Analisis Genom Dan Karakteristik Pertumbuhan Virus Dengue Dari

Makassar, Indonesia
R. Tedjo Sasmono a,b,1,*, Isra Wahid a,c,2, Hidayat Trimarsanto b,d, Benediktus Yohan a,b,1, Sitti
Wahyuni a,c,2, Martin Hertanto a,3, Irawan Yusuf c, Halim Mubin c, Idham J. Ganda c, Rachmat
Latief c, Pablo J. Bifani e, Pei-Yong Shi e, Mark J. Schreiber e,4
a

Novartis-Eijkman-Hasanuddin Clinical Research Initiative (NEHCRI), Indonesia

Eijkman Institute for Molecular Biology, Jl. Diponegoro 69, Jakarta 10430, Indonesia

Faculty of Medicine, Hasanuddin University, Jl. Perintis Kemerdekaan 10, Tamalanrea,

Makassar 90245, Indonesia

d
e

Agency for the Assessment and Application of Technology, Jakarta 10340, Indonesia
Novartis Institute for Tropical Diseases (NITD), 10 Biopolis Road, Chromos #05-01,

Singapore 138670, Singapore

ABSTRAK
Demam berdarah merupakan penyakit virus nyamuk yang paling penting di
Indonesia. Di Provinsi Sulawesi Selatan, sebagian besar wilayah melaporkan kasus DBD
termasuk ibu kota, Makassar. Saat ini, tidak ada informasi yang tersedia pada serotipe dan
genotipe virus yang beredar di daerah tersebut. Untuk mengetahui dinamika penyakit demam
berdarah di Makassar, kami melakukan penelitian surveilans demam berdarah selama 20072010. Sebanyak 455 pasien direkrut, di mana deteksi antigen dan serologi mengungkapkan
kasus DBD yang dikonfirmasi sebanyak 43,3% pasien. Deteksi molekuler menegaskan kasus
DBD pada 27,7% pasien, menunjukkan dengue yang menempatkan beban penyakit yang
signifikan pada masyarakat. Serotyping mengungkapkan bahwa virus dengue serotipe 1
(DENV-1) adalah serotipe yang paling dominan, diikuti oleh DENV-2, -3, dan -4. Untuk
menentukan evolusi molekuler dari virus, kami melakukan seluruh peruntunan genom dari 80
isolat. Analisis filogenetik dikelompokkan DENV-2, -3 dan -4 dengan Genotipe kosmopolitan
masing-masing Genotipe I dan Genotipe II. Menariknya, setiap cat serotipe berbeda pada
gambar evolusi dan transmisi. DENV-1 tampaknya akan mengalami pengganti clade dengan
Genotipe IV yang digantikan oleh Genotipe I. Cosmopolitan DENV-2 isolat yang ditemukan
regional endemik dan sering dipertukarkan antar negara di kawasan itu. Sebaliknya, DENV-3

dan DENV-4 isolat yang berhubungan dengan strain dengan sejarah panjang di Indonesia
meskipun DENV-3 strain tampaknya telah mengikuti jalur evolusi yang berbeda sejak sekitar
1998. Untuk menilai apakah berbagai serotipe DENV / genotipe memiliki karakteristik
pertumbuhan yang berbeda, kami melakukan tes kinetik pertumbuhan pada virus yang
dipilih. Kami mengamati tingkat yang relatif lebih tinggi dari replikasi untuk-DENV 1 dan -2
dibandingkan dengan DENV-3 dan -4. Dalam-DENV-1, virus dari Genotipe I tumbuh lebih
cepat daripada Genotipe IV. Tingkat replikasi yang lebih tinggi mungkin mendasari
kemampuan mereka untuk menggantikan sirkulasi dari Genotipe IV di masyarakat.
Latar Belakang
Demam berdarah adalah penyakit demam akut yang disebabkan oleh infeksi virus
dengue (DENV), ditularkan melalui vektor nyamuk Aedes aegypti. Gejala-gejala infeksi
DENV bervariasi dari klasik. Demam Berdarah (DB) menjadi

parah seperti Demam

Berdarah Dengue Dengue (DBD) dan berpotensi fatal Dengue Shock Syndrome (DSS).
DENV adalah flavivirus menyelimuti dengan 10,7 kb tunggal terdampar positif-sense RNA
genom. Ada empat antigen serotipe yang berbeda dari virus (DENV-1, -2, -3, dan -4), dengan
sekitar 65% genom kesamaan, beredar di seluruh daerah tropis dan daerah sub-tropis di dunia
(Gubler, 1998; Guzman et al.,2010). Penyakit yang disebabkan oleh empat serotipe memiliki
gejala yang identik.
Indonesia merupakan negara endemik DBD yang mengalami wabah penyakit secara
periodik, seperti pada tahun 1998 (Corwin et al., 2001) dan 2004 (Suwandono et al., 2006).
Selain itu, kejadian tahunan dan sporadis teratur menimpa semua 33 propinsi di kepulauan
Indonesia (Sumarmo, 1987). Meskipun ada penelitian yang menjelaskan genetika molekuler
virus demam berdarah yang diisolasi dari bagian barat dari Indonesia (Sumatera dan
Kepulauan Jawa) (Ong et al., 2008; Raekiansyah et al., 2005), tidak ada data yang tersedia
untuk lainnya utama pulau di bagian Timur Indonesia, seperti Pulau Sulawesi. Data dari
Sulawesi Selatan otoritas kesehatan provinsi menggambarkan meningkatnya jumlah insiden
dengue di Provinsi Sulawesi Selatan pada tahun 2007, di mana 5333 pasien dirawat di rumah
sakit. Di Makassar, kejadian DBD tercatat 425 kasus dengan 5 kematian. Diagnosis DBD di
Makassar umumnya dilakukan berdasarkan gejala klinis namun kurangnya sumber daya dan
biaya tes laboratorium relatif tinggi melarang konfirmasi serologis. Karena ini, kejadian yang
dilaporkan tidak mewakili kejadian penyakit yang sebenarnya.

