripada sebagai bagian
dari koleksi besar untuk tes lainnya . karena pendekatan ini sering tidak praktis , dapat
diterima untuk spesimen untuk pengujian koagulasi yang bisa ditarik oleh personel

terlatih dan sebagai bagian dari kelompok spesimen asalkan standar dan pedoman
untuk koleksi tersebut khusus diikuti . disarankan agar darah kapiler dihindari untuk
metode tradisional pengujian koagulasi . kadang-kadang Namun , hanya darah kapiler
dapat diperoleh dari pasien . tes PT dilakukan pada darah seperti mungkin dapat
diandalkan disediakan spesimen diperoleh dengan cepat dan antikoagulan
immediatelly . kemajuan terbaru dalam pengujian perangkat samping tempat tidur
memungkinkan penggunaan spesimen tusuk kulit untuk pengujian koagulasi . saat
menggunakan perangkat ini petunjuk dari produsen harus diikuti
Oklusi vena atau stasis dapat terjadi selama pengumpulan spesimen jika tourniquet
diterapkan terlalu ketat atau untuk jangka waktu (lebih dari 1 menit). ketika aliran
arteri atau aliran balik vena terganggu, ada aktivasi sistem fibrinolitik dan faktor
pembekuan. untuk meminimalkan stasis tersebut dan hemokonsentrasi yang juga
berkembang, tourniquet harus dibebaskan segera setelah vena yang dimasukkan dan
darah mulai mengalir ke perangkat koleksi,
Peralatan
Banyak jenis torniket dapat digunakan, tetapi karena peningkatan stasis adalah
kekhawatiran, yang tourniquet seraket (lihat di atas dan ara 2-1) atau sejenis
perangkat dianjurkan. penggunaan ukuran jarum yang tepat adalah penting, amall
jarum pengukur yang lebih mungkin menyebabkan hemolisis. ketika mengumpulkan
darah untuk tes koagulasi, jarum 20-gauge ini paling sering digunakan, tetapi ketika
lebih dari 20 ml darah yang akan ditarik, a 19 - gauge jarum dapat preffered. untuk
pasien anak atau orang-orang dengan pembuluh darah kecil, ukuran yang lebih kecil
(21 gauge) mungkin dipilih. jarum harus dari jenis sekali pakai dan dilapisi dengan
silikon polimer. jarum ini membuat penetrasi kulit dan masuk vena halus dengan rasa
sakit yang minimal, trauma, atau aktivasi faktor koagulasi. spesimen untuk tes
koagulasi harus dikumpulkan dalam tabung dievakuasi dilapisi silikon atau suntik
plastik untuk meminimalkan efek dari aktivasi kontak koagulasi. tabung dievakuasi
dilapisi silikon yang mengandung sitrat antikoagulan trisodium dapat digunakan
setiap kali sitrat plasma diperlukan.
Pengumpulan sampel

Venipuncture cepat bersih mencegah tromboplastin jaringan atau udara masuk

spesimen. jika ada kesulitan dalam melakukan venipuncture itu, upaya harus
dibatalkan, situs baru harus digunakan. untuk tes koagulasi umum seperti tes PT dan
PTT, koleksi tabung dievakuasi rutin memuaskan selama kontaminasi dengan cairan
jaringan dihindari. darah untuk pengujian koagulasi tidak boleh tabung pertama
dikumpulkan karena tromboplastin jaringan dari tusukan awal dapat mencemari
spesimen dan membatalkan hasil koagulasi. jika hanya tes koagulasi yang
diperintahkan, "teknik dua Syring" dijelaskan di bawah ini dianjurkan.
Teknik 2 spuit
Metode dua jarum suntik koleksi darah meminimalkan pengenalan tromboplastin
jaringan spesimen. istilah ini mengacu pada praktek menggambar sejumlah kecil
darah ke dalam jarum suntik atau tabung dievakuasi dan perubahan untuk jarum
suntik kedua atau tabung dievakuasi ditentukan untuk tes koagulasi yang akan
dilakukan. ini bilasan jarum cairan jaringan yang mungkin telah diperkenalkan selama
venipuncture tersebut. Jarum kupu-kupu dianjurkan bukannya pakai standar karena
penggunaan jarum kupu-kupu kurang cenderung mengakibatkan penghapusan
disengaja jarum dari vena saat beralih perangkat pengumpulan. penggunaan jarum
kupu-kupu juga dianjurkan ketika darah harus ditarik langsung ke jarum suntik yang
mengandung antikoagulan atau beberapa solusi beracun lainnya, seperti formalin
digunakan dalam beberapa prosedur untuk mengevaluasi hiperaktif platelet. Pipa
panjang yang menghubungkan mencegah infus disengaja solusi tersebut ke dalam
vena, fasilitas prosedur dan mengurangi pissibility disengaja tusukan jarum untuk
phlebotomist.
Prosedur menggunakan tabung dievakuasi
Untuk spesimen koagulasi, sistem dievakuasi pengumpulan darah adalah lebih baik
untuk jarum suntik karena darah berjalan langsung dari vena ke tabung dan segera
dicampur dengan antikoagulan, sehingga mengurangi kemungkinan spesimen beku
(gbr. 2-2). Ini merupakan faktor penting ketika mengumpulkan darah untuk
pemeriksaan hemostatik yang mencakup evaluasi trombosit dan faktor pembekuan
dan

memerlukan sebanyak 30 sampai 50 ml darah. jika spesimen untuk pengujian

selain hemostasis yang diperlukan, urutan disarankan menarik untuk tabung

dievakuasi dibahas sebelumnya harus diikuti. Luer adaptor multi-sampel (fig 2-1)

harus digunakan. setelah jarum masuk vena, tourniquet

dibersihkan dari tromboplastin jaringan dengan

dilepaskan

dan

sistem

menggambar 5 ml darah ke

dalam tabung dievakuasi non-aditif. darah ini dapat digunakan untuk tes lain yang
membutuhkan serum, atau mungkin dibuang. spesimen

untuk

tes

membutuhkan palsma citrated diambil berikutnya. Jika tes fungsi platelet

yang
yang

diperintahkan, bevel jarum masih dalam vena, pipa yang terjepit untuk
menghentikan aliran darah, pemegang jarum dan Luer adaptor dikeluarkan dari
adaptor kupu-kupu tabung, dan jarum suntik plastik terpasang. Darah ditarik ke dalam
jarum suntik ini dan dibagikan ke tabung yang sesuai.
Prosedur menggunakan jarum suntik
Ketika spesimen yang sedang ditarik langsung ke jarum suntik, tourniquet dilepaskan
dan sekitar 5 ml darah ditarik ke dalam jarum suntik pertama setelah vena
dimasukkan. sebelum jarum suntik yang diaktifkan, kasa steril ditempatkan di bawah
hub jarum untuk menyerap darah yang mungkin melarikan diri. Dengan jarum di
pembuluh darah, jarum suntik pertama dengan hati-hati terlepas dari jarum dan
diganti dengan jarum suntik kedua. Untuk pengujian koagulasi darah yang masuk ke
dalam alat suntik ini dan ditransfer segera ke dalam tabung yang sesuai.
untukmenghindari gelembung udara dan buih dari spesimen, jarum harus aman fifted
pada jarum suntik. Ketika darah sedang disedot dengan jarum suntik, plunger harus
ditarik pada tingkat yang sama dengan aliran darah. Jika angka ini lebih dari yang
dibutuhkan untuk aspirasi darah, gelembung udara akan masuk jarum suntik dan
menyebabkan hemolisis. Aspirasi dipaksa juga dapat menyebabkan pembuluh darah
runtuh dan mengakibatkan pelepasan tiba-tiba gas dari sel darah merah, juga
mengakibatkan hemolisis. karena ada risiko memerciki darah menggunakan teknik
ini, pelindung wajah dianjurkan.
Memindahkan Dan Pencampuran Spesimen
Untuk menghindari buih dan hemolisis dari spesimen, darah tidak boleh dikeluarkan
melalui jarum. segera setelah venipuncture selesai, jarum harus aman dan hati-hati
dihapus dari jarum suntik. darah secara perlahan diusir ke dalam tabung koleksi
dengan memungkinkan untuk lari ke sisi tabung. spesimen dipindahkan ke tabung
yang mengandung antikoagulan harus tutup dan dengan hati-hati dicampur dengan
lembut membalik tabung 5 sampai 10 kali. darah diambil langsung ke tabung

