PRAKTIKUM BIOKIMIA BLOK HEMATOLOGI

DARAH
Tujuan Umum :
1. Memahami darah sebagai jaringan cairan tubuh yang mempunyai fungsi penting
2. Memahami hemolisa sel darah merah
3. Memahami zat-zat yang terdapat dalam darah
Tujuan Khusus :
1. Agar dapat mengenal susunan dan sifat-sifat darah
2. Agar dapat mengetahui faktor apa saja yang mempengaruhi hemolisa darah
3. Agar dapat mengetahui zat-zat normal maupun abnormal.

PRAKTIKUM DARAH
I.

Definisi
Darah adalah jaringan yang beredar dalam sistem pembuluh darah yang sebenarnya tertutup.

II.

Fungsi
1. Respirasi : Transport oksigen dari paru-paru ke jaringan, dari jaringan ke paru-paru.
2. Gizi : Transport zat makanan yang diserap dari tractus digestivus.
3. Ekskresi : transport sisa-sisa metabolism (metabolit) yang tidak diperlukan untuk tubuh
melalui ginjal, paru-paru, kulit dan saluran pencernaan (usus) untuk dibuang.
4. Mempertahankan keseimbangan asam basa dalam tubuh
5. Mengatur keseimbangan air yang terdapat di dalam darah dan jaringan. Kelebihan air
akan dikeluarkan dari tubuh melalui ginjal, kulit, paru-paru dan saluran pencernaan.
6. Mengatur suhu tubuh dalam batas normal
7. Berperan dalam mengatasi suatu infeksi yang merupakan fungsi leukosit dan zat-zat anti
yang beredar dalam tubuh
8. Transport hormon
9. Transport metabolit
Jumlah darah dalam 5-7 % B.B atau 85 ml/kg BB pada laki-laki, sedangkan pada
wanita sedikit lebih rendah.
B.D. darah 1.054 1.060
Viskositas : 4,5 kali viskositas air. Viskositas ini berubah-ubah tergantung dari :
1. Jumlah sel yang ada
2. Suhu tubuh
3. Derajat hidrasi tubuh

Karena keadaan 1,2 dan 3 itu dalam keadaan normal relative konstan maka viskositas darah
biasanya tidak dipengaruhi faal sirkulasi.
Rumus volume darah :
Volume darah total (L) = Volume plasma (L)
1 Vp Rc
L = Liter
Vp RC = volume of packed Red Cells (Hematokrit)
III.

Susunan darah
Terdiri dari :
1. Cairan (plasma)
2. Sel darah :
- Eritrosit
- Leukosit
- Trombosit
Sel darah : pada laki-laki sel darah jumlahnya 45 % x volume darah total
Plasma : merupakan 55 % volume darah, terdiri dari :
91-92 % air. 8-9 % zat-zat yang larut di dalamnya adalah :
- Protein 7 %
- Enzim
- Hormon
- Vitamin
- Lipid
- Asam Amino dan metabolitnya
- Urea
- Kreatin
- Kreatinin
- Anion, kation dan lain-lain.

IV.

Tekanan Osmotik Darah

Tekanan Osmotik darah dipertahankan secara relatif konstan terutama oleh ginjal. Tekanan
osmotik dapat ditentukan oleh penurunan titik beku.
Titik beku rata-rata untuk seluruh darah telah ditentukan : -0,537 oC. Ini sesuai dengan
tekanan osmotik 7-8 atmosfir pada suhu tubuh.
Tekanan osmotik seluruh darah ini sesuai dengan tekanan osmotik larutan NaCl 0,9 gram/L
Larutan garam NaCl ini dinamakan isotonik atau garam fisiologis.
Larutan lain yang isotonik dengan darah yaitu :
- Larutan Ringer
- Larutan Ringer-Locke dan Tyroda
Susunan sebagai berikut :

NaCl
CaCl
KCl
NaHCO3
Glukosa
MgCl2
NaH2PO4

Garam
(%)
0,9

Ringer
(%)
0,86
0,033
0,03

Ringer
Locke (%)
0,9
0,024
0,042
0,01-0,03
0,10-0,2

Tyroda
(%)
0,8
0,02
0,02
0,1
0,01
0,01
0,005

Mekanisme pembekuan darah :