Analisis perbandingan genom dengue telah digunakan secara luas untuk mempelajari
keragaman genetik dari virus dengue (Holmes dan Burch, 2000; Holmes dan Twiddy, 2003)
dan studi sebelumnya juga mejelaskan korelasi antara patogenisitas virus dengan struktur
genetik dimana mutasi mampu meningkatkan viral genome patogenesis virus (Leitmeyer et
al, 1999;. Pandey dan Igarashi, 2000). Untuk memahami penyakit demam berdarah dinamis
dalam Kota Makassar, Indonesia, kita mempelajari evolusi molekul beredar virus dengue
dengan menganalisis genom virus yang terisolasi di daerah. Kami mengamati keragaman
serotipe dan genotipe virus dengue dan hipotesis bahwa isolasi spasial dapat berkontribusi
pada keragaman virus dengue yang beredar di Makassar, Sulawesi Selatan, Indonesia. Untuk
melengkapi Data virus genetik, kami melakukan karakterisasi pertumbuhan virus berbagai
serotipe / genotipe. Penelitian ini memberikan informasi dalam karakteristik genetik dan
biologis dari virus dengue dengan beragam strain yang beredar di Makassar, Indonesia.
Metode Penelitian
Metode Sampel
Kami melakukan pengawasan pasien demam berdarah di Makassar, Sulawesi Selatan,
Indonesia. Kota dengan luas 175,77 km2, dihuni oleh sekitar 1,3 juta orang. Kota Makassar
terletak sekitar 1400 km sebelah timur dari ibukota Indonesia Jakarta. Adanya virus denguedicurigai pada pasien demam di Rumah Sakit Dr. Wahidin Sudirohusodo, Labuang Baji,
Rumah sakit Daya dan pusat kesehatan masyarakat di Makassar yang terdaftar dalam
penelitian telah mendapat persetujuan tertulis. Untuk anak di bawah umur / anak - anak,
diperoleh persetujuan tertulis dari orang tua / wali hukum. Kami memperoleh etika izin untuk
penelitian ini dari Komite Etika Penelitian Medis Universitas Hasanuddin dan Komite Etika
Eijkman Institute. Semua pasien berusia antara 5 dan 100 tahun dengan demam > 380 C
selama kurang dari 72 jam dan tanpa tanda-tanda adanya infeksi saluran pernapasan atas atau
diagnosis alternatif yang jelas untuk dengue diundang untuk berpartisipasi dalam penelitian
ini. Secara total, kami memperoleh 455 sampel serum selama periode perekrutan pasien (Mei
2007-Agustus 2010).
Skrining awal pada pasien yang diduga demam berdarah ditentukan IgM serologis
menggunakan anti-demam berdarah dan IgG (Panbio Dengue Duo IgM / IgG enzyme-linked
immunosorbent assay kit (ELISA) (Panbio,Brisbane, Australia). Konfirmasi Dengue melalui
deteksi antigen NS1 dilakukan dengan rapid test kit NS1 (Diagnostik Standar, Korea).
Infeksi Primer dibandingkan infeksi dengue sekunder ditentukan menggunakan hasil ELISA

menurut protokol pabrik. Secara singkat, IgM positif (> 11 Panbio Unit) dan negatif IgG (<22
Panbio Unit) menunjukkan infeksi primer sementara IgG positif (> 22 Panbio Unit), yang
bisa disertai dengan peningkatan IgM tingkat, menunjukkan infeksi sekunder. Kehadiran
RNA virus di Sampel NS1-positif selanjutnya dikonfirmasikan oleh transcription- terbalik
polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lanciotti et
al. (1992), dengan modifikasi sesuai dengan Harris et al. (1998). Semua kasus dengue positif
dikategorikan baik Demam Berdarah (DB) atau Demam Berdarah Dengue (DBD) sesuai
dengan kriteria dijelaskan oleh WHO (WHO, 1997).

Perkembangbiakan Virus, baris sel, ekstraksi RNA dan serotyping

Virus diisolasi dari sampel positif RT-PCR, baik langsung dari sera pasien atau setelah
satu bagian (atau maksimum dua bagian untuk titer rendah isolat) propagasi virus Aedes
albopictus di C6 / 36 baris sel usus. Ginjal bayi hamster (BHK-21) dan C6 / 36 baris sel
dipertahankan dalam medium RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA). Ginjal monyet hijau
Afrika (Vero 76) garis sel dipertahankan di Minimum Esensial Medium (MEM) dengan
Garam Earle ini (Gibco). Media yang dilengkapi dengan 10% panas dilemahkan janin bovine
serum (FBS; Gibco), 2 mM glutamin, 100 U penisilin / ml, dan 100 lg / ml streptomisin
(Gibco) untuk sel pemeliharaan. BHK-21 dan Vero budaya 76 sel dipertahankan di 37 0 C
inkubator (ESCO) ditambah dengan 5% CO2. Budaya C6 / 36 sel dipertahankan di 28 0 C
inkubator. Persediaan Virus titer diukur menggunakan modifikasi metode uji plak standar
(Fink et al., 2007) dan dicatat sebagai satu unit pembentuk plak (PFU) setara / ml.
QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) yang digunakan untuk
mengekstrak RNA genom virus dari sera atau sel budaya pasien supernatan sesuai dengan
instruksi produsen. RNA virus dengue yang terbalik-ditranskripsi menjadi cDNA
menggunakan Superscript III reverse transcriptase (RT) (Invitrogen, Carlsbad, CA) dan
primer-DENV spesifik (Lanciotti et al., 1992). Selanjutnya, cDNA diamplifikasi
menggunakan polymerase Taq DNA (Roche, Mannheim, Jerman). Empat serotipe dengue
yang dibedakan oleh ukuran produk PCR.
Sekuensing Seluruh Genom
Lima fragmen PCR tumpang tindih meliputi seluruh genom dengue diamplifikasi
menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya (Ong et al., 2008; Schreiber et al., 2009)

dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, RNA genomik yang terbalik-ditranskripsi menjadi
cDNA menggunakan primer spesifik untuk setiap serotipe. Primer yang digunakan untuk
DENV-4 sequencing seperti yang tercantum dalam Tabel 1. Tambahan Fragment amplifikasi
dilakukan dengan menggunakan high-fidelity PFU Turbo DNA polimerase (Stratagen, La
Jolla, CA). Kondisi PCR yang khas yang sebagai berikut: template yang didenaturasi selama
2 menit pada 950C, diikuti 45 siklus 30 detik denaturasi pada 95 0C, 1 menit pemijaran pada
550 C, dan 4,5 menit ekstensi pada 72 0 C. Template diizinkan 10 menit akhir langkah ekstensi
pada 720C diikuti dengan penyimpanan pada 40 C. Produk PCR dimurnikan dari 0,8% gel
agarosa menggunakan ekstraksi QIAquick gel kit (Qiagen) dan digunakan sebagai template
untuk siklus sequencing. DNA sequencing dilakukan dengan menggunakan BigDye Dideoksi
Terminator sequencing kit v3.1 (Terapan Biosystems, Foster City, CA) dengan menggunakan
metode yang dijelaskan dalam kit. Selain sequencing dan amplifikasi primer sebelumnya
dijelaskan oleh Ong et al. (2008), satu set baru primer untuk DENV-4 yang digunakan. Cat
dasar urutan dan diprediksi posisi genom mengikat RT-PCR primer untuk DENV-4 tercantum
dalam Tabel Tambahan 2 dan 3, masing-masing. Reaksi sequencing dimurnikan kemudian
berjalan di ABI3130x l (Applied Biosystems) sequencer di Eijkman yang Fasilitas
sequencing Institute. Perakitan Contig dilakukan dengan menggunakan SeqScape 2,5
(Applied Biosystem) dengan penyesuaian manual tambahan dilakukan saat pemeriksaan
manual perakitan menunjukkan beberapa perbedaan. Semua urutan genom yang diperoleh
dalam penelitian ini telah disimpan di GenBank (Tabel 1)
Analisa Urutan, filogenetik dan evolusi
Kami download semua urutan DNA untuk-DENV-1, -2, -3 dan -4 dari database NCBI
GenBank sebagai dari 13 April 2012. Semua urutan dari serotipe dengue diamati yang
memiliki 90% identitas dengan cakupan sampel untuk 90% dari urutan mereka digeledah
menggunakan USEARCH (Edgar, 2010). Urutan bersama-sama yang diperoleh dengan
sampel kemudian selaras dengan OTOT (Edgar, 2004). Keberpihakan yang dipangkas untuk
mereka 50-UTR dan 30-UTR meninggalkan daerah coding. Kemungkinan maksimum pohon
filogenetik dengan menggunakan model substitusi GTR dan distribusi gamma untuk berbagai
tingkat serotipe dibangun oleh FastTree (Harga et al., 2010). Pohon-pohon filogenetik
digunakan untuk mengumpulkan 60 paling erat terkait urutan diterbitkan dari masing-masing
sampel sebagai referensi urutan dengan menghitung jarak patristik seperti yang diterapkan di
DendroPy (Sukumaran dan Holder, 2010).

Muscle (Edgar, 2004) yang digunakan untuk membuat beberapa orang urutan
keselarasan setiap serotipe virus dengue untuk sampel untrimmed dan urutan referensi
dikumpulkan. Kami dipartisi keberpihakan menjadi 5-UTR, coding dan 3-UTR daerah sesuai.
Kami menentukan model terbaik evolusi untuk setiap wilayah dengan sampling di ruang
model substitusi Bayesian Analisis MCMC seperti yang diterapkan di MrBayes (Huelsenbeck
dan Ronquist, 2001). Untuk semua serotipe, kami memilih GTR dengan berubah-ubah situs
dan 4 kelas gamma-distribusi (GTR + I + C4) dengan Model kodon dan model TRN dengan
situs berubah-ubah dan 4 kelas gamma-distribusi (TRN + I + C4) untuk wilayah coding dan
30- UTR, masing-masing, karena ini adalah model diimplementasikan di BEAST yang cukup
dekat dengan model yang disarankan oleh MrBayes. Bayesian Monte Carlo Markov Chain
(MCMC) simulasi dengan model evolusi yang dipilih sebagai model dipartisi dan jam
molekuler santai yang dihasilkan oleh BEAST (Drummond dan Rambaut, 2007) dan
digunakan untuk memperkirakan evolusi parameter masing-masing serotipe. Sebuah langit
petak Bayesian dipergunakan sebagai coalescent sebelum seperti yang dijelaskan dalam
publikasi sebelumnya (Ong et al., 2008; Schreiber et al., 2009). Untuk setiap jenis virus
dengue, kami melakukan lari dari 100.000.000 ulangan dengan sampling setiap 1000,
menghasilkan 100.000 rantai. PKS (Clade Maksimum Kredibilitas) pohon filogenetik dan
evolusi parameter yang diringkas dengan 25% burn-in. Visualisasi pohon dan sampel
pelabelan dilakukan dengan menggunakan software Figtree.

Uji Kinetik Pertumbuhan virus

Vero 76 sel unggulan dengan kepadatan 2 x 10 5 sel dan diizinkan untuk melampirkan
semalam di 24 piring dengan baik (Nunc). Sel yang kemudian terinfeksi virus dalam rangkap
menggunakan multiplisitas infeksi (Moi) dari 0,1 di 1x MEM dilengkapi dengan 2% FBS dan
diinkubasi pada 370C, 5% CO2 selama 1 jam. Tiga sampai lima isolat virus yang berbeda
untuk masing-masing serotipe diuji. Sebagai perbandingan antara Genotipe-DENV 1, empat
isolat yang berbeda digunakan untuk setiap genotipe. Media inokulasi yang disedot dan diisi
ulang dengan media segar berikut inkubasi. Supernatan budaya yang dikumpulkan pada 12
interval h (yaitu, 12, 24, 36, 48, 60, dan pasca 72 jam inokulasi) dan disimpan langsung
dalam 800C freezer. Titer virus dari setiap titik waktu yang diukur menggunakan alat tes plak
standar pada BHK-21 jalur sel seperti yang dijelaskan sebelumnya (Fink et al., 2007) dan
diplot sebagai kurva kinetik menunjukkan titer rata-rata dan standar penyimpangan. Analisis

statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS Statistik versi 17.0 (SPSS Inc,
Chicago, IL). Analisis satu arah varians (ANOVA) digunakan untuk menganalisis dan
membandingkan cara virus titer antara serotipe DENV. Perbandingan kinetik pertumbuhan
virus antara dua genotipe DENV-1 dilakukan dengan menggunakan independentsamples Ttest siswa. Nilai probabilitas p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
1. Kejadian Dengue di kota Makassar
Empat ratus lima puluh lima pasien demam direkrut selama Mei 2007-Agustus
2010. Dari jumlah tersebut, 197 (43,3%) pasien dengue dikonfirmasi sebagaimana
ditentukan oleh NS1 rapid test kit. RT-PCR pendeteksian dilakukan pada sampel NS1positif dan total dari 126 sera (27,7% dari semua pasien demam berdarah-dugaan)
yang terdeteksi sebagai dengue positif. Laki-laki untuk rasio perempuan adalah 1,14,
dengan Rata-rata usia tua 12,5 10,2 tahun. Kasus terjadi didominasi pada mereka
yang berusia antara 11 dan 20 tahun (40%). kebanyakan demam berdarah kasus
positif (n = 165 atau 83,8%) adalah infeksi sekunder, seperti ditentukan oleh IgM dan
IgG ELISA rasio
2. Distribusi serotipe virus dengue
Kami melakukan uji serotipe pada kasus DBD RT-PCR-dikonfirmasi
menggunakan metode serotyping RT-PCR standar (Lanciotti et al., 1992) dan
memperoleh hasil dalam 126 kasus, yang menunjukkan sirkulasi dari keempat
serotipe dengue di Makassar. Dominan serotipe itu-DENV 1 dengan 51 isolat (41%),
diikuti oleh DENV-2 dengan 39 isolat (31%). Dua puluh lima isolat (20%) adalah
DENV-3; dan sembilan isolat yang tersisa (7%) yang DENV-4. Dua sampel adalah
infeksi campuran-DENV 1 dan -2 dan DENV-2 dan -3. Kita publikasi sebelumnya
dibandingkan pada distribusi serotipe di lain bagian dari Indonesia (Corwin et al,
2001;.. Graham et al, 1999; Porter et al., 2005; Sukri et al., 2003; Suwandono et al.,
2006; Yamanaka et al., 2011) dengan hasil kami. Kami mengamati distribusi serotipe
yang berbeda dari DENV di Makassar dibandingkan dengan kota-kota lain di seluruh
kepulauan Indonesia meskipun kita tidak bisa memastikan bahwa laporan historis
mencerminkan distribusi serotipe saat ini di kota-kota.

3. Analisis filogenetik virus dengue

Untuk menentukan genotipe dominan di Makassar, kami melakukan fulllength sekuensing genom dari virus yang terisolasi. RNA genomik virus diekstraksi
baik dari sera pasien atau setelah satu bagian dari propagasi virus dalam kultur
jaringan. Kita memperoleh urutan genom lengkap 80 virus yang mencakup keempat
serotipe. Tabel 1 menggambarkan karakteristik isolat sequencing termasuk panjang
genom sequencing.
Menggunakan metode kemungkinan maksimum secepat dilaksanakan di
FastTree, kami melakukan analisa filogenetik perkiraan semua serotipe dengue untuk
memilih 60 urutan terkait paling erat- dari masing-masing sampel dengue untuk
urutan referensi untuk berturut-turut analisis.
PKS (Maksimum Clade Kredibilitas) pohon filogenetik DENV-1 isolat dan
urutan terdekat mereka referensi ditunjukkan pada Gambar. 1. Berdasarkan DENV-1
genotipe klasifikasi dengan Goncalves dkk. (2002), kami mengamati peredaran dua
genotipe dari DENV-1 di Makassar. Sebagian besar virus, termasuk semua baru 2010
sampel (29 isolat) milik Genotipe I. 28 isolat dari genotipe I dari nenek moyang
tunggal dan memiliki waktu untuk nenek moyang terbaru (TMRCA) sekitar tahun
2005. Salah satu sampel baru-baru ini (WS88) mungkin diikuti independen rute
pengantar seperti itu garis keturunan yang sama dengan sampel dari Singapore.
Semua sampel Genotipe I berkumpul bersama-sama dengan virus dari Cina, Thailand,
dan Singapura, termasuk Wabah demam berdarah Singapura isolat 2005. Sisa
Makassar DENV-1 virus (6 isolat) dikelompokkan ke dalam Genotipe IV. Tig dari
isolat berkerumun bersama-sama dengan sampel dari Brunei (pada tahun 2006),
Hawaii (2001), Filipina (di 2004) dan China (tahun 1991), dan nenek moyang mereka
mungkin sama dengan sampel Pasifik Barat dari 1974 isolat. Yang lain tiga isolat
berkerumun dengan China isolat 2002/2003 dan kota Indonesia dari Palembang pada
tahun 1998. Perlu dicatat bahwa DENV-1 isolat dari daerah Indonesia lainnya yang
tidak termasuk dalam analisis karena mereka lebih mungkin untuk jauh terkait ke
Makassar sampel dan tidak dipilih selama FastTree / jarak patristik Proses
penyaringan. Pengamatan ini memberikan kontribusi untuk informasi baru pada
DENV-1 distribusi genotipe di Indonesia.
Kami bertekad 26 DENV-2 urutan genom dari Makassar isolat dan dibangun
analisis filogenetik PKS dari mereka virus bersama-sama dengan yang diterbitkan
sebelumnya DENV-2 genom. Berdasarkan DENV-2 klasifikasi genotipe dilansir
Twiddy et al. (2002), semua isolat Makassar kami dikelompokkan ke dalam Genotipe
Cosmopolitan (Gbr. 2). Genotipe ini disebarluaskan dari India ke Asia Tenggara,