dievakuasi sebagian dicampur dengan antikoagulan ketika darah memasuki tabung,

tetapi untuk memastikan pencampuran yang menyeluruh, tabung harus lembut
terbalik 5 sampai 10 kali segera setelah pengangkatan dari pemegang jarum.
Pengolahan Dan Penyimpanan Spesimen Hemostasis
Perubahan yang terjadi setelah rentang darah dikumpulkan dari aktivasi permukaan
koagulasi (yang mengakibatkan mempersingkat waktu pembekuan) peningkatan
labilitas faktor V dan VIII (yang dapat memperpanjang waktu pembekuan).
perubahan tersebut menjadi sumber signifikan dari kesalahan dalam pengujian jika
tidak ada tindakan yang dilakukan untuk mengurangi dan mengendalikan mereka saat
memproses dan menyimpan specimen.
Pengaruh pH
Perubahan ph spesimen, dimediasi oleh hilangnya karbondioksida, dapat
mempengaruhi hasil dengan menyebabkan perpanjangan waktu pembekuan. karbon
dioksida hilang, pH meningkat specimen meningkat . Solusi sitrat yang terkandung
dalam buffer tabung dievakuasi melindungi spesimen terhadap kehilangan tersebut
untuk jangka waktu tertentu. juga, sel darah merah memiliki efek penyangga yang
membantu menstabilkan pH spesimen darah. untuk mempertahankan efek ini,
spesimen harus tetap dalam tabung yang belum dibuka jika pengujian tidak
dilakukan segera. Spesimen yang normal dikumpulkan dalam tabung dievakuasi dan
disimpan dibuka pada suhu kamar selama 6 jam tidak menunjukkan perubahan
signifikan dalam PT atau hasil PTT.
Pengaruh Suhu
Jika spesimen yang tersisa pada suhu kamar untuk waktu yang panjang (lebih dari 6
jam), faktor V dan VIII cenderung memburuk. di sisi lain, faktor VII dan XI
cenderung prematur diaktifkan pada suhu lemari es (4derajat celcius). Namun, untuk
tes koagulasi umum seperti PT, spesimen cukup stabil hingga 12 jam dikumpulkan
dalam buffered natrium sitrat.
Sentrifugasi
Untuk sebagian besar pengujian koagulasi, trombosit plasma miskin (PPP)
diperlukan. PPP dibuat dengan pemusingan darah antikoagulan pada 2000x g selama

10 menit. plasma harus segera dihapus dengan plastik atau dipipet dan disimpan
dalam plastik tutup atau tabung berlapis silikon berlapis silikon. hanya atas tiga
perempat dari lapisan plasma harus aspireted. untuk beberapa tes khusus, sentrifugasi
spesimen pada suhu 2-4C disarankan. Untuk proses ini, sentrifus didinginkan
atau centrifuge kecil yang ditempatkan dalam lemari es diperlukan.
Efect penyangga sel darah merah hilang setelah spesimen disentrifugasi dan plasma
terkena udara. Pemeriksaan harus segera dilakukan pada spesimen disentrifugasi, atau
plasma harus disimpan pada suhu 4C untuk sementara waktu tidak melebihi 2
jam.
Sampel Beku
Spesimen harus tidak dibekukan apabila pengujian dapat dilakukan dalam waktu 2
jam setelah pengumpulan. jika pembekuan diperlukan, hal itu harus dilakukan dengan
cepat pada suhu -20C atau lebih rendah. pembekuan lambat menyebabkan
partikel es untuk membentuk yang mungkin denaturasi protein pembekuan. jika benar
beku, fibrinogen stabil setidaknya selama 4 jam setelah thawing dan bertahan
refreezing dan pencairan
Spesimen Persiapan Untuk Pemeriksaan Fungsi Platelet
Pengambilan
Hemolisis harus dihindari di alltimes karena sel darah merah mengandung adenosin
difosfat (ADP), Yang jika dilepaskan ke plasma, prematur dapat mengaktifkan
trombosit. pH spesimen sangat penting dan paling baik dikendalikan dengan Buffered
natrium sitrat antikoagulan.
Sentrifugasi
Spesimen yang dikumpulkan untuk studi fungsi trombosit (Bab.56) harus segera
diproses. Untuk mempersiapkan platelet kaya-plasma (PRP), spesimen anti koagulan
disentrifugasi pada 60 dan 100 xg selama 10 menit pada suhu kamar. plasma adalah
removex segera dengan plastik atau dilapisi silikon pipet dan dipindahkan ke tabung
reaksi tutup atau dilapisi silikon. kontaminasi sel darah merah harus dihindari dengan
menghapus hanya sebanyak PRP yang diperlukan dari bagian atas spesimen. studi
agregasi platelet juga membutuhkan PPP. ini diperoleh recentrifuging spesimen

tersisa. untuk beberapa tes fungsi platelet, seperti beta-thromboglobulin (beta TG) dan
faktor trombosit 4 (PF4), spesimen harus disentrifugasi pada 2-4Celcius

Pengaruh Waktu
Trombosit yang stabil dan paling responsif antara 30 menit dan 3 jam setelah darah
diambil. Setelah itu, fungsi trombosit berkurang secara signifikan dan hasil tes tidak
dapat diandalkan. Respon platelet terhadap berbagai agen diagregasi berbeda dan
bervariasi sebagai fungsi waktu. Pengujian agregasi ristocetin harus dilakukan segera
setelah spesimen diproses, karena respon trombosit untuk ristocetin menurun sebagai
ph perubahan plasma. Di sisi lain, agregasi dengan epinefrin harus dilakukan terakhir
karena respon trombosit untuk agen ini terus-menerus meningkat dengan waktu.
Agregasi konsisten atau maksimal dengan epinefrin tercapai setelah prp telah di ruang
suhu untuk tentang 60 menit
Pengaruh Suhu
suhu penyimpanan PRP disiapkan untuk studi functiion platelet memiliki pengaruh
yang signifikan pada tingkat dan derajat respon trombosit dalam tes. platelet disiapkan
untuk studi agregasi dan disimpan pada suhu kamar lebih sensitif terhadap berbagai
agen diagregasi dari trombosit disimpan pada 37 derajat celcius. penyimpanan
trombosit pada suhu rendah (0-4 derajat celcius) meningkatkan kecenderungan untuk
agregat platelet spontan. karena variabilitas aktivitas platelet pada suhu ini, spesimen
dikumpulkan dan dipersiapkan untuk studi fungsi platelet, agregasi platelet
khususnya, harus tetap pada suhu kamar sampai pengujian

Spesimen Defibrinated
Tes hematologi tertentu, seperti kerapuhan osmotik (BAB.17) dan uji serum asam
(BAB.19), memerlukan spesimen defibrinated. defibrination melibatkan penghapusan
fibrin dari spesimen darah secara keseluruhan. te phlebotomist harus mempersiapkan
spesimen Defibrinated di samping tempat tidur pasien sebelum darah diperbolehkan
untuk membeku. segera setelah venipuncture menggunakan jarum suntik, seluruh
darah lembut ditambahkan ke labu erlenmeyer yang berisi manik-manik kaca atau
klip kertas. setelah kasa atau kapas ditempatkan di bagian atas botol untuk mencegah

spesimen ontamination, labu diputar selama sekitar 10 menit sampai bads (atau klip)
ditutupi dengan fibrin dan tidak lagi membuat suara berderak. untuk beberapa tes
tabung steril dan manik-manik yang diperlukan.

