XI.

ENUMERASI
Penghitungan jumlah mikrobia dapat berdasarkan Total Cell Count (TCC) dan
Viable Cell Count.
Perbedaan :

ENUMERASI
ISOLASI
PURIFIKASI
IDENTIFIKASI

Enumerasi yaitu penghitungan jumlah mikrobia per satuan berat atau volume.

Metode enumerasi
1. TPC: Total Plate Count
-

Pour plate

Spread plate

Drop plate

2. MPN : Most Probable Number

3. Membrane Filter
Persyaratan jumlah koloni dalam TPC
Bakteri dan Yeast 30 < n < 300 atau 25 < n < 250
Jamur 15<ns 150
Di bawah 30 koloni kurang memenuhi persyaratan perhitungan statistik.
Lebih dari 300 koloni terlalu padat
-

Menyebabkan

supress

sehingga

mengganggu

pertumbuhan

mikrobia menghambat pembentukan koloni

-

memungkinkan terbentuknya 1 koloni oleh lebih dari 1 sel

Keuntungan perhitungan dengan TPC

1. sangat peka, dapat menghitung sampai dengan 20 sel/ml
2. murah
3. beban pekerjaan tidak terlalu besar
4. reproducibility tinggi
5. dapat menunjukkan perbedaan jenis-jenis mikrobia
6. dapat diteruskan dengan isolasi

Universitas Gadjah Mada

Membrane Filtration
Sampel disaring secara aseptis melewati membran penyaring steril
berpori-pori 0.45.
Membran dengan sel-sel mikrobia yang tertahan padanya ditumbuhkan
pada media agar yang sesuai dan diinkubasikan pada kondisi yang juga
cocok.
Kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh dan dikembalikan
perhitungannya atas dasar volume sampel dan pengencerannya.
Keuntungan :
-

sangat sensitif, dapat untuk menghitung sampai 10~3 sel/ml.

dapat dikerjakan dengan media selektif terhadap mikrobia tertentu.

Kelemahan : tidak efisien

Alat: Polyethylene Membrane Filter (Sartorius) atau Seitz Filter

MPN : Most Probable Number

Penghitungan jumlah mikrobia dengan pendekatan statistik didasarkan atas
perbandingan tabung yang menunjukkan pertumbuhan, dari 3 seri pengenceran
atau lebih.
Suspensi sampel

A = 1000 sel/ml
B = 100 sel/ml
C = 10 sel/ml
D = 1 sel/ml
E = 0.1 sel/ml

1 ml suspensi A, B, C, atau D bila diinokulasikan dalam 1 tabung media cair yang

cocok akan mengakibatkan adanya pertumbuhan pada tabung.
1 ml suspensi E bila ditumbuhkan dalam media yang sama memiliki
kemungkinan (probability) 1 : 10.

Universitas Gadjah Mada

Atas dasar perhitungan kemungkinan adanya pertumbuhan pada tabung tersebut

secara statistis disusun tabel hubungan antara jumlah tabung yang ada
pertumbuhan dari berbagai pengenceran, dengan jumlah mikrobia. Tabel
tersebut dikenal sebagai Tabel McCrady. Tabel untuk 3 tabung maupun Tabel
untuk 5 tabung.
Contoh :
-

sampel dengan pengenceran 10-1, 10-2, 10-3

dari masing-masing pengenceran diinokulasikan 5 x 1 ml dalam 5 tabung

media yang sesuai

setelah diinkubasikan diperoleh sbb :

pengenceran 10-1 = 5 tabung +
pengenceran 10-2 = 3 tabung +
pengenceran 10-3 = 0 tabung +

Maka dinyatakan dalam hasil pengamatan berupa seri angka 530. Kemudian
seri ini dicocokkan dengan Tabel McCrady untuk 5 tabung, diperoleh
perkiraan populasi mikrobia dalam sampel adalah 109 sel/gram.
MPN dihitung dengan asumsi:
1. sel terdistribusi rata dalam sampel
2. tidak ada sel yang saling terkait
3. tiap 1 sel atau lebih dalam media mampu menunjukkan pertumbuhan
dalam tabung
4. tidak ada kontaminasi
Keuntungan :
1. dapat dipersiapkan sebelumnya, untuk pekerjaan di lapangan
2. dapat dikerjakan dengan media selektif untuk memperkirakan populasi
mikrobia khusus, misalnya coliform dengan lactose broth
Kelemahan :
1. perlu banyak tabung
2. pekerjaan banyak

Universitas Gadjah Mada

PREPARASI SAMPEL
Perencanaan sampling
Untuk menentukan jumlah dan ukuran sampel dipengaruhi oleh faktor-faktor:
1. jumlah mkrobia
2. keseragaman/penyebaran mikrobia
POPULASI MIKROBIA

SAMPEL YANG DIAMBIL

----------------------------------------------------------------------------------------------makin besar

makin kecil ukuran

makin homogen

makin sedikit jumlah

makin sedikit

makin besar ukuran

makin tidak homogeny

makin banyak jumlah

----------------------------------------------------------------------------------------------Biasanya diatur dalam standar mutu

Umumnya diambil 10 g atau 10 cc sampel untuk disuspensikan
Sekurang-kurangnya 1 g bila sampel sedikit
Cara sampling
-

Aseptik - dengan peralatan steril yang sesuai

pipet untuk sampel cair
pisau, pinset, spatula, cangkul, bar untuk sampel padat
wadah untuk penimbangan

Waktu - memungkinkan secepatnya dianalisis

2-3 jam sampel sudah dianalisis
10-12 jam dalam suhu 4 C
tidak menyebabkan perubahan jumlah mikrobia dalam sampel berbiak
dan mati.

