JURNAL REVIEW BIOLOGI MOLEKULER

Lipad Analisis Menggunakan Layar Tipis

Kromatografi

Oleh:
Kelompok 7 dan 9
Cindy Sandra (1406552881)
Citra Noviasari (1406569882)
Ghina Marsya .N (1406608025)
Meidina Sekar .N (1406553045)
Merisa Aulia (1406531731)
Rana Najeges (1406553026)

Program Studi Teknik Kimia

Departemen Teknik Kimia
Fakultas Teknik, Universitas Indonesia
Depok, April 2016
1

Kata Pengantar

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala rahmat dan karunia-Nya,
sehingga kami dapat menyelesaikan Makalah Biologi Molekuler yang berjudul Lipid Analysis
by Thin-Layer Chromatography. Penulisan makalah ini dimaksudkan untuk menyelesaikan
tugas UTS di semester empat ini, yaitu mata kuliah Biologi Molekuler.
Selesainya penyusunan makalah Lipid Analysis by Thin-Layer Chromatography ini
tidak terlepas berkat bantuan dari berbagai pihak, terutama kepada Bu Rita selaku dosen mata
kuliah Biologi Molekuler. Oleh karena itu melalui kesempatan yang sangat berharga ini, kami
mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu pembuatan makalah ini.
Semoga Tuhan Yang Maha Esa membalasnya dengan yang lebih baik.
Akhir kata tiada gading yang tak retak, tiada manusia yang sempurna, begitupun
dengan karya tulis ini. Kami menyadari bahwa karya tulis ini masih jauh dari sempurna, oleh
karena itu kami mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun untuk lebih
menyempurnakan makalah ini. Akhir kata kami mengucapkan semoga makalah ini dapat
bermanfaat.

Depok, 7 April 2016

Penulis

DAFTAR ISI

Kata Pengantar ............................................................................................................................. 2

Daftar Isi ........................................................................................................................................ 3
Isi .................................................................................................................................................... 3
I.

Pendahuluan .....................................................................................................................3
Struktur Lipid.................................................................................................................... 5
Metode Analisis Lipid........11
Ekstraksi Lipid dari Sampel Biologis....20

II.

Kromatografi Layar Tipis..................................................................................................... 23

Fase Diam ....................................................................................................................... 24
Sistem Deteksi .......................................................................................................26

Daftar Pustaka.33

I. Pendahuluan
Ketersediaan pringan pre-coated TLC secara komersial yang terus meningkat telah secara
signifikan meningkatkan ketercapaian kemampuan memproduksi dari pemisahan yang dahulu
sangat terbatas pada saat piringan TLC konvensional masih digunakan. Selain itu,
ketersediaan banyak materi absorben yang berbeda termasuk high performance silica, fase
tergabung dan lapisan fleksibilitas dari HPLTC untuk banyak pemisahan pada lipid.
1.

TLC mudah dan sederhana. Jika pelat TLC tersedia secara komersial, bahkan
pengguna

yang kurang berpengalaman mampu melakukan pemisahan berkualitas

tinggi.
2.

Peralatan yang dibutuhkan untuk TLC cukup murah, sehingga mudah ditemukan di
laboratorium.

3.

TLC sudah terjamin di banyak industri, terutama farmasi. Keuntungan dalam bidang
itu adalah TLC dapat dengan mudah digunakan untuk menentukan analit yang berbeda
secara kuantitatif (setidaknya bila ada standar yang terpercaya).

4.

TLC tidak menyediakan efek memori sehingga dalam setiap kasus selalu digunakan
fase diam yang baru. Ini adalah keuntungan yang signifikan dibandingkan dengan LC,
dimana kontribusi yang tersisa dari analisis sebelumnya tidak dapat pernah benarbenar dihapus.

5.

TLC membutuhkan jumlah pelarut yang jauh lebih kecil dari pada HPLC. Sehingga
TLC lebih murah dan ramah lingkungan.

6.

Banyak sampel yang berbeda dapat secara bersamaan ditempatkan ke piring TLC
tunggal, sehingga dalam prakteknya TLC seringkali lebih cepat daripada LC
(meskipun baru-baru ini tersedia multiplexing LC yang memungkinkan analisis
beberapa sampel secara paralel).

7.

Setelah pemisahan TLC, lipid dapat dengan mudah divisualisasikan dengan

pewarnaan, misalnya dengan pewarna untuk karakteristik gugus fungsi khusus, seperti
amino atau karbohidrat residu. Ini adalah keuntungan yang signifikan dibandingkan
dengan HPLC mana derivatisasi kolom biasanya lebih sulit .

8.

TLC juga dapat digunakan untuk analisis sampel mencurigakan (belum pasti ada
lipidnya) yang mudah merusak sistem HPLC. Hal ini terutama penting dalam kimia
makanan dimana campuran yang tidak diketahui harus dianalisis.
4

Di bidang lipid, TLC digunakan untuk pemisahan rutin, identifikasi lipid individu dan
penentuan kuantitatif. Dengan munculnya teknik "automated multiple development" (AMD),
semua langkah mulai dari aplikasi sampai pencampuran pelarut, pengembangan dan
pengeringan bisa otomatis. Terutama, gradien elusi yang dapat direproduksi menjadi tersedia.
Penggunaan gradien (yaitu campuran dari pelarut yang berbeda dan / atau konsentrasi garam
yang berbeda yang berubah tergantung waktu) adalah sangat umum di HPLC tapi tidak terlalu
umum di TLC. Meskipun yang otomatis jelas mahal, itu adalah prasyarat untuk penggunaan
HPTLC yang lebih luas dalam farmasi, kosmetik dan yang paling penting, industri minyak
dan lemak.