PERSIAPAN SEDIAAN APUS PREPARAT DARAH

1. Panduan Film darah persiapan:
- Metode coverslip
- Teknik wedge
2. Apus darah otomatis
3. Buffycoat persiapan
- Teknik mikrohematokrit
- Evaluasi persiapan buffycoat
- Cytocentrifuged buffycoat
4. Artefak dari persiapan film darah
5. Pewarnaan film darah
- Noda Romanowsky
- Metode pewarnaan manual
- Metode pewarnaan otomatis
6. Kriteria untuk noda yang baik
7. Masalah noda troubleshooting
- fiksasi
- pewarnaan
- Bilas atau mencuci
- pengeringan
- Noda endapan

Preparasi Blood film Manual (Clinical Hematology-Lippincolt 2nd Edition)

A. Metode Coverslip
Kesulitan untuk melakukan spreading untuk tetesan darah diantara 2 coverslip kaca
telah dicegah dengan metode coverslip untuk pemeriksaan rutin sediaan darah tepi.
Namun teknik tersebut digunakan secara luas untuk persiapan pemeriksaan sumsum
tulang.
Keuntungan dan Kerugian
Salah satu keuntungan yang penting pada persiapan dengan coverslip adalah
pendistribusian leukosit superior. Selain itu, pemeriksaan hitung jenis leukosit

dikerjakan pada preparat coverslip dan sangat jarang terjadi kesalahan oleh karena
distribusi leukosit yang kurang.
Terdapat beberapa kerugian, salah satunya yaitu kesulitan dalam mempelajari
tekniknya. Kedua, kesulitan menjamin darah terdistribusi merata, coverslip harus
dibersihkan secara manual dari kotoran, debu, minyak, dan bekas sidik jari. Ketiga,
kesulitan dalam melabel, mengirim dan melakukan pengecatan pada kaca coverslip
yang kecil dan mudah pecah. Coverslip tersebut harus diletakkkan pada kaca slide
ukuran 3x1 inch untuk pemerikaaan mikroskopik. Keempat, kedua coverslip yang
digunakan untuk membuat film pada metode ini harus tepat terpasang , digunakan
untuk estimasi jumlah trombosit, karena trombosit bisa tidak terdistribusi merata
diantara 2 coverslip. Yang terakhir tidak ada area spesifik untuk memeriksa sel yang
jarang ditemukan.
Teknik
1. Pegang Coverslip No 1,5 yg bersih (22x22 mm) pada dua sudut yang berdekatan
diantara ibujari dan jari telunjuk tangan yang sama.
2. Tempatkan tetesan kecil darah (kira-kira diameternya 2mm) pada bagian pusat dari
permukaan atas coverslip. Tempatkan coverslip bersih lainnya pada puncak arah
silang-menyilang sehingga kedua coverslip menyerupai bintang dengan 8 titik
(Gambar dibawah ini). Catatan jika menggunakan darah kapiler, tetesan darah yang
keluar pertama harus dibersihkan / dilap, kemudian gunakan tetesan darah yang masih
segar pada coverslip. Hindari memegang dengan tangan. Letakkan coverslip tersebut
pada puncak dari coverslip lainnya untuk membuat bintang dengan 8 titik seperti yang
telah dijelaskan di atas.

3. Sebaiknya tetesan darah dimulai dengan menyebar ke segala arah oleh aktivitas
kapiler. Ketika penyebarannya hampir komplit, tarik kedua coverslip dengan lembut
ke arah lateral secara bersamaan agar terpisah (gambar D)
4. Pastikan coverslip tetap berpasangan dan alirkan udara kering secara cepat.
5. Setelah pengecatan, pemberian udara kering, dan peninggian dengan blood film,
kemudian letakkan pada kaca slide 3x1 inch, kemudian beri label pada slide.
Modifikasi metode coverslip merupakan pengganti dari kedua slide kaca ukuran 3x1 inch
untuk coverslip. Puncak slide diganti langsung ke slide yang berisi tetesan darah pada
pusatnya (lihat gambar di bawah ini). Keuntungan modifikasi ini adalah didapatkan area
pemeriksaan yang luas. Penggunaan slide tidak rusak seperti halnya coverslips dan pada
kasus melabel blood film.

Pemecahan Masalah
1. Menilai ukuran tetesan darah.
2. Penting untuk mengatur waktu dan kecepatan pemisahan coverslip. Penarikan
coverslip agar terpisah sebelum waktunya atau terlalu cepat dapat membuat
penyebaran tidak merata. Penundaan pemisahan coverslip menyebabkan coverslip
menjadi bertebaran satu dengan lainnya, terbentuk gumpalan trombosit
(clumping) atau terjadi penyebaran leukosit yang tidak merata.
3. Pemisahan coverslip dilakukan dengan lembut. Tarikan yang sedikit-sedikit
berhenti atau melakukan variasi pada level horizontal akan menyebabkan
distribusi yang tidak merata pada elemen-elemen sel.
4. Menilai kualitas pengecatan. Kesulitan untuk mencampur pengecatan dan bufer
secara adekuat karena area permukaan coverslip kecil seperti halnya saat
membersihkan larutan pengecatan.

B. Teknik Wedge
Berbagai variasi dari teknik Wedge secara luas digunakan untuk preparasi
blood film. Hasilnya dikenal dengan istilah wedge, spreader slide, atau push blood
film .
Beberapa keuntungan yaitu tekniknya mudah, dijual sudah bersih, slide tidak
mudah rusak, mudah untuk dilabel, dikirim dan dilakukan pengecatan, tidak
membutuhkan coverslip, blood film segera dapat disimpan, kombinasi tersebut di atas
menjadikan preparat menjadi lebih mahal serta mudah menemukan sel yang abnormal
karena sel yang lebih besar cenderung tinggal pada tepi film. Kerugian mayor teknik
wedge yaitu distribusi yang kurang pada sel yang berinti. Neutrofil dan monosit
memiliki kecenderungan untuk tampak pada tepi area yang tampak berbulu pada
preparat dalam area pemeriksaan. Hal ini mengakibatkan tampak adanya peningkatan
jumlah limfosit dan penurunan neutrofil dan jumlah monosit ketika mengerjakan
hitung jenis. Kerugian lainnya yaitu adanya trauma yang besar pada sel selama
pembuatan blood film. Hal ini menyebabkan ditemukannya sejumlah besar sel
smudge atau sel basket (leukosit yang ruptur), khususnya pada penyakit
limfoproliferatif.
Teknik Wedge
1. Tempatkan objek glass yg bersih ukuran 3 x 1 inch pada permukaan yang datar
(stationary slide)
2. Teteskan darah diameter 2-3 mm ke objek glass kira-kira inch dari area akhir atau
kaca pada sisi yang sama seperti tangan menulis (lihat pada gambar). Darah berisi
antikoagulan seharusnya dilakukan pencampuran dengan baik sebelum dikirim ke
laboratorium.
3. Pegang pada ujung slide yang diam, yang bukan ujung terdekat dari tetesan darah,
menggunakan tangan yang tidak biasa dipakai untuk menulis (Gambar 3.3A)
4. Posisikan slide spreader pada kemiringan sudut 25 35 dari slide yang diam serta
geser ke arah tetesan darah (Gambar 3-3B dan C).
5. Biarkan tetesan darah menyebar sepanjang ujung slide spreader (Gambar 3.3D).
6. Dorong slider spreader dengan segera ke arah depan dengan gerak yang cepat dan
lembut, pertahankan kemiringan sudut yang sama serta menggunakan sedikit tekanan.
Darah akan berjalan dibelakang slide spreader (Gambar 3.3 E).