Jika darah diambil dari saluran system peredarannya maka darah-darah tersebut cenderung untuk
membeku. Pembekuan darah sebenarnya adalah fenomena plasma, dimana zarah-zarah darah
ditangkap oleh jaringan fibrin yang tampak seperti selai.
Jika bekuan ini dibiarkan akan mengkerut dan memeras cairan kuning keluar. Cairan ini
dinamakan serum. Jadi perbedaan kimiawi antara plasma dan serum ialah bahwa yang terakhir
ini tidak lagi mengandung fibrinogen yang telah diubah menjadi fibrin dalam proses koagulasi.
Mekanisme perubahan fibrinogen menjadi fibrin melibatkan beberapa komponen plasma yaitu
protoatrombin, ion Ca, Ac, globulin plasma (Ac = accelerator), factor anti hemofilik, komponen
tromboplastin plasma, prokonvertin dan beberapa factor jaringan dan faktor trombosit.
Pada garis besarnya proses koagulasi dan trombosit berlangsung berurutan sebagai berikut :
1. Jaringan yang mengalami cedera dan trombosit yang mengalami aglutinasi (lisis)
melepaskan prekusor tromboplastin yang bereaksi dengan :
Faktor antihemofilik (plasma)
Komponen tromboplastin membentuk tromboplastin
2. Tromboplastin karena adanya ion Ca, mengubah protrombin menjadi thrombin.
3. Tromboplastin dengan adanya ion Ca dan konvertin mengubah protrombin menjadi
thrombin
4. Dengan adanya thrombin yang sedikit ini, Ac globulin plasma yang tadinya inaktif, menjadi
Ac globulin serum yang aktif.
5. Protombin dengan cepat diubah manjadi thrombin karena adanya :
- Ion Ca
- Tromboplastin
- Ac. Globulin serum
- Akselarator trombosit, (1) dan
- Konvertin
6. Thrombin mengkatalisis perubahan fibrinogen menjadi fibrin reaksi ini dipercepat oleh
akselerator trombosit (no.2)

Salah satu cara guna mencegah pembekuan darah ialah defibrinasi yaitu menghilangkan
fibrin, penambahan antikoagulan atau menurunkan kadar ion Ca yang ada dalam larutan
darah.
Defibrinasi dilangsungkan sebagai berikut :
Darah segera diaduk-aduk dengan sepotong kawat atau kaca
Pada prose pengadukan ini fibrin yang ada di dalam darah akan menempel pada batang
pengaduk, yang kemudian bisa dipisahkan. Darah yang telah difibrinasi ini tidak lagi bisa
menggumpal walaupun ditambahkan ion Ca ke dalamnya.
Cara yang dipergunakan pada yang terakhir ini ialah menambahkan ion oksalat atau ion
fluoride atau ion sitrat, ion tersebut akan bergabung dengan ion Ca membentuk garam yang
sukar larut atau sukar mendissosiasi.
Darah yang demikian itu disebut darah oksalat, darah fluorida atau darah sitrat.
Jenis darah tersebut diatas dapat digumpalkan lagi dengan membubuhkan CaCl 2 ke
dalamnya.
Antikoagulan : kebanyakan antikoagulan yang sering dipakai umumnya bersifat dapat
mengikat ion Ca, kecuali heparin yang bersifat antitromboplastin (menghambat
pembentukan thrombin dari protrombin).
1) Heparin
Ini merupakan antikoagulan yang baik, sebab ia tidak mengubah susunan darah.
Dibandingkan dengan antikoagulan yang lain, heparin lebih mahal.
Heparin dipakai dalam bentuk garamnya dengan Na, Li atau Ca jumlah yang diperlukan
cukup 2 mg/100 ml darah. Pemakaian yang terlalu banyak mengakibatkan pergeseran air
antara sel dan plasma. Sehingga pemeriksaan kurang tepat.
2) K atau Na oksalat
Zat-zat ini mengandung ion Ca yang lazim dipakai ialah K oksalat, karena sifatnya yang
mudah larut. Untuk mencegah pembekuan darah diperlukan 10-20 mg/ 10 ml darah.
Dalam hal ini dinding tabung tempat penampungan darah diliputi dengan lapisan Koksalat yang tipis 0,1 ml larutan K-oksalat 30 % dimasukkan ke dalam tabung untuk
menampung darah, kemudian cukup kira-kira 10 ml darah.
3) Campuran Ammonium oksalat dan K-oksalat (dalam perbandingan 3:2). Untuk 1 ml
darah dibutuhkan 2 mg antikoagulan. Zat-zat ini tidak boleh dipakai pada penetapan
kadar urea. Protein atau non protein nitrogen menurut Kyeldahl, sebab penggunaan
garam garam NH4 disini akan memberikan hasil kadar M yang lebih tinggi.
4) Na citrate
Sitrat tidak mengendapkan ion Ca, akan tetapi mengikat ion Ca. Ca sitrat yang terbentuk
tidak berionisasi, sehingga pembekuan terhalang. Untuk penetapan Ca lebih baik
dipakai serum, sebab pemakaian plasma sitrat dapat mengakibatkan pergeseran air dari
sel. Untuk mencegah pembekuan diperlukan 30 mg/10 ml darah.
5) Na-fluorida
Jumlah yang diperlukan untuk mencegah pembekuan lebih banyak dari pada
antikoagulan lainnya. Disamping sebagian antikoagulan fluoarida juga dapat
menghambat pekerjaan beberapa enzim sehingga juga dapat berfungsi mempertahankan
kadar beberapa macam zat (glukosa).