SUSPENSI SAMPEL
merupakan cara melepas/mengambil populasi mikrobia dari sampel
Sampel cair homogenisasi dalam larutan pengencer
Sampel padat blending : penghancuran sampel

Universitas Gadjah Mada

- blender
- stomacher
rinsing : bilasan
swabbing : usapan
Larutan pensuspensi/pengencer :
mampu mensuspensikan mikrobia, mempertahankan mikrobia tetap
hidup, tetapi tidak berbiak
contoh : air pepton (Peptone water)
larutan pepton 0.1%
bufer phosphate
bufer trypton
larutan Ringer = NaCI 0.9% dalam H 2O
Penggunaan air steril menyebabkan kematian sel mikrobia 40-60% dalam 20
menit dan 90% dalam 1 jam.
Jika digunakan, pengerjaannya harus cepat.
Dalam Total Plate Count biasanya disiapkan suatu seri pengenceran sesuai
dengan perkiraan kandungan mikrobia dalam sampel.

RAPID MICROBIOLOGICAL METHODS

Metode penghitungan yang dkehendaki mempunyai kelebihan

Murah

Cepat

valid

1. mempercepat teknik kultivasi

2. pengujian biokimiawi secara cepat
misal: dengan APP system dan ATM system
coagulase test untuk S. aureus
urease test untuk Salmonella
3. Pengukuran metabolisme total kontaminan
misal: - Methylene Blue Test untuk milk warna
Reazurin Test untuk daging giling warna
Glucose broth untuk ikan penurunan pH

Universitas Gadjah Mada

Kelemahan :

kecepatan metabolisme mikrobia tidak sama

bahan yang sudah mendapat perlakuan akan memberi hasil yang tidak
korelatif populasi sudah dipengaruhi perlakuan (misalnya pendinginan)

MENERA KERUSAKAN BAHAN

-

ammonia, asam amino bebas, basa volatil --> pada ikan

Extract Release Volume (ERV) --> pada telur, daging unggas

perubahan kemampuan menahan air oleh jaringan akibat

kerusakan mikrobiologis

homogenat sampel disaring dengan kertas Whatman No. 1

selama 15 menit
daging baik

- ERV tinggi

daging rusak - ERV rendah

-

Tri-Metil Amin (TMA) --> pada ikan

METODA NON-TRADISIONAL
-

menggunakan isotop

sampel disaring dengan membran filtrasi lalu dibiakkan pada

medium selektif dengan label radioaktif (misal Lactose-C untuk
coliform); C*O2 radioaktif ditera.

Pada penggunaan untuk daging beku, dalam 6 jam inkubasi

sudah dapat ditentukan apakah populasi mikrobianya tinggi (>10 5
/g) untuk ditolak atau masih dapat diterima (< 10 5 /g)

alat dan bahan mahal

kurang aman --> bahaya radiasi, perlu tenaga trampil

mengukur ATP
luciferase

Luciferin + ATP --------------> senyawa yang bercahaya dapat

O2

Kelemahan :

diukur

- bahan pangan punya ATP

- sel mati masih punya ATP

Universitas Gadjah Mada

intensitasnya

- ATP yeast + mold > ATP bakteri

mengukur impedance
Pertumbuhan

mikrobia

menyebabkan

kerusakan/pemecahan

senyawa pada jaringan bahan. Hal tersebut dapat mengakibatkan

perubahan kemampuannya menahan/meneruskan aliran listrik,
yang dapat diukur dan dikorelasikan dengan populasi mikrobia.

Enzyme Immuno-Assay
misal: ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

Prinsip kerja :
-

Antibodi akan terbentuk bila ada antigen (benda asing yang dianggap
mengganggu), dan berusaha menghancurkannya (immune system)

Reaksi immunitas antigen - antibody (=immunoglobulin) ini spesifik dan

akurat

Dengan menempelkan enzim pada antibody tertentu yang khusus

diproduksi untuk bereaksi dengan mikrobia tertentu dapat dideteksi
mikrobia ybs melalui reaksi oleh enzim yang ditempelkan.

IMMUNO ASSAY
Dasar:
-

Antibodi

akan

terbentuk

bila

ada

benda

asing

yang

dianggap

mengganggu (antigen) dan berusaha mengeliminasinya (immune system)

-

Reaksi imunitas antigen-antibodi-(immunoglobulin) ini spesifik dan akurat

Antibodi dapat dimanfaatkan sebagai pemburu antigen (racun, mikrobia)

yang dicari.