7. Jika kemiringan sudut slide spreader tepat, kecepatan gerak akan cukup cepat, serta
ukuran tetesan darah tepat, darah akan menyebar sepanjang - slide yang diam
8. Udara kering segera mengenai darah tetapi butuh didiamkan beberapa menit sebelum
dilakukan pengecatan. Hal ini dapat dilakukan secara manual atau dengan kipas angin
listrik atau aliran udara dingin.
9. Beri nama, nomor, dan tanggal pengerjaan pada label di ujung preparat setelah
preparat kering.
Slide Spreader
Sifat khusus slide spreader mempengaruhi distribusi leukosit dan
berhubungan dengan akurasi hitung jenis. Slide spreader seharusnya lebih sempit
daripada objek glass yang diam (stationary slide). Tepi penyebaran seharusnya
tampak bersih, halus, kilap, dan tipis, tanpa cacat atau goresan. Spreader yang bagus
adalah coverglass hemositometer (20 x 26 x 0,4 0,6 mm). Ukuran panjang tepi
spreader adalah 20 mm.
Karakteristik Wedge Film yang Benar
Beberapa karakteristik persiapan preparat yang baik (gambar 3-4), yaitu :
1. Preparat menutupi minimal dari panjang objek glass. Film yang diwarna melalui
instrumentasi otomatis tipe platen / rol mesin tulis (Ames Hema Tek Stainer, Miles
Laboratory, Elkhart, IN) seharusnya minimal diakhiri inchi sebelum mencapai
ujung slide.
2. Film preparat seharusnya lebih sempit daripada objek glass / slidenya sehingga sisi
tepi preparat dapat diperiksa dengan mikroskop.
3. Penyebaran yang homogen seharusnya ditunjukkan dengan transisi yang berangsurangsur dari area tebal ke area tipis dengan tidak ada gelombang, corengan, lubang,
palungan, atau gelembung.
4. Preparat seharusnya diakhiri dengan ujung yang berbentuk peluru dengan garis-garis
yang lurus atau ramping (Gambar 3.5). Preparat berbentuk peluru (Gambar 3.5)
cenderung memiliki akumulasi leukosit yang tinggi sepanjang sisi dan tepi ekor
preparat daripada preparat gengan ujung yang lurus (Gambar 3.6). Bentuk peluru
dihasilkan karena penyebaran darah dilakukan sebelum tetesan darah menyebar secara
penuh disepanjang slide spreader.

5. Preparat harusnya cukup tipis untuk melakukan fiksasi yang baik selama melakukan
prosedur pengecatan. Area tebal tampak hijau gelap / abu-abu atau tercuci selama
pewarnaan.
6. Preparat seharusnya memiliki minimal 10 lapang, power yang rendah sebesar 50 %,
tidak terjadi overlapping erirosit. Sisanya dapat terjadi sedikit overlap (2 kali lipat
atau 3 kali lipat). Satu sel darah merah seharusnya memiliki sentral pallor.
Pemecahan Masalah
Seringkali preparat tebal dihasilkan karena penggunaan tetesan darah yang
terlalu banyak, penyebaran darah terlalu cepat atau sudut slide spreader terlalu tinggi
(lihat gambar 3.4 C & 3.7). Pada beberapa preparat, kelebihan plasma menyebabkan
sel berinti menyusut dan pengecatan tebal sehingga sulit mengidentifikasinya
(Gambar 3.4 C). Bentuk sel darah merah lebih rouleaux pada area tebal dan tidak
dapat dievaluasi.
Seringkali preparat yang tipis (Gambar 3.7) disebabkan oleh penggunaan
tetesan darah yang terlalu kecil, penyebaran terlalu lambat, atau menggunakan sudut
slide spreader yang terlalu kecil. Smudge cell meningkat dan sel darah merah
menyerupai sferoid dengan bentuk distorsi (Gambar 3-4 A). Terdapat kecenderungan
sel-sel berinti terbawa ke tepi preparat akibat spreading yang terlalu lambat dan
mempengaruhi keakuratan hitung jenis (Gambar 3.6).
Penampakan berpasir pada area ekor mengindikasikan akumulasi dari sel sel berinti
yang berasal dari sejumlah besar leukosit, spreading yang terlalu lambat atau
penundaan spreading (lihat gambar 3.8). Hal ini disebabkan oleh penggunaan hanya
sebagian dari tetesan darah (Gambar 3.8 B). Tepi spreader yang kasar atau kotor akan
menghasilkan preparat yang berpasir atau kasar. Beberapa antikoagulan akan
menyebabkan akumulasi dari leukosit pada ujung yang tampak kasar.
Banyak laboratorium hematologi membuat ketetapan untuk menentukan
prosedur tertentu karena leukosit kurang terdistribusi pada preparat wedge. Misalnya,
jika hitung jenis leukosit menunjukkan lebih dari 40 % limfosit, maka perhitungan
tersebut seharusnya diulangi ke slide lainnya. Demikian juga jika jumlah monosit,
eosinofil atau basofil melebihi referensi nilai normal, 100 sel 1 menit
didiferensiasikan pada slide yang sama dan angka rata rata dilaporkan. Pemeriksaan
yang paling efisien yaitu dengan inspeksi dengan power yang rendah pada area perifer
(slide dan ujung yang kasar) untuk sejumlah netrofil yang tidak proporsional.

Preparat Otomatis
Metode otomatis untuk preparasi preparat telah diperkenalkan oleh beberapa
manufaktur lebih dari beberapa tahun. Saat ini, satu-satunya market yang tersisa
adalah Autoprep (Barret Healthcare Coporation, Tucker, GA). Ini merupakan
instrumentasi portabel semiautomatik yang menstimulasi teknik manual tipe
spreader (Gambar 3.9). Alat ini terdiri dari dua bagian spreader yang letaknya tinggi
pada sudutnya yang bergerak secara mekanik sepanjang objek glass 3 x 1 inchi yang
berisi tetesan darah. Operator harus menempatkan slide slide pada mesin, menaruh
tetesan darah pada tiap slide dan menekan pengungkit untuk memulai pergerakan
spreader, kecepatan dapat diganti ganti menurut hematokrit. Keuntungan dan
kerugian preparat wedge otomatis, sama dengan preparat wedge manual dengan
keuntungan tambahan yaitu lebih konsisten jika dibandingkan dengan preparat
manual.
Gambar 3.9.