6) Ethylen Diamine Tetra Acid (EDTA)

Chelating agent ini atau garamnya dapat menegah pembekuan darah dengan mengikat
ion Ca. Untuk penyelidikan darah lebih baik diambil setelah puasa 10-12 jam supaya
dapat dibandingkan dengan harga-harga normal yang biasa ditetapkan dalam keadaan
puasa.
Jika didiamkan darah dapat mengalami perubahan-perubahan dan sebagainya :
Perubahan zat-zat karena aktivitas enzim seperti :
- Glikolisis oleh enzim di dalam eritrosit dan lekosit (glukosa, piruvat, laktat)
- Pembentukan ammonia dari urea
- Peninggian fosfat organic plasma, karena terjadinya pemecahan ester fosfat di
dalam sel yang kemudian berdifusi keluar sel.
- Keluarnya zat-zat dari dalam sel.
Pengeluaran CO2 karena tekanan parsiil CO2 darah lebih besar daripada pCO2 udara.
Supaya didapatkan hasil yang baik pada penetapan susunan darah terutama susunan
kuantitatif, harus diperhatikan beberapa hal :
- Serum atau plasma harus secepat mungkin dipisahkan, untuk penetapan macammacam gas di dalam darah, darah ditampung dibawah parafin dan plasma segera
dipisahkan.
- Pemeriksaan hendaknya dilakukan tanpa menunggu terlalu lama, untuk
mencegah pengaruh enzim dan kuman-kuman. Alat-alat yang dipakai harus
bersih, jika mungkin steril dan kering. Jika akan disimpan, tergantung dari jenis
penetapan, darah serum atau plasma dicampur dengan Na-fluorida dan disimpan
dalam keadaan steril dan atau pada suhu rendah.
- Banyak penetapan zat di dalam darah dipengaruhi oleh zat lain dapat
mengganggu reaksi-reaksi maupun pembacaan pada kolorimeter. Gangguan
gangguan seperti tersebut di atas juga dapat mengganggu pada penetapan kadar
glukosa darah yang didasarkan atas reduksi. Selain glukosa, dalam darah juga
terdapat zat-zat lain dengan daya reduksi. Oleh karena itu diusahakan untuk
mengendalikan protein dan zat-zat lain yang dapat mereduksi. Untuk itu dikenal
beberapa cara pembuatan filtrate darah yang bebas protein seperti filtrate FolinWr, Somoyogi dan sebagainya yang akan diterangkan sendiri.
V.

Laju Endap Eritrosit

Pemeriksaan ini dipakai dalam klinik sebagai cara pemeriksaan non spesifik untuk
mengetahui adanya infeksi. Laju endapan eritrosit ini tergantung terutama dari fibrinogen
dan globulin serta konsentrasi sel darah merah. Fibrinogen dan globulin dalam plasma
disebut juga sebagai makromolekul asimetris plasma.
Bila konsentrasi makromolekul dalam plasma meningkat seperti pada pelbagai keadaan
radang, sel darah merah berkelompok dan mengendap lebih sempurna. Sehingga laju
endapan eritrosit meningkat. Cara yang paling sering dipakai untuk pengukuran laju
endapan eritrosit adalah teknik WINTROBE dan WESTERGREEN. Cara WINTROBE
memakai tabung 100 mm panjang. Cara WESTERGREEN memakai tabung 180 mm

panjang. Tabung westergreen mempunyai lubang yang lebih kecil. Darah diencerkan 1:3
dengan larutan garam. Darah yang diencerkan dimasukkan dalam tabung pengulur dan
banyaknya endapan (sedimentasi) dicatat setelah 1 jam.