1.1 Struktur Lipid

Secara tradisional, "lipid" dapat didefinisikan sebagai senyawa apolar atau merupakan
senyawa yang tidak larut dalam air dan dapat diperkaya dengan pengobatan /ekstraksi dengan
pelarut organik seperti kloroform atau heksana [2]. Definisi lain telah diperkenalkan oleh
Christie [17]: Menurut definisi ini, lipid adalah asam lemak dan mereka derivatif, dan zat
terkait biosynthetically atau fungsional untuk senyawa ini. Sebuah survei metode ekstraksi
lipid yang umum digunakan dalam praktek sehari-hari akan diberikan di bawah, tapi pertama,
survei singkat lipid yang relevan dengan topik ulasan ini akan disediakan. Kita akan berfokus
terutama pada senyawa yang terjadi dalam

Gambar 1. Bagan Klasifikasi Lipid

sistem biologis dan memiliki relevansi fisiologis. Menurut pengalaman kami, kita akan
fokus pada lipid hewani, sedangkan lipid tanaman tidak akan terlalu focus dibahas.
Struktur dari glikolipid yang relevan biasanya terjadi pada tanaman akan diperkenalkan di
tempat yang tepat . Sebuah gambaran kasar dari lipid yang relevan dengan tulisan ini
diberikan pada Gambar. 1. Harap dicatat bahwa selain senyawa diilustrasikan pada
Gambar. 1 ada banyak deterjen yang dapat juga dianggap sebagai lipid. Namun, senyawa
ini tidak memainkan peran utama dalam kami ulasan. Lipid tidak hanya dari relevansi
mengenai penyimpanan energi, tetapi juga besar-besaran yang terlibat dalam proses
transduksi sinyal [20]. Dengan demikian, penentuan spesies lipid yang dipilih seperti
lysophospholipids (hasil residu kurang satu lemak dibandingkan untuk fosfolipid) [21],
diacylglycerols, asam fosfatidat atau phosphoinositide adalah cukup menarik karena ini
memungkinkan kesimpulan dari proses metabolisme dan memiliki, dengan demikian,
signifikan diagnostic relevansi. Beberapa glikolipid yang saat ini juga dianggap sebagai
penanda penyakit dan penanda diferensiasi mis batang sel menjadi sel kanker. Ada saat
ini juga banyak protein membran diketahui bahwa terletak di membran sel. Karena
banyak dari protein ini mewakili enzim, aktivitas mereka diasumsikan diatur oleh
Komposisi lipid dari membran dan sedikit perubahan dari lipid Komposisi dapat sangat
6

mempengaruhi aktivitas enzimatik. Ini, misalnya, untuk terkenal enzim fosfolipase A2

(PLA2) [22]. Dengan demikian, pengetahuan tentang komposisi lipid adalah kepentingan
dari sudut pandang yang berbeda
Lipid dibagi dalam beberapa golongan berdasarkan kemiripan struktur kimianya,
yaitu: asam lemak, lemak, lilin, fosfolipid, sfingolipid, terpen, steroid, lipid kompleks.
1.

Asam Lemak
Asam lemak adalah asam organik yang terdapat sebagai ester trigliserida
atau lemak, baik yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Asam ini adalah asam
karboksilat yang mempunyai rantai karbon panjang dengan rumus umum:
O = R - C - OH
Dimana R adalah rantai karbon yang jenuh atau yang tidak jenuh dan
terdiri atas 4 sampai 24 buah atom karbon.Rantai karbon yang jenuh ialah rantai
karbon yang tidak mengandung ikatan rangkap, sedangkan yang mengandung
ikatan rangkap disebut rantai karbon tidak jenuh.
Asam lemak tidak jenuh dapat mengandung satu ikatan rangkap atau
lebih.Asam oleat mengandung satu ikatan rangkap. Ikatan rangkap ini
memungkinkan terjadinya isomer sis trans.
Asam lemak tidak jenuh yang terdapat dalam alam adalah isomer.Asam
linoleat mempunyai dua ikatan rangkat, sedangkan asam linolenat mempunyai
tiga ikatan rangkap.

2.

Lemak
Yang dimaksud dengan lemak disini ialah suatu ester asam lemak dengan
gliserol.Gliserol ialah suatu trihidroksi alkohol yang terdiri atas tiga atom karbon.
Jadi setiap atom karbon mempunyai gugus OH.Satu molekul glilserol dapat
mengikat satu, dua atau tiga molekul asam lemak dalam bentuk ester.

3.

Lilin
Yang dimaksud dengan lilin (wax) disini ialah ester asam lemak dengan
monohidroksi alkohol yang mempunyai rantai karbon panjang, antara 14 sampai
34 atom karbon. Sebagai contoh alkohol panjang adalah setialkohol dan
mirisalkohol.
Lilin dapat diperoleh antara lain dari lebah madu dan dari ikan paus atau
lumba lumba. Lilin lebah dikeluarkan oleh lebah madu untuk membentuk
sarang tempat menyimpan madu. Lilin lebah adalah campuran beberapa senyawa,
terutama mirispalmitat.
Lilin yang terdapat pada bagian kepala, ikan paus atau lumba lumba
disebut spermaseti. Spermaseti ini digunakan sebagai lilin untuk keperluan
penerangan.
Lilin tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut lemak. Lilin yang
terdapat pada tumbuhan berfungsi sebagai lapisan pelindung terhadap air,
misalnya yang terdapat pada daun dan buah.