Instrumentasi otomatis lainnya yang telah dipaparkan, menggunakan teknik

sentrifugal (memperkenalkan sentrifugasi untuk menyebarkan whole blood monolayer
pada objek glass ukuran 3 x 1 inchi).
Preparasi Buffy Coat
Selsel berinti dan trombosit-trombosit akan melapisi bagian atas dari sel-sel
darah merah selama sentrifugasi (lihat gambar 3.10). Fraksi dari sel-sel berinti ini
disebut sebagai buffy coat karena berwarna kekuningan atau kecoklatan. Lapisan
putih bagian atas adalah akumulasi trombosit di atas sel-sel berinti. Buffy coat dapat
dibuang, dicampur, dan digunakan untuk persiapan preparat. Preparasi buffy coat

merupakan prosedur yang sederhana yang menyediakan informasi diagnostik dan

mengurangi kebutuhan yang berlebihan, baik waktu dan biaya yang dikeluarkan.
Indikasi preparat buffy coat untuk mendeteksi adanya sel yg reaktif, imatur, dan
abnormal (rare blast / mast sel), terutama pada pansitopenia. Jumlah sel-sel eritrosit
berinti megaloblastik atau peningkatan jumlah netrofil pada anemia megaloblastik, sel
plasma yang abnormal, sirkulasi sel tumor dalam darah, serta adanya bakteri atau
parasit. Contohnya sel-sel darah merah yang matur mengandung parasit malaria,
terkonsentrasi pada lapisan atas sel darah merah.
Teknik Pembuatan Buffy Coat
1. Isi tabung hematokrit Wintrobe dengan campuran darah antikoagulan EDTA.
2. Sentrifugasi pada 1000 x g selama 6 menit. Kekuatan sentrifugasi yang kurang tidak
menyebabkan perubahan bentuk sel.
3. Dengan menggunakan pipet kapiler, buang plasma dari tabung sedikit sampai tinggal
tersisa sejumlah plasma yang sedikit lebih besar dari buffy coat.
4. Aspirasi plasma yang tersisa, lapisan buffy coat, dan lapisan paling atas sel darah
merah matur (kira-kira 1%) dan tuangkan campuran ini ke objek glass yang bersih.
5. Bilas dengan lembut kaliber dari pipet kapiler beberapa kali kemudian campur dan
buang semua sel yang melekat pada kaca.
6. Campur sampel dengan menggerakkan batang kaca. Pindahkan tetesan dari campuran
tersebut ke objek glass yang bersih / coverlips dan membuat preparat seperti yang
telah dijelaskan di atas.
7. Biarkan kering kemudian lakukan pewarnaan.
Penggunaan konsentrat ganda dapat membantu kita pada situasi dimana
jumlah leukosit di bawah 3 x 103/L. Beberapa tabung yang berisi spesimen, dilakukan
sentrifugasi seperti di atas. Dua-pertiga plasma dibuang. Plasma yang tersisa, buffy
coat, dan inchi lapisan sel darah merah dibuang dari semua tabung, campurkan
semua, dan tempatkan pada tabung lainnya untuk disentrifugasi yang kedua kemudian
dilanjutkan ke langkah 3 sampai langkah 7 dari prosedur.

Teknik Mikrohematokrit
Ketika hanya sejumlah kecil darah yang tersedia misalnya pengambilan darah
melalui tusukan kulit, beberapa tabung mikrohematokrit digunakan untuk
memusatkan pada sel-sel berinti. Antikoagulan yang dipilih adalah EDTA.
1. Isi tabung minimal dengan darah
2. Tutup salah satu ujung tabung dan tempatkan pada sentrifugasi mikrohematokrit.
Sentrifugasi selama 2 3 menit (kurang dari waktu sentrifugasi yang normal).
3. Hitung masing-masing tabung tepat di bawah lapisan buffy coat (lihat gambar 3.11A)
dengan pensil penanda kaca.
4. Patahkan tabung pada lokasi penanda. Pakai sarung tangan dan hati-hati pada fragmen
kaca.
5. Pegang bagian tabung yang berisi plasma, buffy coat, dan sedikit fraksi sel darah
merah, diantara jari jempol dan jari tengah dengan jari telunjuk berada di ujung
tabung untuk mengontrol aliran cairan.
6. Sentuhkan tabung pada objek glass yang bersih dan biarkan sel darah merah, buffy
coat, dan sejumlah plasma mengalir ke atas objek glass (gambar 3.11 B). Campur
secara menyeluruh dan buat preparat Wedge, keringkan, lakukan pengecatan dan
periksa. Ulangi pada tiap-tiap tabung lainnya.

Jika tabung mikrohematokrit berisi antikoagulan heparin, maka cenderung

akan terjadi aglutinasi sel darah putih dan trombosit, pewarnaan yang kuat pada sel
darah putih memberikan warna biru keunguan, dan oranye kemerahan pada sel
darah merah.
Evaluasi Preparasi Buffy Coat
Pembuatan buffy coat yang baik harus mewakili populasi sel berinti secara
umum pada sampel darah. Akantetapi, akibat adanya manipulasi pada spesimen dan
sentrifugasi, akurasi hitung jenis tidak dapat dicapai. Demikian juga morfologi sel
darah merah yang matang tidak dapat dievaluasi serta trombosit tidak dapat dihitung.
Pelaporan preparasi buffy coat mencakup gambaran populasi utama leukosit dan
catatan adanya beberapa sel imatur dan sel berinti yang abnormal, inti sel, atau
penemuan sel tambahan laninnya. Pada kasus leukopenia atau kondisi dengan jumlah
leukosit yang normal, pemeriksaan preparat buffy coat beberapa menit secara hati-hati
akan menemukan sejumlah sel-sel berinti pada pemeriksaan rutin preparat darah
beberapa kali, dan seringkali dijumpai kondisi abnormal. Ketika memeriksa sebuah
preparat Wedge, periksa secara teliti pada tepi dan ujung yang bentunya memutar
karena leukosit imatur dan abnormal serta sel-sel darah merah berinti bisa ditemukan
pada area tersebut.
Sel-sel netrofil imatur yang langka (metamielosit dan mielosit) serta fragmenfragmen inti megakariosit dapat ditemukan pada preparat buffy coat pada seseorang
yang sehat. Kelompok besar monosit dapat ditemukan pada preparat buffy coat. Sel
darah merah berinti tidak ditemukan pada orang dewasa yang normal.
Sebagai tambahan, jika spesimen darah dengan antikoagulan EDTA
setidaknya telah satu jam, maka perubahan morfologi sel lebih tampak pada preparat
buffy coat jika dibandingkan dengan preparat darah. Smudge cells dan sel nekrotik
(sel mati) akan banyak ditemukan.
Citosentrifugasi Buffy Coat
Citosentrifugasi telah digunakan pertama kali untuk memadatkan sel-sel
berinti pada spesimen cairan tubuh. Terdapat dua laporan tentang penggunaan
citosentrifugasi untuk preparasi buffy coat. Beberapa laboratorium melakukan
percobaan-percobaan dengan metodologi-metodologi namun tidak ada hasil evaluasi
yang dipublikasikan. Salah satu prosedur mencakup satu atau dua konsentrasi