PRAKTIKUM DARAH
1. Hemolisa sel darah merah
Larutan hipotonis
Siapkan sederetan tabung reaksi berisi campuran berikut :
Tab Air (ml)
NaCl 2 % (ml)
1
10,0
0,0
2
9,0
1,0
3
8,0
2,0
4
7,5
2,5
5
7,0
3,0
6
6,5
3,5
7
6,0
4,0
8
5,5
4,5
9
5,0
5,0
10
4,5
5,5
- Campur dengan baik pada masing-masing tabung
- Tambahkan 2 tetes eritrosit yang telah dicuci pada masing-masing tabung
- Campur lagi dengan membaliknya perlahan-lahan, lalu diamkan selama 1 jam.
- Catatlah derajad hemolisa pada masing-masing tabung
- Berapakah resistensi osmotic minimum sel darah merah?
2. Pengaruh zat kimia
- Isilah 6 tabung reaksi dengan 10 ml NaCl 0,9 %
- Tabung pertama digunakan sebagai control
- Pada kelima tabung lainnya diisi masing-masing dengan 2 tetes : chloroform, eter
aceton, toluene dan alcohol.
- Lalu pada keenam tabung tersebut tambahkan 2 tetes darah yang telah dicuci
- Kocok dan biarkan selama jam
- Bandingkan dengan control
3. Pengaruh ion Ca
- Ke dalam 2 tabung reaksi ditambahkan masing-masing 2 ml darah oksalat (darah sitrat)
dan darah non fibrin.
- Kemudian ke dalam tiap tabung ditambahkan 5 tetes 5% CaCl2
- Kocoklah amati terjadinya pembekuan dan catat waktu pembekuan.
4. Pengendapan globulin

Tambahkanlah 3 ml larutan (NH)4SO4 jenuh ke dalam tabung yang sebelumnya telah

diisi dengan 3 ml serum.
Gojoklah. Endapan globulin yang terjadi dipisahkan dengan jalan menyaring larutan.
Simpan filtrate untuk percobaan berikutnya
Endapan diatas dipindahkan ke dalam tabung, kemudian dituangi sedikit air dan digojok
supaya bekuannya larut
Encerkanlah dengan air.
Biarkanlah dan catat apa yang terjadi

5. Pengendapan albumin
- Ke dalam filtrate (p.l) ditambahkan ammonium sulfat padat berlebihan. Gojoklah, akan
tampak terjadinya endapan (albumin)
- Saring endapannya dipindahkan ke dalam tabung, tambahkan air dan gojok
- Endapannya akan larut, encerkan lagi, biarkan.
- Amati dan catat ada atau tidak adanya endapan lagi.
6. Deproteinasi serum darah
- Tambahkan 5 ml darah dengan 10 ml air dan didihkan
- Selanjutnya tambahkan setetes demi setetes 2 % larutan asam asetat ke dalam didihan
diatas, sehingga terjadi endapan.
- Saringlah endapan yang terjadi
- Teteskan indicator khlorofenol merah. Kemudian asamkan hingga pH menunjukkan 5,4
(warna indikator tepat hilang)
- Didihkan dan bila perlu saringlah
- Filtrate ini dipergunakan untuk percobaan berikutnya
7. Uji klorida
- Ambil sedikit filtrate (pl) dan tambahkan 1 tetes HNO 3 pekat dan beberapa larutan
AgNO3
- Larutan menjadi putih atau terjadi endapan putih
- Endapan akan larut lagi bila dituangkan NH4OH ke dalamnya.
8. Uji fosfat
- Tuangkan sedikit filtrate (pl) ke dalam tabung dan tambahkanlah beberapa tetes
ammonium molibdat dan 1 tetes HNO3 pekat.
- Panaskan akan terjadi endapan kuning.
9. Uji kalsium
- Tambahkan ke dalam filtrate (pl) beberapa tetes larutan Kalium oksalat
- Warna putih keruh atau terjadinya endapan putih menunjukkan adanya Ca dalam filtrate
10. Uji Glukosa
- 2 ml sisa filtrate (pl) diatas dibubuhi dengan 2 tetes gliserol, sedikit bubuk Na 2CO3 bebas
air dan 2 tetes 2,5 % larutan CuSO4
- Didihkan selama beberapa menit

Bila terjadi warna kuning keruh atau merah bata maka hal itu menunjikkan adanya
glukosa (gula reduksi)

11. Pigmen Darah (Uji Benzidin)

- Encerkan satu tetes darah dengan 10 ml air
- Ambil 1 ml larutan diatas dan tambahkan berturut-turut 1,5 ml larutan Benzidin dan 0,5
ml larutan H2O2
- Amati warna biru yang terjadi
12. Uji Hematin
- Ratakanlah 1 tetes darah diatas obyek lalu keringkanlah diatas api kecil (keringkan
bagian bawah gelas)
- Tambahkan 2 tetes 0,1 5 larutan KCL dalam asam acetat glacial pada darah kering diatas
- Tutuplah dengan gelas penutup dan panaskan di atas api kecil sampai mendidih.
- Tambahkanlah 1 atau 2 tetes pereaksi tersebut diatas melalui tepi gelas penutup dan
kemudian lihatlah di bawah mikroskop. Amati bentuk dan warna Kristal yang ada di
gelas obyek.