4.

Fosfolipid
Fosfolipid atau fosfatidat ialah suatu gliserida yang mengandung fosfor
dalam bentuk ester asam fosfat. Karenanya fosfolipid ialah suatu fosfogliserida.
Senyawa senyawa dalam golongan fosfogliserida ini dapat dipandang sebagai
derivat asam fosfatidat, yang diikat oleh asam fosfatidat ini antara lain kolin,
etanolamina, serin dan inositol. Senyawa yang termasuk fosfolipid ini ialah
fosfatidikolin, fosfatidetanolamina, fosfatidilserin dan fosfatidilinositol.

5.

Spingolipid
Senyawa yang termasuk golongan ini dapat dipandang derivat sfingosin
atau mempunyai struktur yang mirip, misalnya dihidrosfingosin.
Seramida adalah derivat sfingosin yang mengandung asam lemak. Gugus ini
terikat pada gugus amino. Sfingomielin adalah kelompok senyawa yang
merupakan satu satunya sfingolipid yang mengandung sfingomielin terutama
terdapat dalam jaringan syaraf.
8

Kelompok seramida dan sfingomielin adalah senyawa golongan sfingolipid yang

mengandung karbohidrat. Ini disebut glikolipid dan salah satu contoh senyawa
ialah serebrosida. Serebrosida terdapat terutama dalam jaringan syaraf.

6.

Terpen
Dalam alam banyak terdapat senyawa yang molekulnya dianggap terdiri
atas beberapa molekul isoprena (2- metilbutadiena) atau mempunyai hubungan
struktural dengan isoprena. Senyawa senyawa tersebut dikelompokkan dalam
golongan terpen.

7.

Steroid
Sejumlah besar senyawa lipid yang mempunyai struktur yang sama dan
dapat dianggap sebagai derivat perhidrosiklopentanofenantrena, yang terdiri dari
atas 3 cincin sikloheksana terpadu seperti bentuk fenantrena (cincin A, B, dan C)
dan sebuah cincin siklopentana yang tergabung pada ujung cincin sikloheksana
tersebut (cincin D). Senyawa senyawa tersebut termasuk dalam suatu kelompok
steroid.
Beberapa senyawa penting yang termasuk golongan steroid akan dibahas
berikut ini :
a.

Kolestrol
Kolestrol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak
dialam.Kolestrol terdapat pada hampir semua sel hewan dan semua
manusia.Tubuh manusia kolestrol terdapat dalam darah. Empedu, kelenjar
adrenal bagian luar (adrenal cortex) dan jaringan syaraf.

b.

7 Dehidrokolestrol
Senyawa ini terdapat dibawah kulit dan hanya berbeda sedikit dari
kolestrol, yaitu terdapat ikatan rangkap C = C. Dengan sinar ultra violet 7
Dehidrokolestrol dapat diubah menjadi vitamin D yang sangat berguna
bagi tubuh.Kekurangan vitamin D dapat mengakibatkan kerapuhan pada
tulang.

c.

Ergosterol
Sterol

ini

mempunyai

struktur

inti

sama

dengan

7-

dehidrokolestrol, tetapi berbeda pada rantai sampingnya. Ergosterol dapat

juga membentuk vitamin D apabila dikenai sinar ultraviolet.Ergosterol
maupun 7 dehidrokolestrol disebut provitamin D.

d.

Asam asam Empedu

Cairan empedu dibuat oleh hati dan disimpan dalam kantung
empedu yang kemudian dikeluarkan kedalam usus dua belas jari

duodenum ) untuk membantu proses pencernaan makanan. Cairan empedu

ini mengandung bilirubin yaitu zat warna yang terjadi dari penguraian
hemoglobin, asam asam empedu dalam bentuk garam empedu dan
kolestrol. Asam asam empedu yang terdapat dalam cairan empedu
antara lain ialah asam kolat, asam deoksikolat.

e.

Hormon Kelamin
Ada dua jenis hormon kelamin yaitu hormone kelamin laki laki
dan hormon kelamin perempuan. Testosteron dan androsteron adalah
hormon kelamin laki laki. Tertosteron diperoleh dari ekstrak testes dalam
bentuk kristal, sedangkan androsteron didapati pada urine dan mungkin
merupakan hasil perubahan kimia atau metabolisme testosteron. Hormon
kelamin perempuan ada dua jenis yaitu estrogen dan progesteron. Estrol,
estradiol dan estriol adalah hormon yang termasuk estrogen. Pregnandiol
adalah hasil metabolisme progesteron.

8.

Lipid Kompleks
Yang termasuk dengan lipid kompleks ialah lipid yang terdapat
dalam alam bergabung dengan senyawa lain, misalnya dengan protein atau
dengan karbohidrat. Gabungan antara lipid dengan protein disebut
lipoprotein. Lipoprotein pada umumnya ialah trigliserida, fosfolipid atau
kolestrol. Lipoprotein ini biasanya juga digolongkan dalam protein
10

gabungan.

Lipopolisakarida

ialah

gabungan

antara

lipid

dengan

polisakarida, Lipopolisakarida terbentuk dalam dinding sel beberapa jenis

bakteri.

1.2 Metode Analisis Lipid

1. Thin-Layer Chromatography
Memiliki prinsip kerja pemisahan yang tercapai pada fase diam (biasanya yang
digunakan adalah gel silica) berdasarkan perbedaan kepoaran dari analitnya.

