Skema kloning gen insulin dari DNA sintetik

Bila digunakan gen insulin sintetik maka cloning rantai alfa dilakukan terpisah
dengan rantai beta, masing masing disisipkan pada plasmid yang berbeda, untuk
selanjutnya insulin rantai alfa hasil cloning akan digabung dengan rantai beta menjadi insulin
aktif. Tahapannya sebagai berikut :
1. Seperti pada proses pembuatan insulin menggunakan lactose operon (gen lac Z),
pembuatan insulin menggunakan bantuan -galaktosidase juga membuat rantai A dan
B secara terpisah.
2. Gen yang menyandi baik rantai A dan rantai B digabung dengan gen -galaktosidase.
-galaktosidase ini digunakan sebagai promotor, dengan hanya IPTG (suatu analog
laktosa) maka gen -galaktosidase akan tersintesis.
3. Gen rantai A maupun rantai B yang berada didekatnya, tentu juga akan tersintesis. Ini
adalah cara bagaimana gen rantai A tersintesis menjadi protein A.
4. Bila gen -galaktosidase bertemu dengan inducer yaitu IPTG, maka gen ini akan
tersintesis. Metionin dan rantai A metionin B yang berada didekatnya akan ikut
teersintesis, proses selanjutnya, sama seperti menggunakan laktose operon .
5. Pada tahap terakhir, rantai A dan B akan digabungkan menggunakn proses oksidasi.
Proses oksidasi berlangsung sebagai berikut: Rantai A dan B dioksidasi, bila tidak
terbentuk protein yang diinginkan maka direduksi kembali. Proses oksidasi-reduksi
ini memakan waktu dan tidak efisien.

PEMBUATAN INSULIN DARI cDNA

Complementary DNA (cDNA) merupakan DNA yang disintesis dari template mRNA dalam
sebuah reaksi yang dikatalis oleh enzim reverse transcriptase. Enzim reverse transcriptase
akan mengecek mRNA dan mensinstesi sebuah DNA yang merupakan pasangan dari mRNA
tersebut. Berikut tahap pembuatan insulin dari cDNA
1. mRNA proinsulin diubah menjadi cDNA proinsulin menggunakan enzim reverse
transcriptase. Diperlukan juga sintesis kodon untuk menyandi protein.
2. Kemudian cDNA dan kodon metionin di ligase bersama plasmid.
3. Di dalam gen E. Coli ini akan tersintesis menjadi protein yaitu peptida A, C (suatu
fragmen internal) dan B (ingat peptida A, C, dan B adalah proinsulin, tanpa rantai C
disebut insulin).
4. CNBr akan memeotong metionin dan memisahkan antara -galaktosidase dan
proinsulin
5. Proinsulin diubah secra enzimatik oleh enzim proteolitik menjadi insulin.

PEMBUATAN INSULIN DARI DNA GENOM

DNA GENOM ADALAH DNA mentah yang masih memiliki komponen lengkap seperti
promoter gen, bagian exon, dan bagian intron.
Tahapan pembuatan Insulin dari DNA genom
1. Langkah pertama adalah mengisolasi plasmid dari E. coli. Plasmid adalah salah satu
bahan genetik bakteri yang berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil
2. Pada langkah kedua ini plasmid yang telah diisolir dipotong pada segmen tertentu
menggunakan enzim restriksi endonuklease. Sementara itu DNA yang di isolasi dari
sel pankreas dipotong pada suatu segmen untuk mengambil segmen pengkode insulin.
Pemotongan dilakukan dengan enzim yang sama.

3. DNA kode insulin tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan bantuan enzim
DNA ligase. Hasilnya adalah kombinasi DNA kode insulin dengan plasmid bakteri
yang disebut DNA rekombinan.
4. DNA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel bakteri.
5. Bila bakteri E. coli berkembangbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri yang
memiliki DNA rekombinan.