Afrika, Timur Tengah, dan Australia. Dalam genotipe Cosmopolitan, Makassar isolat
dikelompokkan bersama dengan dua isolat dari Jakarta pada tahun 2004 dan banyak
isolat dari Singapura (pada tahun 2004, 2005 dan 2008). Itu pohon filogenetik
menunjukkan adanya isolasi spasial antara DENV-2 strain dari kota di bagian barat
dan timur Indonesia, tetapi tidak adanya isolasi spasial antara Makassar dan
Singapura. Pohon itu juga menunjukkan bahwa DENV-2 virus saat ini beredar di
Makassar adalah beberapa entri.
Analisis filogenetik dari 13 DENV-3 urutan genom dari Makassar
mengidentifikasi mereka sebagai milik Genotipe I, berdasarkan klasifikasi dijelaskan
oleh Lanciotti et al. (1994). Genotipe ini terdiri dari virus dari Indonesia, Malaysia,
Filipina dan pulau-pulau Pasifik Selatan (Lanciotti et al., 1994). Virus Indonesia
dikumpulkan pada tahun 1973, 1978 dan 1985 juga dikelompokkan ke dalam genotipe
ini (Lanciotti et al., 1994), seperti yang dilakukan isolat terbaru dari Jakarta pada
tahun 2004 dan Palembang pada tahun 1998 (Ong et al., 2008), seperti ditunjukkan
pada Gambar. 3. Sembilan isolat Makassar berkerumun dengan isolat Indonesia dari
tahun 1998 dan 1988 dari Jakarta dan dari nenek moyang yang sama dengan TMRCA
1990. Empat lainnya Makassar isolat, termasuk 2010 baru-baru sampel, yang
bergerombol dengan sisa Isolat Indonesia dari tahun 1998 dan 2004, serta dari Timor
Leste pada tahun 2005 dan 2005/2009 dari Singapura. Ini mungkin menunjukkan
bahwa semua sampel Makassar yang berasal dari dan menyebar di Indonesia dan
negara-negara tetangga seperti Singapura dan Timor Leste. TMRCA semua Makassar
isolat bersama-sama dengan yang lain Isolat Indonesia adalah 1965. Bersama ini
menunjukkan kehadiran struktur sementara yang kuat dan bahwa Makassar DENV-3
virus tampaknya menjadi bagian dari garis keturunan yang lebih tua yang memang
endemik di wilayah Indonesia dan telah beredar selama lebih dari empat dekade.
Kami melakukan analisis filogenetik pada genom 6 DENV-4 virus yang
diisolasi dari Makassar dan membandingkannya dengan tersedia DENV-4 genom di
GenBank. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, isolat Makassar jatuh ke
Genotipe II berdasarkan klasifikasi Lanciotti (Lanciotti et al., 1997). Genotipe ini
umumnya ditemukan di Asia dan Amerika Selatan-timur (Lanciotti et al., 1997). Itu
Makassar isolat dikelompokkan erat dengan isolat Indonesia lainnya dari Jakarta yang
diisolasi pada tahun 2004. Empat dari sampel Makassar di garis keturunan yang sama
dengan sampel yang berasal Jakarta dari garis keturunan yang memiliki tingkat mutasi
yang lebih tinggi dibandingkan dengan lainnya sampel. The TMRCA dari 4 sampel

Makassar ini dan terkait Sampel Jakarta sekitar tahun 1990. pengelompokan ini
menunjukkan endemisitas ini DENV-4 genotipe di Indonesia, dan kehadiran Link
temporal yang kuat antara DENV-4 virus di Indonesia.
4. Dinamika evolusi dan perbandingan asam amino virus dengue di Makassar
Tarif evolusi taksiran dinamika substitusi semua serotipe, yang dihitung oleh
BEAST, yang 1.1 x 10-3 substitusi / Situs / tahun (95% kepadatan probabilitas
tertinggi (HPD), 0.6 x 10-3-1,8? 10-3 substitusi / situs / tahun) dan 1,5 x 10substitusi /Situs / tahun (95% HPD, 0.7x 10-3-1.7 x 10

-3

substitusi /Situs / tahun)

untuk DENV-1 dan DENV-2, masing-masing. Perkiraan yang sama, 1.1 x 10 -3

substitusi / situs / --tahun (95% HPD, 6.2 x10 - 4- 1.5 x 10-3 substitusi / situs / tahun)
dan 0,2 x 10- 3 substitusi / Situs / tahun (95% HPD, 1.5 x 10 -4-0.8 x 10-3 substitusi /
situs / tahun), diamati untuk masing-masing DENV-3 dan DENV-4. .
Usia diperkirakan dari nenek moyang yang sama terbaru (TMRCA) untuk
semua serotipe yang 62 bulan (95% HPD, 53- 91 bulan), 58 bulan (95% HPD, 51-86
bulan), 56 bulan (95% HPD, 49-82 bulan) dan 55 bulan (95% HPD, 45-78 bulan)
untuk-DENV 1, DENV-2, DENV-3 dan DENV-4, masing-masing.
Rasio relatif rendah non-identik dengan substitusi identik per situs (dN / dS) di
semua gen menunjukkan bahwa tidak ada bukti seleksi positif dalam gen apapun dan
tidak ada bukti untuk pemilihan lokasi spesifik positif virus Makassar (Tabel 2).
Beberapa gen memiliki rasio 1,0 untuk dN / dS di DENV-4, namun karena untuk
sejumlah kecil DENV-4 isolat, kita merasa bahwa dN / dS untuk DENV-4 tidak dapat
ditentukan sebenarnya.
Analisis komparatif di tingkat asam amino yang digambarkan pada Gambar. 5
untuk DENV-1 Genotipe IN (A), DENV-1 Genotipe IV (B), DENV-2 (C), DENV-3
(D) dan DENV-4 (E). Meskipun DENV-1 Genotipe I memiliki jumlah paling sampel,
perbedaan tersebut terkecil di antara sampel set, dan secara substansial jauh lebih
kecil dari DENV-1 genotipe IV. Dalam DENV-1 Genotipe I residu 123 dari Gen E
diamati untuk menjadi baik Serin (S) atau Threonine (T) di banyak 2007 sampel,
tetapi hanya diamati T dalam semua 2.008 sampel. Demikian juga, residu 222 gen
NS1 dalam beberapa 2.007 sampel diamati S atau T, sedangkan sisanya 2008 sampel
diamati untuk menjadi T. Namun, residu 829 dari gen NS5 yang diamati Isoleusin (I)
untuk semua sampel 2007, mulai memiliki Valin (V) dalam beberapa tahun 2008
sampel. Sisa perubahan genotipe DENV tumbuh di mamalia garis Vero 76 sel. Tiga
sampai empat virus yang mewakili masing-masing serotipe / genotipe yang diuji
untuk kinetika replikasi mereka. Pertumbuhan perbandingan kinetik-DENV 1, -2, -3,