Keunggulan : Metode TLC dapat dilakukan dengan harga yang sangat murah dan dalam
waktu yang singkat. Variasi dari fase gerak memungkinkan terjadinya pemisahan bahkan
untuk senyawa kompleks. Perbedaan warna akan dengan mudah terlihat.

Kelemahan : Oksidasi (dari lipid tidak jenuh) hanya akan terjadi jika piringan TLC
disimpan terlebih dahulu karena sebagian besar permukaan lipid terpapar oleh oksigen
dari atmosfer.

Keterangan : Biasa digunakan sebagai metode awal ketika menganalisis campuran lipid
yang kompleks.
Cara Kerja KLT :
a.

Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil

dengan diameter partikel antara 10-30 m. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase
diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT
dalam hal efisiensi dan resolusinya.
Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara
mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi (Gandjar & Rohman,
2007).
11

b.

Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-

coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah
diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah
beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
1.

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan
2.

teknik yang sensitif.

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

3.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,

polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga
menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil
eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf
secara signifikan (Gandjar & Rohman, 2007).
c.

Penotolan Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling

sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 l, maka
penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan
(Gandjar & Rohman, 2007).
d.

Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan

sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase
gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam
fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng
yang telah berisi totolan sampel.

12

Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak
sedikit mungkin, akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian
lempeng yang telah ditentukan. Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana
dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung dari kertas saring,
maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar & Rohman, 2007).
e.

Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia

yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui
cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan
untuk menampakkan bercak adalah dengan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi
sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat
berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas (Gandjar & Rohman, 2007).
Deteksi senyawa dilakukan dengan menggunakan detektor UV di bawah sinar UV 254
nm, indikator pada plat KLT akan memancarkan warna hijau dan pada UV 366 nm akan
memancarkan warna ungu. Komponen yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm
akan tampak sebagai bercak gelap pada plat yang bercahaya (Gibbons, 2006). Metode
deteksi lain adalah dengan menggunakan pereaksi semprot.
2. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Pemisahan pada fase diam pada keadaan tekanan tinggi oleh elusi dengan pelarut
yang berbeda.
Kelebihan : Pemisahan yang dapat terjadi berkualitas tinggi. Dapat diaplikasikan pada
skala preparat. Jika disertakan dengan MS akan lebih stabil dengan baik.
Kekurangan : Lebih mahal dan memerlukan waktu yang lebih lama dibandingkan TLC.
Sulit dalam mendeteksi asam lemak jenuh (sedikitnya penyerapan UV). Penurunan post
kolom masih diragukan.
Keterangan : Metode rutin yang dilakukan pada banyak laboratorium untuk mengisolasi
lipid. Namun mencari kesesuaian komposisi fase gerak agak sulit.
13

Cara Kerja :
Pada

prinsipnya

kerja HPLC adalah

sama

yaitu

pemisahan

analit-analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan
tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang
puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan
hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton
< golongan alcohol < golongan asam.
a.

Pompa
Pompa pendeteksian tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa

semprit. Pompa torak menghasilakan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam
denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detector yang stabil jika
detector peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak terbatas.

b.

Injector
Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan

agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran
henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:

Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system

tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada

kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 70 atmosfir. Tapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari
septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.

Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume

lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load,
14

sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel
akan masuk dalam kolom.

c.

Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis

bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi
kolom analitik dan kolom preparative.

d.

Detector
Detector diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen

kolom dan mengatur jumlahnya. Detector yang baik sangat peka, tidak banyak berderau,
rentang tanggapan liniernya lebar dan menggapai semua jenis senyawa.
Jenis-jenis detector :

UV/Vis

Retraktif indeks (RI) detector

Konduktifitas decetor

Elektroimia detector

PDA

ELSD

MS dectetor

e.

Fase gerak

Fase gerak memiliki syarat-syarat :

Murni, tanpa cemaran

Tidak bereaksi dengan kemasan

Sesuai dengan detector

Dapat melarutkan cuplikan

Mempunyai viskositas rendah

Memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan

Harganya wajar

15

3. Gas Chromatography
Pemisahan senyawa-senyawa mudah menguap dalam gas pembawa. Proses
deteksi biasanya ditunjukan oleh spektrometri masa.

Kelebihan : Sangat stabil dalam analisis asam lemak. Perlatan otomatis sudah tersedia
secara komersial.

Kekurangan : Hanya senyawa udah menguap yang dapat di analisis. Sehingga turunan
dari analit dibutuhkan.

Keterangan : Teknik yang paling banyak digunakan untuk pengujian dan pengukuran
komposisi asil dari lemak. Namun banyak tergantikan oleh ionisasi teknik MS.

Cara Kerja GC :
GC : pemisahan campuran berdasarkan sifat volatilitas masing2 komponen penyusun
campuran. Interaksi antara komponen sampel dengan fase gerak dan fase diam pada alat
GC.

Asam lemak dibuat volatile dengan metode metilasi asam lemak, terbentuk
senyawa metil ester yang volatile.

Senyawa metil ester asam lemak diinjeksikan dalam kolom GC, terpisah
berdasarkan volatilitas nya.

Komponen yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan alat detektor ionisasi
nyala api (Flame Ionization Detector/FID).

16

Gambar.2 Skema Gas Kromatografi

Hasil deteksi dibandingkan dengan standar asam lemak yang telah diketahui jenis
dan konsentrasinya

Waktu retensi (relatife retention time / RRT) masing2 asam lemak tergantung
pada panjang rantau dan jumlah ikatan rangkap.