menggunakan tabung Wintrobe seperti yang telah dijelaskan di atas, penambahan

normal salin (0,85%) dan 22% bovine albumin ke dalam konsentrat buffy coat dan
dilakukan sentrifugasi (Bab 30). Keseimbangan harus dijaga pada tiap-tiap sampel
antara kebanyakan saline (terlalu encer) dan kebanyakan albumin (dark cells dengan
artefak pseudopods). Teknik eksperimental lainnya yang telah dipublikasikan,
memerlukan inkubasi dengan agen pembuat lisis eritrosit sebelum disentrifugasi.
Sama halnya pada preparasi citosentrifugasi cairan tubuh, perubahan bentuk
morfologi (indentasi nukleus dan segmentasi, terlokalisir atau granulasi sitoplasma
prominen, vakuolisasi) telah diperkenalkan. Metode citosentrifugasi buffy coat tidak
diragukan lagi menjadi perbaikan untuk dimasa mendatang.
Artefak artefak Pada Preparat Darah
Kebanyakan preparat darah disiapkan dari sampel darah dengan antikoagulan
EDTA. Pemilihan antikoagulan yang tepat ini sesuai dengan rasio darah, morfologi
sel pada sampel darah yang segar.
Bentuk sel-sel normal dapat dilihat dengan puas dalam waktu lima jam.
Akantetapi, sel-sel reaktif dan patologis diasumsikan berubah dalam waktu satu jam
sehingga sulit untuk diidentifikasi dengan tepat. Penyimpanan pada suhu ruangan
dapat mempercepat perubahan ini.
Perubahan pada monosit terjadi segera pada sampel EDTA. Vakuolisasi lazim
terjadi (lihat gambar 3.12). Limfosit reaktif (varian) secara cepat berkembang,
sitoplasma bervakuola dan berbelit atau nukleus berbentuk daun clover (sejenis
kacang-kacangan, Gambar 3.12 E dan F), sama halnya dengan sel blas patologik
(Gambar 3.12 C). Netrofil toksik menjadi bervakuola (autofagositosis). Nekrobiotik
atau leukosit yang mati (Gambar 3.12D) sering ditemukan pada kondisi pembuatan
preparat yang tertunda, khususnya pada sampel yang berisi sel reaktif dan patologis
dan penting untuk membedakannya dengan sel-sel darah merah berinti. Granulasi
sitoplasma netrofil yang berwarna merah keunguan berguna untuk membuat
perbedaan. Beberapa sel nekrobiotik memiliki banyak fragmen berbentuk bulat atau
penonjolan vakuola.

Eritrosit normal mempertahankan ukurannya, warna, dan bentuknya dalam

enam jam, setelah itu akan tampak spikula atau krenasi. Pada pemeriksaan darah yang
sudah sehari, banyak dijumpai sel-sel krenasi dan sferosit dengan sangat jelas
(Gambar 3.12A). Awal kelainan eritrosit ditemukan penampakan berspikula dalam
waktu satu jam dari saat pengumpulan darah, dan dalam waktu 24 jam perubahan ini
menjadi signifikan. Basophilic stippling yang kasar dan badan Dhle pada
penggunaan antikoagulan EDTA, dapat tidak ditemukan.
Pemakaian EDTA mempengaruhi distribusi trombosit, ukuran dan granulagranula. Trombosit lebih terdistribusi merata pada preparat dengan darah EDTA
daripada darah yang diambil dari kapiler (tusukan kulit) atau jarum titik. Trombosit
cenderung akan membengkak dan berbentuk sferis, serta granula-granulanya tersebar,
sebagai akibat dari pewarnaan yang lebih terang daripada yang biasa dilakukan pada
preparat darah kapiler. Autoaglutinin trombosit telah dilaporkan, menyebabkan
trombosit clumping dengan keberadaan EDTA. Satellitism merupakan kecenderungan

trombosit melekat ke netrofil pada penggunaan antikoagulan EDTA, hal ini sering
disalah-interpretasikan sebagai trombositopenia oleh alat hitung partikel dan hanya
dapat diketahui dengan evaluasi preparat secara visual.
Persiapan darah Wedge dari darah EDTA yang telah lama (berhari-hari) akan
menampakkan distribusi tidak merata dengan banyak sel-sel berinti terbawa ke bagian
yang menonjol atau area ekor (Gambar 3.14). Sampel ini tidak dapat dievaluasi
dengan akurat.
Aliran udara yang kering pada pada preparat darah yang segar dapat
menyebabkan timbulnya artifak pada sel darah merah yang lembab, tampak berbulu
pada sitoplasma dari limfosit yang normal dan penyusutan dari leukosit normal.
Artefak yang kering menyebabkan sel darah merah tampak hipokromik, akantetapi
perubahan yang tajam lebih membantu dalam mengindentifikasi artifak ini daripada
perubahan yang perlahan-lahan diantara lingkaran hemoglobin dan senter yang jelas
(lihat gambar 3.15). Terkadang sel-sel perifer mengalami krenasi atau tampak seperti
binatang ngengat yang sedang makan. Artifak kering ini memiliki beberapa penyebab
antara lain:
Anemia berat, dimana kelebihan jumlah plasma mengakibatkan kesulitan saat
mengeringkan preparat, tanpa melihat tekniknya. Preparat dibuat pada lingkungan
yang lembab. Fiksasi yang dilakukan tidak adekuat, dapat dihindari dengan
melakukan fiksasi sebelum pewarnaan preparat. Kontaminasi air dengan larutan
perekat atau pewarna. Kelebihan buffer pada larutan pewarna.
Area preparat darah dapat mempengaruhi morfologi leukosit. Efek area tipis
pada objek glass yaitu memperbesar penyebaran leukosit. Pada area tebal, plasma
meningkat, menyebabkan penyusutan dan pembentukan tiga dimensi dari leukositleukosit yang tersisa dengan sitoplasma yang sedikit.
Bahkan pada preparat darah Wedge yang baik, sedikit disintegrasi atau sel
smudge dapat ditemukan (lihat color plate 37.1). Smudge cell mewakili rupturnya
leukosit selama persiapan preparat darah. Pada alat hitung sel otomatis, smudge cell
terbaca sebagai leukosit karena smudge cell ini utuh sebelum dilakukan persiapan
preparat darah. Ketika jumlah smudgecell meningkat pesat (lebih dari 20 per 100
leukosit), jumlah smudge cell harus dilaporkan pada hitung jenis leukosit secara
manual sebagai jumlah per 100 leukosit. Penambahan satu tetes dari 22% albumin
menjadi lima tetes dari whole blood sebelum persiapan preparat darah, akan
menurunkan jumlah smudge cell. Granulosit-granulosit yang hancur sering dikelilingi

oleh granul-granul yang hancur sehingga sulit mengidentifikasi. Umumnya limfositlimfosit yang hancur tampak hanya sebuah sel smudge (corengan), nukleus yang tidak
berbentuk dengan sitoplasma yang larut dalam plasma. Terkadang sisa-sisa nukleus
yang berkembang, menampakkan anyaman longgar yang disebut dengan sel basket.
Sel-sel imatur yang rusak dapat mempertahankan pewarnaan dengan inti berwarna
biru.
Pewarnaan Preparat Darah
Pengecatan Romanowsky
Pewarnaan Romanowsky terdiri atas metilen blue, produk oksidatif dari
metilen blue (azures, lihat gambar 3.16), dan pewarnaan eosin. Pengecatan Wright /
Wright Giemsa polikromatik adalah modifikasi pewarna Romanowsky yang umum
digunakan di Amerika. Jenis lainnya yang lebih terkenal yaitu Leishman, May
Grnwald, dan pengecatan Jenner, nama-nama tersebut diberikan berdasarkan orang
yang mengembangkannya. Perbedaan modifikasi dari rasio komponen pewarna dan
metode-metode manufaktur, digunakan untuk mengkoreksi metilen blue. Pewarnaan
Romanowsky dikombinasi dengan dengan penggunaan Giemsa, yang terdiri atas
pewarna azure, untuk memperjelas ciri-ciri nukleus atau azurofilik dan granulasi
toksik. Penggunaan giemsa sendiri tidak adekuat untuk mewarnai sel darah merah,
trombosit, dan sitoplasma leukosit.