Dan -4 ditunjukkan pada Gambar. 6. Kami mengamati-serotipe tertentu perbedaan

replikasi di pos-infeksi 36 dan 48 jam, dengan -DENV 1 dan -2 mereplikasi ke tingkat
yang lebih tinggi dibandingkan dengan DENV-3 dan -4 (Gambar. 6A).
Berikutnya, kami membandingkan replikasi kinetika virus milik dua genotipe
yang berbeda-DENV 1, yaitu, Genotipe I dan IV (Gambar. 6B). Genotipe I rupanya
direplikasi di tingkat yang lebih tinggi dibandingkan dengan Genotipe IV (p value
<0,05). Hal ini menunjukkan kebugaran relatif lebih baik dari Genotipe I yang
mungkin mendasari kemampuan Genotipe ini untuk menggantikan Genotipe IV di
masyarakat. Pola kinetik yang sama diamati ketika garis sel lain (C6 / 36) digunakan
dalam Pertumbuhan percobaan kinetik (data tidak ditampilkan). Replikasi kinetik tes
pada empat virus yang mewakili empat clades dari DENV-2 melakukan tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan (data tidak ditampilkan).

Pembahasan
Kami melakukan penelitian molekul-mengetik pertama dengue di Makassar-Indonesia
untuk menyelidiki dinamika penyakit DBD dari tahun 2007 sampai 2010. Seperti
dikonfirmasi oleh antigen deteksi NS1, kami mengamati virus dengue terinfeksi yang luar
biasa 43,3% dari pasien demam yang datang ke rumah sakit. Data ini mencerminkan
pentingnya penyakit di Makassar dan beban yang cukup besar harus menempatkan pada
infrastruktur ekonomi dan kesehatan setempat. Di hal status infeksi, berdasarkan IgM dan
IgG ELISA deteksi, Data kami menunjukkan tingginya jumlah infeksi dengue sekunder pada
pasien rawat inap yang berpartisipasi dalam penelitian ini (83,8%), menunjukkan intensitas
penyakit berkelanjutan selama beberapa tahun. Distribusi usia pasien dirawat di rumah sakit
ditemukan tertinggi pada pasien muda (10-20 tahun), mirip dengan bagian lain Indonesia
(Corwin et al., 2001). Sangat mungkin bahwa dominan ini kelompok usia dapat berkorelasi
dengan proporsi yang lebih tinggi dari sekunder infeksi diamati.
Sampai saat ini, tidak ada data distribusi serotipe telah tersedia untuk Makassar. Studi
kami menunjukkan sirkulasi keempat dengue serotipe. Kami mengamati dominasi DENV-1
(41%) diikuti oleh DENV-2, -3, -4. Distribusi ini berbeda dari sejarah laporan di bagian lain
dari Indonesia, terutama di Wilayah barat kepulauan, misalnya, di kota-kota Jakarta dan
Palembang pada tahun 2004, di mana DENV-3 adalah dominan serotipe di daerah dan
berkorelasi dengan gejala berat. Kami tertarik untuk mengetahui apakah distribusi serotipe

saat di Jakarta dan Palembang sesuai nilai-nilai sejarah mereka atau jika mereka sekarang
lebih dekat dengan apa yang telah kami temukan di Makassar. Untuk mempelajari dinamika
evolusi dan filogeni dari Virus dengue Makassar, kami melakukan seluruh sekuensing genom
80 isolat virus. Sebagian besar genom yang diurutkan dari sampel infeksi primer karena
kesulitan dalam isolasi virus dari sampel infeksi sekunder, seperti dilaporkan sebelumnya
(Jarman et al., 2011). Berdasarkan klasifikasi diterbitkan genotipe virus dengue, kami
mengidentifikasi co-sirkulasi Genotipe I dan IV dari DENV-1 serotipe. Wilayah geografis
terdekat yang telah dilaporkan sebagai menyimpan Genotipe I adalah Singapura (Schreiber et
al., 2009), Thailand (Ong et al., 2008) dan Surabaya (Yamanaka et al., 2011). Pengelompokan
semua sampel Genotipe I bersama-sama dengan virus dari Cina, Thailand, dan Singapura
dapat menunjukkan bahwa Genotipe I isolat berasal dari Cina, bermigrasi ke Thailand dan
Singapura berlalu sebelum memasuki Makassar (Gbr. 1). Genotipe IV dominan di Jakarta
pada tahun 2004 (Schreiber et al., 2009) dan juga hadir di Makassar dalam jumlah yang lebih
kecil. Hubungan genetik erat antara Makassar dan Singapura Genotipe I isolat menunjukkan
impor baru-baru ini memiliki terjadi dan bahwa clade menjabat sedang diganti. Sementara
strain Genotipe IV dari Makassar cukup beragam Genotipe I strain tampaknya relatif seragam
lanjut menyarankan pengenalan baru-baru ini. Kami akan terus survei virus dari daerah untuk
melihat apakah Genotipe I berhasil menggusur Genotipe IV.
DENV-2 virus dikelompokkan ke dalam Cosmopolitan genotipe. Genotipe ini
beredar luas di India, South East Asia, Afrika, Timur Tengah, dan Australia (Twiddy et al.,
2002). Genotipe ini juga beredar di kota-kota Jakarta pada tahun 2004 dan Palembang pada
tahun 1998. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa erat terkait strain genotipe
Cosmopolitan diisolasi di Jakarta di 2004, Brunei dan Singapura pada tahun 2005, Vietnam
pada tahun 2006 dan Makassar pada tahun 2007 dan 2008. Tampak bahwa Cosmopolitan
genotipe sangat sukses dalam menyebarkan, regional endemik dan terus kembali
mendistribusikan di Asia Tenggara. Filogenetik yang pohon menunjukkan adanya isolasi
spasial antara DENV-2 strain dari kota-kota di bagian barat dan timur Indonesia, tetapi tidak
adanya isolasi spasial antara Makassar dan Singapura (Gbr. 2). Pohon itu juga menunjukkan
bahwa DENV-2 virus saat ini beredar di Makassar adalah beberapa entri. Agaknya, udara
langsung sering dan perjalanan laut antara Makassar dan Singapura dengan cepat
mendistribusikan virus antara dua kota. Penjelasan lain dari isolasi spasial mungkin antara
Kota di Indonesia adalah bahwa tidak ada urutan genom seluruh lainnya data yang telah
dilaporkan dan diserahkan ke GenBank.