Gambar 3. Kromatogram Asam Lemak

4. Ionisasi Halus Lembut Spektometri Massa

MALDI dan ESI MS dapat mengkarakterisasi lipid tanpa fermentasi analit utama.

17

Keunggulan :
Kedua teknik sangat sensitive dan dapat menganalisis analit secara langsung. Perlakuan
biasanya sangat sederhana.

Kekurangan : Penurunan tekanan ion dapat terjadi, contohnya ketika terdeteksinya

kelas lipid dengan perbedaan sensitivitas yang drastic. Pemurnian mempengaruhi kualitas
spectral secara signifikan.

Keterangan : Metode ini sangat berkembang dengan pesat. Sejauh ini, metode ESI yang
paling sering digunakan untuk menganalisis lipid, namun aplikasi dari metode MALDI
justru bertambah. Dapat mendeteksi jaringan biologis.

Cara Kerja :
Electrospray ionization (ESI) merupakan teknik yang digunakan dalam mass spectrometri
untuk menghasilkan ion. Khususnya untuk menghasilkan ion dari makromolekul karena
ada kecenderungan molekul tersebut menjadi fragment saat diionisasi. Pengembangan
electrospray ionization untuk analisa makromolekul biologi merupakan sebuah kerja
keras jadi John Bennet Fenn pada tahun 2002 dan memperoleh sebuah Nobel dibidang
Kimia. Satu dari instrumen asli yang digunakan oleh Dr. Fenn saat ini di pajang di
Chemical Heritage Foundation in Philadelphia, Pennsylvania.
Mass spectrometry yang menggunakan teknologi ESI disebut dengan electrospray
ionization mass spectrometry (ESI-MS) atau juga dengan sebutan electrospray mass
spectrometry (ES-MS).
MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) adalah teknik soft ionization yang
digunakan pada spektometri masa yang melibatkan analisis biomolekul (seperti DNA,
Protein, peptide, dan gula) dan molekul organic yang besar (seperti polimer, dendrimer,
dll).

18

5.

H/13C NMR

Perbedaan masa jenis electron menyebabkan perbedaan perubahan kiawi dari nucleus
dari senyawa yang diberikan.

Keunggulan :
Secara umum, semua jenis lipid dapat terdeksi. Percobaan-percobaan lain yang
memiliki hubungan dengan metode ini dapat dicantumkan untuk menemukan informasi
yang lebih lengkap, contohya untuk mengklasifikasikan isomer.

Kekurangan :
Diperlukan spectra yang kompleks ketika menganalisis campuran. Sensitivitas
sangan terbatas (13 C) dan membutuhkan larutan yang terdeturasi. Peralatan yang mahal
dibutuhkan.

Keterangan :
NMR dapat dengan mudah digunakan pada keadaan dalam makhluk hidup (NMR
Managing).
Cara Kerja 1H/13C NMR :
Metode spektroskopi jenis ini didasarkan pada penyerapan energi oleh partikel
yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Pada umumnya metode ini
berguna sekali untuk mengidentifikasi struktur senyawa / rumus bangun molekul
senyawa organik. Jumlah dan tempat proton dalam molekul senyawa organik
menentukan bentuk spektrum yang dihasilkan.Energi yang dipakai dalam pengukuran
dengan metode ini berada pada daerah gelombang radio 75-0,5 m atau pada frekuensi 4600 MHz, yang bergantung pada jenis inti yang diukurnya, NMR bermacam-macam
ragamnya, misalnya NMR 1H, 13C, 19F

19

Inti yang dapat diukur dengan NMR yaitu :

a. Bentuk bulat
b. Berputar
c. Bilangan kuantum spin =
d. Jumlah proton dan netron ganjil, contoh : 1H, 19F, 31P, 11B, 13C.

Dalam keadaan normal (inti tidak dikenai/diletakkan pada medan magnet

eksternal), semua orientasi dari suatu inti berenergi sama (degenerasi). Bila inti dikenai
medan magnet, maka orientasi/tingkat spin tidak lagi berenergi sama. Hal ini disebabkan
karena inti mempunyai momen magnetik () yang ditimbulkan oleh berpusingnya
muatan. Jumlah orientasi yang mungkin bagi suatu inti bila padanya dikenakan medan
magnet homogen eksternal ditentukan oleh bilangan kuantum spin (I) dari inti tersebut,
sesuai dengan persamaan :
Jadi untuk inti 1H dan 13C, dengan I = , masing-masing akan mempunyai dua
macam orientasi (2 x + 1 = 2), yaitu + (searah dengan medan magnet) dan
(berlawanan arah/melawan medan magnet). Tingkatan spin + berenergi lebih rendah
karena searah dengan medan magnet karena searah dengan medan magnet eksternal,
sedang tingkatan spin berenergi lebih tinggi karena melawan medan magnet
eksternal.

1.3. Ekstraksi Lipid dari Sampel Biologis

Langkah awal dari analisis lipid biasanya adalah ekstraksi lipid. Ekstraksi lipid
sangat penting karena banyak lipid yang tidak bisa langsung dianalisis karena masih
berada atau terikat di bahan biologis dengan senyawa lain. Misalnya, gugus alifatik
hidrofobik lipid berinteraksi dengan sisi nonpolar dari protein, terutama dengan asam
amino valin, leusin, atau isoleusin. Selain itu, kelompok asam fosfat lipid berinteraksi
kuat dengan ion logam yang biasanya berikatan dengan protein. Contoh-contoh ini
menunjukkan bahwa lipid sering berikatan dengan senyawa lain. Oleh karena itu, lipid
harus diekstraksi dahulu sebelum di analisis.