Gambar 3.16 : Oksidasi metilen blue dan contoh produk oksidasi

Pertama sel-sel pada objek glass harus difiksasi secara kimia murni dengan
metanol yang bebas aseton, pada langkah ini tidak terjadi pewarnaan. Setelah
dilakukan fiksasi, penambahan larutan buffer merubah pH larutan dan mengionisasi
reaktan untuk inisiasi proses pewarnaan pH-dependen. Pada elemen-elemen selular
yang asam seperti nukleoprotein, asam nukleat, dan protein sitoplasma tertentu
bereaksi dengan pewarna dasar, metilen blue, dan merupakan hasil dari oksidasi serta
variasi penegcatan berwarna biru. Istilah basofilik digunakan untuk elemen-elemen
yang bersifat asam serta menandakan aktifitas mereka atau love (Greek, philic)
untuk pewarnaan dasar. Elemen dasar selular seperti molekul hemoglobin di dalam sel
darah merah dan beberapa unsur-unsur pokok sitoplasma leukosit bereaksi dengan
pewarna asam eosin, dan menghasilkan variasi warna yaitu dari oranye sampai
kemerahan. Mereka disebut sebagai asidofilik atau eosinofilik.
Istilah netrofil berarti bahwa karakteristik sel bersifat netral pada pewarnaan
antara warna asam yang terang (merah) dan basa (biru). Beberapa organela sel
memadukan warna-warna yang berbeda seperti warna ungu, merupakan kombinasi
kelompok molekular asam dan basa. Azures (Gambar 3.16) menghasilkan warna
merah-keunguan dan merupakan kemampuan mereka dalam memberikan warna
primer atau granula-granula nonspesifik pada kebanyakan sel-sel mieloid, oleh karena
itu diberi istilah granula azurofilik.

Pewarnaan Romanowsky selalu bisa berubah secara tiba-tiba. Dahulu, tes

terbaik pada kualitas tiap pewarna adalah percobaan lari dengan buffer dan waktu
yang berbeda. Metode analitik yang rumit baru-baru ini, banyak membutuhkan
analisis elemen-elemen pewarna utama. Seperti yang dipaparkan pada gambar 3.16,
demetilasi (pembuangan kelompok CH3) metilen blue pada larutan alkohol
menghasilkan berbagai produk-produk teroksidasi yang dinamakan azure (A sampai
C). Proses ini berlanjut sebagai larutan pewarna Wright yang lama, menyebabkan
timbulnya variasi pada kualitas pewarnaan. Penyimpanan pada lemari es akan
menghambat perubahan ini dan beberapa produsen merekomendasikan penyimpanan
dalam suhu 4C. Akantetapi campuran-campuran lainnya pada pewarnaan akan
dirusak oleh suhu yang dingin dan harus disimpan pada suhu ruangan. Paket-paket
penyisipan disediakan untuk penyimpanan. Demikian juga, paparan terhadap suhu
dingin selama pengiriman merusak larutan pewarna. Beberapa manufaktur
menambahkan elemen-elemen logam untuk bekerja sebagai stabilizer larutan untuk
memperpanjang umur pemakaian larutan tersebut, tetapi keberadaannya dapat
mengubah kualitas pewarna. Penggantian 50% metanol oleh gliserol akan
menghambat proses oksidasi, akantetapi kondisi tersebut menghasilkan larutan
pewarna yang kental dan lengket sehingga sulit untuk mencampurnya dengan buffer
dan sulit untuk melakukan pengecatan.
Beberapa peneliti yang meneliti efek Romanowsky - Giemsa, menyediakan
dasar empiris untuk standardisasi pewarnaan dengan jenis Romanowsky. Fungsi
utama metilen blue untuk menyediakan produk oksidasi, azure. Azure B lebih
superior daripada azure lainnya. Pewarnaan polikromatik baru yang telah
dikembangkan yaitu azure B murni dan eosin yang telah diukur jumlahnya.
Standardisasi kualitas pewarnaan telah didapat karena oksidasi komplit pada larutanlarutan tersebut serta tambahan pewarna dan elemen-elemen dibuang . Walaupun
terdapat kemajuan dalam produksi dan pemeriksaan, namun tetap dianjurkan untuk
melakukan tes pada setiap larutan pewarna.
Beberapa pewarnaan yang cepat telah dikembangkan untuk digunakan pada
laboratorium-laboratorium kecil. Walaupun cukup untuk menilai morfologi sel
normal , secara umum pewarnaan yang cepat tersebut tidak bisa memeriksa sel-sel
abnormal dengan puas. Waktu fiksasi yang pendek menyebabkan kurangnya penetrasi
dari pewanaan, dan waktu paparan pengecatan yang pendek, menghasilkan warna

yang tidak seperti biasanya. Sebagai tambahan, ada banyak variasi dari preparat satu
ke preparat lainnya.
Metode Pengecatan Manual
Dua jenis metode yang umum yaitu metode Rack dan Dip
Metode Rack
Metode Rack menggunakan batang-batang yang diletakkkan di atas tempat
pencucian atau piring yang cekung (dish) yang memegang objek glass pada posisi
horizontal selama pengecatan (lihat gambar 3.17 A). Sumbat karet yang kecil di
setting di bagian dalam dish, digunakan saat melaukan persiapan mewarnai coverslip
(Gambar 3.17B).

Gambar 3.17 Metode Rack pada pengecatan preparat manual. (A) Batang-batang
menampung objek glass 3 x 1 inchi. (B) Sumbat karet digunakan untuk persiapan
pewarnaan coverslip

Teknik Metode Rack

1. Preparat dibiarkan kering dengan udara sekitar beberapa menit.
2. Larutan pewarna wright disebarkan di atas slide dengan meneteskannya melalui botol
atau pipet hingga membanjiri permukaan slide. Tepi slide tidak boleh bersentuhan
satu dengan lainnya untuk mencegah larinya larutan pewarna dari slide. Dilakukan
fiksasi sel-sel ke slide karena alkohol merupakan unsur pokok dari larutan pewarna.
Minimal dibutuhkan satu menit untuk fiksasi karena dianggap preparatnya tipis
dengan jumlah sel yang normal atau menurun. Spesimen spesimen dengan

peningkatan jumlah leukosit yang besar atau pembuatan preparat sum-sum tulang
membutuhkan waktu fiksasi yang lebih lama.
3. Larutan buffer fosfat ditambahkan padatiap-tiap slide dengan jumlah yang sama.
Kualitas pewarnaan dipengaruhi oleh pH buffer, rentang pH optimum antara 6,4 6,8.
Larutan buffer untuk pewarnaan dicampurkan ke atas slide secara lembut dengan
menyemburkannya. Warna kehijauan seperti kilau logam mengindikasikan pewarnaan
sudah tepat (rasio buffer). Pewarnaan 4 6 menit (tergantung dari keputusan
laboratorium dan penelitian dengan pewarna khusus).
4. Campuran pewarna dialirkan dengan cepat dari slide dengan aliran air yang diteteskan
atau deionisasi hingga semua pewarna dibuang. Tidak boleh terlalu banyak dibilas.
Air yang dipakai mencuci harus memiliki pH netral untuk mencegah perubahan warna
pengecatan.
5. Sisa-sisa pewarna pada bagian bawah slide dibersihkan dengan tissue laboratorium
atau kasa, kemudian spesimen dikeringkan.
Walaupun kebanyakan laboratorium-laboratorium membeli secara komersial
pembuatan preparat dengan larutan pewarna Wright, larutan tersebut dapat disiapkan
secara manual dengan mencampur 1 gram bubuk biologis Wright per 500 ml zat
kimia murni , metanol bebas aseton. Pewarna diinkubasi selama satu minggu pada
suhu 37C, kemudian disimpan pada suhu ruangan atau suhu lemari es. Lama
inkubasi dapat diperpendek dengan menambah 0,1 gram bubuk giemsa per 500 ml
pewarna. Botol-botol polietilen bersifat lebih stabil daripada botol kaca untuk
penyimpan pewarna. Pewarna harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan.
Larutan buffer dibuat dengan melarutkan garam buffer atau tablet-tablet di
dalam air sulingan atau yang di-deionisasi. Larutan buffer juga dibuat dengan
menggabungkan potasium fosfat monobasic dan sodium fosfat dibasic dalam air s
ulingan menurut pH yang diinginkan. Petunjuk spesifik untuk membuat buffer fosfat
tersedia dalam berbagai penerapan kimia secara manual. Sebelum digunakan, pH
larutan dievaluasi dengan pHmeter.
Penggunaan metode Rack untuk pemeriksaan sejumlah kecil preparat akan s
angat menghemat biaya karena metode ini menggunakan larutan pewarna yang
minimal pada tiap slide. Satu atau beberapa slide dapat diwarnai secara bersamaan.
Kerugian metode Rack yaitu mudah terjadi presipitat (granul-granul biru-hitam atau
filamen pada preparat), sulit dalam pengaturan waktu, dan ketidaksamaan dalam