Analisis filogenetik kami mengungkapkan bahwa Makassar DENV-3 virus ini dapat
dikelompokkan menjadi Genotipe I, mirip dengan isolat dari Jakarta pada tahun 2004 dan
Palembang pada tahun 1998, dan genotipe sama Strain Indonesia dari tahun 1978, 1988, 1996
dan 1998 isolat. Ini genotipe telah digambarkan sebagai penyebab empat epidemi di wilayah
di masa lalu (Ong et al., 2008), dan kemungkinan besar lokal, Regangan endemik Indonesia
yang telah beredar selama lebih dari tiga dekade. Sangat menarik bahwa isolat kami temukan
di Makassar tampaknya lebih terkait erat dengan strain dari tahun 1996 dan 1998 dari strain
baru-baru ini ditemukan di Timor-Leste, Jakarta, Singapura dan Palembang menyarankan
DENV-3 di Makassar telah pernah mengikuti sejarah evolusi yang terpisah sejak tahun 1988.
DENV-4 virus kita terisolasi berkerumun ke Genotipe II (Se- Asia dan Amerika),
genotipe yang sama seperti yang terisolasi di Jakarta pada tahun 2004. Empat dari sampel
Makassar yang berasal dari garis keturunan dengan tingkat mutasi yang lebih tinggi
dibandingkan dengan sampel lainnya, dan adalah keturunan langsung dari leluhur mereka
sampel Jakarta dengan TMRCA sekitar tahun 1990. tingkat mutasi yang lebih tinggi mungkin
menunjukkan bahwa garis keturunan khusus ini menyebar agak cepat, seperti dalam kasus
wabah. Dengan demikian, mereka isolat Makassar khususnya yang diasumsikan untuk
keturunan wabah Jakarta pada tahun 1998. Sebagian urutan virus dari tahun 1973, 1976, 1977
isolat juga klaster dalam clade ini (tidak ditampilkan). Genotipe ini tampaknya menjadi
endemik di Indonesia dan telah beredar selama lebih dari 30 tahun.
Pendekatan coalescent Bayesian digunakan untuk menyimpulkan evolusi dinamika
untuk semua serotipe isolat dalam 2007-2010 di Makassar (Drummond dan Rambaut, 2007).
Kami mengamati rata-rata tingkat evolusi untuk-DENV 1, DENV-2 dan DENV-3 adalah
serupa dan kira-kira setara dengan yang diperkirakan sebelumnya untuk semua Serotipe
DENV (Twiddy et al., 2003). Usia rata-rata umum leluhur untuk-DENV 1, DENV-2 dan
DENV-3 menunjukkan bahwa masing-masing ini garis keturunan yang beragam memiliki
nenek moyang yang sama sudah hadir di Makassar sejak sekitar tahun 2003. Sejak jumlah
sampel untuk DENV-4 adalah kecil, kita tidak bisa percaya diri memperkirakan mean usia
nenek moyang dari isolat tersebut. Bahwa kita tidak melihat bukti yang meyakinkan untuk
seleksi positif dalam salah satu serotipe menunjukkan bahwa strain ini sudah baik disesuaikan
dengan lingkungan hidup mereka.
Analisis berdasarkan urutan asam amino dari Sampel Indonesia menunjukkan bahwa
beberapa posisi yang menjalani substitusi asam amino dari tahun 2007 sampai 2008. Itu kami

lakukan tidak melihat bukti yang meyakinkan untuk seleksi positif dalam setiap serotipe
menunjukkan bahwa strain ini sudah baik disesuaikan dengan lingkungan mereka, dan bahwa
substitusi asam amino mungkin tidak mempengaruhi karakteristik virus substansial.
Variasi genetik dalam virus dengue telah digambarkan sebagai menjadi faktor risiko
untuk penyakit berat (Balmaseda et al., 2006; Messer et al., 2003; Rico-Hesse et al., 1997)
dan serotipe tertentu / genotipe disarankan untuk memiliki kecenderungan untuk
menyebabkan lebih banyak bentuk parah dari demam berdarah (yaitu, DBD dan DSS) dan
wabah yang lebih besar. Misalnya, DENV-2 dan DENV-3 telah dikaitkan dengan berat
penyakit dan DENV-4 diklaim menyebabkan penyakit yang lebih ringan (Nisalak et al,
2003;.. Vaughn et al, 2000). Salah satu cara untuk memperkirakan virulensi atau kebugaran
virus in vitro adalah dengan melihat virus tingkat replikasi (Rico-Hesse, 2010). Dalam studi
ini, kami membandingkan kinetika replikasi berbagai serotipe / genotipe DENV untuk
menentukan apakah serotipe tertentu / genotipe meniru lebih baik dari yang lainnya.
Co-sirkulasi dua DENV-1 genotipe (yaitu, Genotipe I dan IV) mendorong kita untuk
membandingkan tarif replikasi mereka. Isolat dikelompokkan menjadi Genotipe I rupanya
direplikasi pada tingkat yang lebih tinggi dibandingkan untuk genotipe IV. Hal ini
menunjukkan kebugaran relatif lebih baik dari Genotipe I yang mungkin mendasari
kemampuan genotipe untuk menggantikan Genotipe IV di masyarakat. Dengan demikian,
pengamatan ini menunjukkan bahwa genotipe yang berbeda dari DENV mungkin
menunjukkan berbeda karakteristik fenotipik, seperti dalam kasus Amerika dan Selatan
Genotipe Asia Timur dari DENV-2 (Leitmeyer et al, 1999;. Rico- Hesse et al., 1997).
Pengawasan terus menerus sedang berlangsung untuk mengkonfirmasi sirkulasi dominan
Genotipe I.
DENV-2 Amerika dan Asia Tenggara genotipe yang dikenal memiliki perbedaan
dalam kemampuan replikasi mereka. Amerika genotipe direplikasi kurang baik dari virus
Asia Tenggara di percobaan in vitro (Pryor et al., 2001). Karena semua DENV-2 virus
dikelompokkan menjadi genotipe Cosmopolitan (Gbr. 3), kita tidak bisa melakukan
perbandingan replikasi terhadap genotipe lainnya. Namun, dalam genotipe Cosmopolitan,
kami mengamati pengelompokan virus ke dalam clades. Untuk menentukan apakah ada
perbedaan dalam pertumbuhan, empat virus yang mewakili masing-masing clade diuji untuk
kinetika replikasi mereka. Kami mengamati tidak ada yang signifikan Perbedaan di antara
mereka empat virus (data tidak ditunjukkan), menyarankan bahwa anggota genotipe yang