20

Pelarut

Terutama cocok untuk

Keterangan

CHCl3/CH3OH (2:1,v/v)

Lipid

hewan,

Jumlah

Metode Folch

tumbuhan, dan jaringan

penting

bakteri

menghindari hilangnya

dari

air

sangat
untuk

lipid
CHCl3/CH3OH

(1:1,

Berguna untuk sistem

Terjadi

v/v) Metode Bligh and

yang kaya air, terutama

sebagian lipid nonpolar,

Dyer

cairan tubuh

seperti TAG

Butanol jenuh dengan air

Lipid tanaman (contoh:

Memberikan pemulihan

lipid dalam pati), lipid

lisolipid

polar

baik

Heksana/2-propanol (3:2,

Kandungan rendah non-

Dibandingkan

v/v)

lipid (protein, pigmen,

CHCl3,

molekul

isopropanol

kecil)

ekstrak

di

kehilangan

yang

pelarut

campuran pelarut sangat

tingkat

non polar

rendah saja
untuk

dengan

heksana

karena

cocok

sangat

untuk

dan

adalah
yang

toksisitasnya

Kloroform/isopropanol

Sangat

Diindikasikan

(7:11, v/v)

eritrosit dengan kadar

memberikan hasil lipid

lemak yang tinggi

(yield) yang besar

Kloroform/metanol/12N

Fosfolipid asam seperti

Penambahan

HCl

HCl (2:4:0.1, v/v/v)

PS dan fosfoinositide

meningkatkan

hasil

ekstraksi
Tetapi

lipid

untuk

asam.

metode

ini

menyebabkan hidrolisis
sempurna

dari

plasmalogen
Tabel 1. Tabel metode untuk mengekstrak lipid dari sampel biologis

21

Metode Folch
Jaringan dihomogenisasi dengan kloroform / metanol (2/1) untuk volume akhir 20

kali volume sampel jaringan (1 g dalam 20 ml campuran pelarut). Setelah dispersi,

seluruh campuran diaduk selama 15-20 menit dalam orbital shaker pada suhu kamar.
Kemudian homogenat tersebut disaring (dengan kertas saring) atau disentrifugasi untuk
memulihkan fase cair. Lalu pelarut dicuci dengan 0,2 volume (4 ml untuk 20 ml) air atau
lebih baik dengan 0,9% larutan NaCl. Setelah divortex selama beberapa detik, campuran
disentrifugasi pada kecepatan rendah (2000 rpm) untuk memisahkan dua fase. Pisahkan
fase atas dengan menyedot dan menyimpannya untuk menganalisis gangliosida atau
molekul polar organik. Setelah sentrifugasi dan menyedot fase atas, fase bawah
kloroform yang mengandung lipid diuapkan di bawah vakum dalam evaporator putar atau
di bawah aliran nitrogen jika volume di bawah 2-3 ml.

Metode Bligh dan Dyer

Merupakan metode yang ekonomis untuk mengekstrak lipid dari sejumlah besar

jaringan basah, khususnya jaringan ikan beku, dengan mengggunakan volume pelarut
yang minimum. Air dalam jaringan merupakan komponen penting dalam sistem ekstraksi
dan hanya kloroform dan metanol secukupnya saja yang ditambahkan ke dalam sistem
fase tunggal untuk homogenasi. Setelah disaring, residu dire-homogenasikan dengan
kloroform untuk memastikan bahwa lipid telah terekstrak secara sempurna dan lapisan
organik ditambahkan ke dalam larutan garam yang membentuk campuran. Lapisan
kloroform akan mengandung lipid.

Butanol jenuh dengan air

Untuk mengekstraksi lipid polar yang dianjurkan ialah butanol yang jenuh dengan

air. Kompleks lipid-protein atau lipid-karbohidrat mungkin tidak larut dalam pelarut
nonpolar. Dengan adanya alkohol senyawa kompleks ini terurai, sehingga lipid dapat
terekstraksi.

22

Heksana / 2-propanol
Mencampur lipid dengan heksana dan 2 propanol dengan perbandingan volume
3:2

Kloroform / isopropanol

Mencampur lipid dengan kloroform dan isopropanol dengan perbandingan volume 7:11

Kloroform / metanol / 12N HCl

Mencampur lipid dengan kloroform, methanol, dan 12N HCl dengan perbandingan
volume 2:4:0.1

II. Kromatografi Layar Tipis

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponenkomponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
Sedangkan fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung
substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar ultra violet. Pendaran ini ditutupi
pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak
tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Namun, apabila di sinarkan dengan sinar UV
pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercakbercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap di sinarkan pada lempengan, harus dilakukan penandaan posisiposisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pensil dan melingkari daerah bercakbercak itu. Ketika sinar UV dimatikan, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Prinsip Kerja KLT

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan
fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah
berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu :
kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

23

Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses
elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab
itu pemisahan komponen secara

kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan

jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya

pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak
digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut
yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya
dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka
senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like
dissolved like.

2.1 Fase Diam

Fase Diam dan Fase Gerak KLT
Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah
tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam
fase gerak akan bergerak lebih cepat. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat
berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas).
Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang
terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
berbeda.