kualitas pengecatan berhubungan dengan variasi sejumlah pewarna dan larutan buffer
tiap slide dan pengaturan waktu tiap langkah pengerjaan.
Metode Dip (Inkubasi)
Beberapa dish diperlukan (wadah cukup besar untuk tempat pemegang slide
yang portabel serta larutan).
Teknik metode Dip
1. Preparat difiksasi 1-2 menit pada dish dengan metanol. Wadah untuk meletakkan slide
harus kering untuk menghindari kontaminasi air.
2. Slide diletakkan pada dish yang berisi pewarna Wright yang encer selama 4 menit.
3.

Slide ditempatkan ke dish lain dengan pewarna Wright 75 ml dan buffer 325 ml (pH
6,4) selama 4 menit.

4. Slide kemudian dipindahkan ke sebuah dish dengan larutan Giemsa 20 25 ml dan 200
ml air deionisasi selama 4 menit.
5. Slide dibilas dalam waktu singkat pada dua dish dengan air suling dan dikeringkan
dengan udara sekitar.
Keuntungan dari metode ini, kualitas pewarnaan lebih konsisten, penetrasi
warna lebih baik dengan hasil warna yang terang serta endapan sedikit, hemat biaya
untuk sejumlah slide yang banyak, dan mudah adaptasi dengan dip otomatis.
Kerugian metode ini yaitu dibutuhkan waktu untuk menyiapkan larutan-larutan
pewarna dan memindahkan slide dari dish yang satu ke dish lainnya, serta adanya
kestabilan yang terbatas (maksimal 4 jam) pada buffer Wright dn larutan pewarna
Giemsa, hal ini menyebabkan mahalnya penggunaan metode ini pada preparat yang
jumlahnya sedikit.
Metode Mewarnai yang Otomatis
Jenis Platen (Silinder)
Pewarna slide Ames Hema-Tek mempersembahkan pewarna jenis platen.
Objek glass ditempatkan di atas platen dengan film darah di sisi bawah serta
dipindahkan oleh pengangkut berbentuk spiral melalui pelarut eosin-metilen blue
polikromasi, pelarut buffer, dan larutan pembilas, masing-masing didapatkan dari kit
reagen yang tersedia komersil, dialirkan melalui pompa tabung (lihat gambar 3.18).

Jenis Carousel (Korsel)

Instrumen lainnya yaitu Pewarna Slide Hematologi Aerospray (Wescor, Inc.,
Logan, UT). Instrumen semprot ini mengukur sejumlah reagen-reagen warna ke atas
preparat darah, dimana reagen-reagen warna tersebut diangkut oleh korsel. Rincian
cara kerja disediakan oleh produsen. Keuntungan dari pewarna jenis silinder dan
korsel otomatis ialah :
-

Tidak membuang waktu. Satu kali slide dikerjakan dengan instrumen, tidak perlu
ditunggu oleh operator, waktu pewarnaan kurang dari 10 menit

Kualitas pewarnaan konsisten dari satu film ke film lainnya.

Harganya murah karena penggunaan reagen pewarna yang sedikit jika dibandingkan
dengan teknik pewarnaan lainnya.

Film stat dapat ditambahkan dan diwarnai kapan saja dengan pewarna slide HemaTek.
Kerugian mencakup :

Perawatan yang tinggi. Platen harus disimpan dalam keadaan bersih untuk mencegah
presipitasi dari pewarna ke dalam preparat. Tabung harus diperiksa setiap hari untuk
melihat adanya ebdapan dan diganti minimal tiap tiga bulan sekali.

Seringkali dibutuhkan waktu prefiksasi yang pendek dengan metanol, khususnya

ketika jumlah leukosit meningkat.

Reagen pewarna harus dibeli dan kemungkinan lebih mahal dari buatan sendiri.
Pendinginan atau pemanasan dapat mempengaruhi kualitas pewarnaan.

Instrumentasi tidak serbaguna untuk memodifikasi jumlah pewarna yang terkirim,

keasaman buffer, serta pembilasan dan waktu yang diperlukan pada tiap-tiap langkah
pengerjaan.
Paket Giemsa harus dibeli untuk menambah pewarnaan nukleus-nukleus dan
granula-granula yang membutuhkan pewarna Giemsa. Granula toksik dan basofilik
tidak akan terwarnai jika Giemsa tidak ditambahkan pada sistem pewarnaan. Slide
harus bersih dan tidak boleh bengkok untuk melakukan pewarnaan pada instrumentasi
jenis platen (silinder). Instrumentasi aerospray menggunakan larutan warna untuk
korsel yang penuh / komedi putar yang penuh (12 slide) tanpa mempedulikan slide
yang ada dimana akan mengurangi biaya.
Instrumentasi Jenis Dip
Beberapa instrumen otomatis menggunakan dip atau teknik pewarnaan imersi
yang sama dengan pewarnaan histologi secara tradisional. Sejumlah film dipindahkan
dari satu dish ke dish lainnya pada interval waktu tertentu (lihat gambar 3.19)

Keuntungannya mencakup :
-

Menghemat waktu instrumentasi operator

Lebih serbaguna dalam jenis dan jumlah larutan pewarna, waktu yang dihabiskan tiap
langkah pengerjaan, keasaman buffer dan larutan pembila, serta kemampuan untuk
membuat reagen-reagen pewarna daripada membelinya.

Jika larutan pewarna diganti secara reguler, kualitas pewarnaan distandarisasi.

Hasil penetrasi warna lebih baik dan pewarnaan elemen-elemen selular lebih intens,
khususnya bila ada penambahan Giemsa.

Kemungkinan untuk terjadinya presipitat / endapan lbh kecil jika dibandingkan

dengan jenis platen.
Kerugian mencakup :

Pewarnaan slide lebih panjang daripada jenis platen

Persiapan larutan pewarna dibutuhkan setiap hari atau dua kali sehari karena
pengecatan mempunyai batas waktu tertentu

Lebih mahal
PEMECAHAN MASALAH
Fiksasi

Fiksasi inadekuat, blood film ikut tercuci pemeriksaan tidak jelas, pengecatan
granul kurang khususnya basofil, kontaminasi air drying artifact

Persiapan film seharusnya dikeringkan 5 menit utk mencegah drying artifact

objek glass hrs bersih sblum digunakan

Kualitas pengecatan yang bagus memperhatikan keseimbangan asam basa

Lama fiksasi minimal 1 menit

Pengecatan

Larutan buffer memiliki waktu kerja yg terbatas hanya beberapa jam.

Air saringan tidak dpt dipercaya adanya kontaminasi & dapat mengabsorbsi CO2
bersifat asam

Hasil yang baik didapatkan dg minimal 2 kali pengecatan

Pencucian

Terlalu semangat dan lama mencuci sel terlepas dr film yg tidak terfiksasi, bs
menyebabkan nuclear clumping, & film terlalu tipis

Kurang pencucian blue film & presipitasi

Pengeringan

Pengeringan yg cepat dan kuat mengubah intensitas warna film dengan

memperpendek waktu paparan pencucian.

Sumber : Lippincolt-