cukup homogen di tingkat pertumbuhan mereka. Pengamatan serupa juga hadir di DENV-3
dan -4 (data tidak ditampilkan). Profil kinetik pertumbuhan DENV khas juga diamati pada
virus lainnya isolat dari kota-kota lain di Indonesia (data tidak ditampilkan).
Singkatnya, kami telah mengungkapkan serotipe dengue dan genotipe distribusi di
Makassar dan mengamati bahwa meskipun ini virus memiliki dinamika evolusi sangat mirip
mereka memiliki sejarah phylogeographic sangat berbeda. Kami mengamati tingkat replikasi
yang berbeda dari DENV-1 Genotipe I dan Genotipe IV, yang mungkin mendasari
kemampuan Genotipe I dalam menggantikan Genotipe IV di Makassar, Indonesia

RINGKASAN

Analisis Genom Dan Karakteristik Pertumbuhan Virus Dengue Dari

Makassar, Indonesia

Demam berdarah merupakan penyakit demam akut yang disebabkan oleh infeksi virus
dengue (DENV), ditularkan melalui vektor nyamuk Aedes aegypti. DENV adalah flavivirus
menyelimuti dengan 10,7 kb tunggal terdapat positif-sense RNA genom. Ada empat antigen
serotipe yang berbeda dari virus (DENV-1, -2, -3, dan -4), dengan sekitar 65% genom
kesamaan. Penyakit yang disebabkan oleh empat serotipe memiliki gejala yang identik.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sirkulasi dengue terjadi dalam keempat serotipe.
Terdapat dominasi virus dengue serotipe DENV 1 dengan 51 isolat (41%), diikuti oleh
DENV-2 dengan 39 isolat (31%). Dua puluh lima isolat (20%) adalah DENV-3; dan sembilan
isolat yang tersisa (7%) yang DENV-4. Distribusi ini berbeda dari laporan di bagian lain dari
Indonesia, terutama di Wilayah barat, misalnya, di kota-kota Jakarta dan Palembang pada
tahun 2004, di mana DENV-3 adalah dominan serotipe di daerah dan berkorelasi dengan
gejala berat.
Dalam analisis filogenetik dikelompokkan DENV-2, -3 dan -4 dengan Genotipe
kosmopolitan masing-masing Genotipe I dan Genotipe II. Menariknya, setiap cat serotipe
berbeda pada gambar evolusi dan transmisi. Pada dinamika evolusi dan filogeni dari Virus
dengue Makassar menunjukkan bahwa isolat Genotipe I berasal dari Cina, bermigrasi ke
Thailand dan Singapura berlalu sebelum memasuki Makassar. Genotipe IV dominan di
Jakarta pada tahun 2004 dan juga hadir di Makassar (2003).
Sedangkan DENV-2 virus dikelompokkan ke dalam Kosmopolitan genotipe yang
ditemukan regional endemik dan sering dipertukarkan antar negara di kawasan itu. Genotipe
ini beredar luas di India, Asia Tenggara, Afrika, Timur Tengah, dan Australia , Jakarta (2004),
Palembang (1998), Brunei dan Singapura (2005), Vietnam (2006) dan Makassar (2007
2008). Tampak bahwa Cosmopolitan genotipe sangat sukses dalam menyebarkan, regional
endemik dan terus kembali mendistribusikan di Asia Tenggara
Hasil analisis filogenetik mengungkapkan bahwa DENV-3 virus ini dapat
dikelompokkan menjadi Genotipe I, mirip dengan isolat dari Jakarta dan Palembang.
Genotipe ini telah digambarkan sebagai penyebab empat epidemi di masa lalu yang terjadi
lebih dari tiga dekade. DENV-4 virus dengan tingkat mutasi yang lebih tinggi dibandingkan
dengan sampel lainnya ini menunjukkan bahwa garis keturunan khusus ini menyebar agak
cepat, seperti dalam kasus wabah. Isolat DENV-3 dan DENV-4 berhubungan dengan strain
sejarah panjang di Indonesia meskipun DENV-3 strain tampaknya telah mengikuti jalur
evolusi yang berbeda sejak sekitar 1998.

Evolusi dinamika untuk semua serotipe isolat menunjukkan rata rata usia leluhur
untuk-DENV 1, DENV-2 dan DENV-3 masing-masing memiliki garis keturunan yang
beragam dari nenek moyang yang sama hadir di Makassar sejak sekitar tahun 2003. Hasil uji
kinetika replikasi untuk-DENV 1 dan -2 dibandingkan dengan DENV-3 dan -4. DalamDENV-1, virus dari Genotipe I tumbuh lebih cepat daripada Genotipe IV. Tingkat replikasi
yang lebih tinggi mungkin mendasari kemampuan mereka untuk menggantikan sirkulasi dari
Genotipe IV di masyarakat.