Fase Diam
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika gel
atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang
keras. Gel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi
lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam
sinar ultra violet. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium
oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH.
24

Fase Gerak
Dalam kromatografi, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses
elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran
pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis
adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Penggolongan ini dikenal sebagai deret
eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut
yang relatif tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan tergantung pada:
Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, Hal ini bergantung pada bagaimana
besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

Kelebihan Metode Kromatografi Lapis Tipis

Beberapa keuntungan dari kromatografi lapis tipis ini adalah sebagai berikut :
Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.
Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,
fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang
dengan metode kertas tidak bisa
Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak.
Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)
Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).
Preparasi sample yang mudah
Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak
mungkin
25

 Kebutuhan ruangan minimum

Analisis KLT banyak digunakan karena :
Waktu yang diperlukan untuk analisis senyawa relatif pendek
Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang
konstituen utama dalam sampel
Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel
Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis
kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.

2.2 Sistem Deteksi

2.2.1 Tidak Destruktif dan Tidak spesifik

Metode identifikasi yang sering digunakan adalah mereaksikan plat TLC
dengan uap iodine yang akan membentuk ikatan non-kovalen, coklat kompleks dengan
lipid. Namun, lipid yang jenuh sepenuhnya sulit didapat, dimana iodin tidak bisa
dihilangkan seluruhnya dari lipid tidak jenuh (mengandung contoh. residu
arachidonoyl) karena iodin sudah berikatan dengan ikatan rangkap. Adsorbsi dengan
iodin atau penyemprotan dengan asam sulfat dan pemanasan adalah metode pemisahan
yang kurang spesifik dan bisa digunakan untuk mengidentifikasi karakter umum dari
sampel yang sama sekali belum diketahui kandungannya. Absorbsi uap iodin dari
Kristal pada ruang tertutup akan menghasilkan titik coklat pada latar kuning yang
mengandung hampir seluruh senyawa organic, kecuali beberapa senyawa alkali jenuh.
Pewarnaan dengan iodin adalah metode tidak merusak dan reversible setelah evaporasi
dilakukan.

26

Gambar 4. Hasil Deteksi lipid dengan Iodin

Sumber:https://www.researchgate.net/figure/235757923_fig7_A-Autoradiogram-ofTLC-plate-showing-hydrolysis-of-the-lipid-DGDG-by-F-solani-pisi

Pewarnaan dengan 2,7 dichlorofluorescein atau rhodamin 6G akan

menghasilkan titik berwarna merah muda atau kuning, jika plat TLC disinari sinar
UV. Rhodamine sangat berguna saat sistem larutan alkalin sudah digunakan dan 2,7
dichlorofluorescein dipilih daripada larutan asam karena kestabilan pewarnanya.
Kedua pewarna bisa dihilangkan dengan mudah jika kepolaran larutan berubah, atau
lipid ( dengan pewarna yang terikat) dilewatkan kolom pendek. Hal ini juga berlaku
untuk pewarna primulin yang bisa digunakan dengan cara serupa dan memiliki
sensivitas lebih dari rhodamine. Hal ini juga menunjukan polyunsaturated lipids
menunjukkan warna gelap yang lebih pekat saat pemisahan dilakukan dengan
AgNO3, ini disebabkan oleh reduksi Ag+ menjadi colloidal silver. Pemekatan ini
bergantung pada komposisi sisten larutan dan membutuhkan senyawa hidrokarbon
aromatic, seperti toluene.

27

Reagent

Manipulation

Spots

UV

Brown

UV

Fluorescence

UV

Fluorescence

Iodine
Vapor
0.001%

0.01%

Rhodamine CG in
acetone
Fluorescein in
EtOH
2,7,-

0.01%

dichlorofluorescein
in EtOH water
Water

Translucent
background

White

Tabel 3. Reagent Non Destructive, Non Spesific for Lipid Detection

2.2.2 Destruktif dan Tidak Spesifik

Menyemprotkan plat TLC dengan reagen yang korosif dan membakar plat
sehingga lipid dapat terlihat, adalah metode yang sering digunakan. Pembakaran
dengan menggunakan asam sulfat adalah metode yang destruktif. 50% asam sulfat
dalam methanol maupun air adalah system pelarut yang biasa digunakan, selanjutnya
plat, yang harus mengandung sorbent dan pengikat yang tidak dapat terbakar, biasanya
dipanaskan hingga suhu sekitar 120oC selama 1 jam untuk merubah zona yang
mengandung senyawa organic menjadi zona berwarna hitam kecoklatan pada latar
putih. Intensitas dari spot hitam ini bisa dianalisa secara kuantitatif (limit deteksi
sekitar 25-50 mg per kelompok lipid) menggunakan videodensitometri. Reagent yang
berbeda, seperti potassium dikromat (5%) dalam 40% asam sufat atau larutan cuprum
asetat 3 6% dalam 8 10% asam phospat, juga dapat digunakan. Beberapa reagen
pembakar menghasilkan zona fluorescent pada temperature rendah sebelum
pembakaran berlangsung pada suhu tinggi. Walaupun mekanisme detailnya tidak
diketahui secara luas, perlu diingat bahwa lipid jenuh dan tidak jenuh membutuhkan
waktu yang berbeda untuk tereduksi menjadi karbon.

28

Gambar 5. Hasil Deteksi Lipid dengan Stain Asam Sulfat

Sumber: https://www.scienceopen.com/document/vid/5499036e-e6af-4582-90e326a67934e66a

20% ammonium bisulfat dalam air, juga biasa dipakai sebagai reagent pembakar
lemak, uap hasil pembakaran dengan ammonium bisulfat juga lebih tidak korosif jika
dibandingkan dengan asam sulfat. Walaupun proses pembakaran memiliki kekurangan
yang besar, karena dapat merusak lipid seluruhnya, metode ini sangat sensitive.
Metode ini dapat mendeteksi lipid hingga 1g. Sterols memberikan warna merah
keunguan sebelum menjadi hitam, dan ini merupakan petunjuk yang berguna.