Terbentuknya kompleks antigen-antibodi dapat menimbulkan endapan/clump

atau aglutinasi tetapi tidak jelas dan sukar diamati.
Solusi: pemberian label/tag pada protein antibodinya dengan molekul pelacak
yang terikat secara kimiawi.
Syarat:
-

Ikatan

yang

terbentuk

tidak

menyebabkan

melemahkan) immunoactivity Antigen-Antibody

Universitas Gadjah Mada

gangguan

(merusak/

Terbentuk/terjadi immobilisasi antara antigen atau antibodi dengan suatu

solid-support, tanpa mengganggu immunoactivity dan/atau spesifitasnya

Label yang sudah digunakan :

-

molekul radioaktif

chemiluminescent molecules

Enzyme (stabil, mudah operasinya, substratnya mudah disiapkan, mudah

ditera secara colorimetric atau spectrophotometric)

Horseradish peroxydase

Alkaline phosphatase

B-galactosidase

Asetyl-cholinesterasi

Solid support yang sudah digunakan:

polystyrene, polyvinil, polyacrylamide, glass, silica, nylon, titanous
ydroxide, nitrocellulose, agarose
Aplikasi :

Immunocapture, misal ELISA

Agglutinous Assay adanya lebih dari satu binding site --> cross
linked terjadi molekul besar atau clumping cells --> visible

Elisa tersedia berupa kits yang makin ringkas, dapat diautomisasi dengan
komputer.

Sensitif 1 jig atau ng toksin; 104 -105 sel/ml

Cepat1-2jam

Teknologi Immuno-Assay

Produksi antibody (Immunoglobulin)

o

menyuntikkan antigen (Ag) tertentu (misalnya Salmonella, racun,

protein tertentu) pada hewan (kelinci, kambing, domba, dsb)

mengambil

darah

hewan

yang

telah

disuntik

dan

dipisahkan serum yang mengandung antibody tertentu

-

Produksi Antibody yang ditempeli enzim

Pengujian sampel terhadap mikrobia atau racun (antigen) tertentu

o

Menempelkan antigen (sampel) atau antibody pada suatu bahan

(fase padatan tertentu)

Universitas Gadjah Mada

Mereaksikan antigen dengan antibody atau antibody dengan

antigen

Mereaksikan enzim yang menempel pada antibody dengan

substrat yang sesuai

Mendeteksi atau menera reaksi enzim terhadap substrat

Mengevaluasi hasil reaksi

Ada 3 cara mereaksikan antigen-antibody dan peneraan reaksi enzimnya

1. Enzyme Immuno-Assay Langsung
a. Menempelkan Ag (sampel) pada padatan penyangga. Bahanbahan yang tidak menempel dicuci.

b. Mereaksikan antibody yang ditempeli enzim (E-Ab) dengan

Antigen (Ag). Bahan-bahan yang tidak menempel dicuci.

c. Mereaksikan substrat yang sesuai dengan enzim yang menempel

pada antibody

Universitas Gadjah Mada

d. Menera reasksi E + S

P+E

Misalnya dengan spektrofotometer dapat ditera pengurangan

substrat atau terbentuknya produk.
2. Enzyme Immuno-Assay Sandwich

3. Enzyme Immuno-Assay Tidak Lansung

Universitas Gadjah Mada

Enzim yang telah digunakan a.l:

Peroksidase, alkaline phosphatase, glikosidase Penyangga fase padat
yang telah digunakan untuk menempel (immobilized) a.l.:
-

tabung polistiren

tabung polivinil

Keduanya berisi suspensi Titanous hidroksida

DNA PROBE
Prinsip kerja :
-

DNA memiliki benang double helix yang komplementer secara spesifik

satu sama lain, dengan urutan basa nukleotida sebagai cirinya.

Benang double helix dapat terurai secara reversibel dengan perlakuan

panas atau perlakuan kimia.

Benang tunggal DNA dapat dipecah dengan enzim nuclease menjadi

segmen-segmen kecil yang masih membawa ciri genetik.

Segmen DNA tunggal ini dapat bergabung dengan benang tunggal

komplementernya yang utuh.

Urutan kerja dalam penentuan dengan DNA probe :

a. sampel ditampung dalam bahan penyangga, misal membran filter
b. diperlakukan dengan detergen untuk membuka double heliks c
c. perlakukan dengan enzim untuk melepas double heliks
Bahan-bahan non DNA didigesti, benang DNA dilekatkan pada
penyangga (filter)
d. DNA-probe (segmen DNA yang diberi label isotop) direaksikan pada
bahan,

segmen-segmen

DNA

akan

mencari

pasangannya

dan

menempel.
e. Sisa DNA-probe yang tidak terikat dicuci, DNA probe yang menempel
(terikat) dihitung.
DNA probe dapat ditempeli muatan radioaktif, enzim, senyawa fluorescent atau
antibodi.

Universitas Gadjah Mada

Biosensor
Mengubah proses reaksi dari suatu metoda penentuan, misalnya
enzimatis menjadi sinyal fisis, kemudian sinyal tersebut diperkuat dan
selanjutnya dibaca dengan komputer print out hasil.

Universitas Gadjah Mada