29

Reagent

Manipulation

Spots
Brown

50%

H2SO4 in MeOH

110oC

black

Cupric Acetate in

3%

8% H3PO4
Cupric Acetate in

8%

8% H3PO4
Molybdophosphoric

5%

acid in EtOH

0.04%

0.03%

Bromothymol blue
in 0.1 NaOH
Coomasie brilliant
blue R in 20% NaOH

180oC

Black

160oC

Black

120oC

Blue

Bluegreen
Blue

Tabel 4. Reagent Destructive, non specific for Lipid Detection

2.2.3. Destruktif, spesifi

Reagen berbeda akan bereaksi secara selektif dengan bagian lipid tertentu dan
menghasilkan produk berwarna. Sebuah survey sangat sering menggunakan reagen pada tabel.

30

Banyak zat pewarna berbda dibandingkan berdasarkan kemampuan sensitivitas. Warna

paling sensitif didapatkan dengan 0.2% amido black 10B dalam 1 M NaCl: Setelah direndam
dalam air, piring TCL dimasukkkan ke larutan pewarna beberapa menit. Sensitivitasnya
sekitar 15 ng untuk DAG, TAG, dan PS, sedangkan 100 ng untuk asam lemak bebas dan 500
ng phorbol ester dapat dideteksi. Ada juga debat apakah metode dicelupkan dan disemprot
memberikan hasil yang dapat dibandingkan
Penyemprotan dilakukan di dalam laboratorium.Piring yang sudah dikeringkan
diletakkan di atas kertas atau kotak semprot. Penyemprotan dialkukan dengan jarak 15 cm
dengan gerak seragam atas-bawah dan kanan-kiri sampai lapisan tertutup. Pencelupan
biasanya metode terbaik untuk mengaplikasikan reagen seragam dan menghasilkan hasil
paling bisa dikembangkan dalam analisis kuantitatif densitometric.Pengunaan reagen spesifik
menjadikan penggunaan TLC dengan resolusi lebih rendah karena zona interferensi tidak akan
terdeteksi. Reagen special tertentu digunakan untuk memvisualisasikan senyawa berdasarkan
aktivitas biologis.
Contoh:
1.

Reaksi Orcinol

Melarutkan 20 mg orcinol dalam 10 mL asam sulfat 70%. Larutan ini dapat

disimpan beberapa hari pada suhu 4oC.

Piring disemprotkan dengan larutan orcinol dan dipanaskan pada 100oC dalam
oven selama 10-15 menit.
31

Titik yang mengandung gula terlihat pink-violet pada latar belakang putih. Batas
deteksinya sekitar 0.5 nmol dari total gula per titik, sehingga, sesedikit 0.5-1 mg
glikolipd dapat dideteksi

2.

Reaksi Naphthyl ethylenediamine

Menyiapkan larutan 13 mM N-(1-naphthyl) ethylenediamine (34 mg dalam 10

mL) dalam methanol/conc. Asam sulfat (97/3, v/v) .

Menyemprotkan piring dengan reagen dan dipanaskan 125oC selama 10 menit.

Glikolipid terlihat pink pada latar belakang putih tetapi warnanya memudar
dengan cepat. Batas deteksi sekitar 100 pmol gula pada titik (0.1 mg lipid)

3.

Reaksi Hydroxytetralone

Melarutkan 10 mg reagen dalam asam sulfat 80%. Menjaga larutan pada 4oC.

Piring disemprotkan dengan larutan reagen dan dipanaskan pada 120oC selama
10 menit. Intensitas fulorescent glikolipid pada piring ditentukan pada eksitasi
panjang gelombang 470 nm dengan optical cut-off filter (500 nm). Glikolipid
berwarna kuning dan phospholipid berwarna biru. Responnya linear dengan
batas konsentrasi 10 100 pmol dan batas deteksi sekitar 3 pmol glikolipid.

32

Daftar Pustaka

Campbell, P.N., A.D. Smith. 1982. Biochemistry Illustrated. Wilture Enterprises. Hong Kong.

De Man, J.M. 1997. Kimia Makanan. Terjemahan. ITB. Bandung.

Detection (Visualization) of TLC Zones - [www.rhodium.ws]. 2016. Detection (Visualization) of

TLC Zones - [www.rhodium.ws]. [ONLINE] Available at:
https://www.erowid.org/archive/rhodium/chemistry/equipment/tlc.visualization.html. [Accessed
07 April 2016].

Girindra, A. 1986. Biokimia 1. Gramedia. Jakarta.

Glycoglycerolipids-TLC. 2016. Glycoglycerolipids-TLC. [ONLINE] Available at:

http://www.cyberlipid.org/glyt/glyt0003.htm. [Accessed 07 April 2016].

Houston,

M.E.

1995.

Biochemistry

Primer

For

Exercise

Science.

Human

Kinetics.Champaign.USA.

Kay, E.R.M. 1966. Biochemistry : An Introduction to Dynamic Biology. CollierMacmillan.Canada.

Kuchel, P., G. B. Ralston. 2006. Biokimia. Schaum. Terjemahan. Erlangga. Jakarta.

Lehninger, A..L., et al. 1997. Principles of Biochemistry. 2nd .Worth Publisher.

New York.

Ngili Yohanis.2009. Biokimia : Struktur dan Fungsi Biomolekul. Graha Ilmu. Yogyakarta.

33