Semeru Gita Lestari

10614023
Rangkuman Chapter 10: Modern Recombinant DNA Technology

Teknologi DNA rekombinan telah merevolusi pengamatan mengenai sel,

membuat pemilihan gen dari beribu macam gen pada sel dan menentukan sekuens
nukleotida menjadi mungkin untuk dilakukan. Elemen terpenting dari teknologi
tersebut adalah kemampuan memotong molekul DNA yang besar menjadi set fragmen
DNA yang spesifik dan dapat direproduksi menggunakan restriction nucleases yang
dapat memotng untai ganda DNA pada sekuens nukleotida tertentu.

A. Manipulasi dan Analisis Molekul DNA

Isolasi dan manipulasi gen individual bukanlah hal yang sepele. Tidak seperti
protein, suatu gen tidak berada sebagai suatu kesatuan yang terpisah pada sel;
melainkan sebuh bagian kecil dari bagian yang lebih besar yaitu molekul DNA.
Walaupun genom pada bakteri, yang memiliki kromosom tidak sekompleks pada
eukariot, tetap memiliki DNA yang sangat panjang. Contohnya adalah E.coli yang
mengandung 4.6 juta pasangan nukleotida.

Dibutuhkan enzim restriction nucleases yang dapat memotong fagmen molekul

DNA pada sekuens nukleotida tertentu. Enzim ini memotong DNA yang nantinya
akan digunakan untuk memproduksi satu set fragmen DNA spesifik dari suatu genom
yang dapat direproduksi. Setelah itu dilakukan pemisahan fragmen DNA dengan
ukuran yang berbeda - beda menggunakan melektroforesis gel. Prinsip kerja
elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan
pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju
kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya
Molekul-molekul yang bermuatan negatif akan bergerak menuju kutub positif,
sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif akan bergerak menuju kutub
negatif. Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju
perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis
gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing
terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Pita-pita yang dihasilkan dari
elektroforesis dapat divisualisasikan menggunakan fluorescent dyes atau radioisotop.
Hibridisasi asam nukleat dapat mendeteksi sekuens DNA atau RNA apapun yang
dicampur dalam fragmen asam nukleat. Teknik ini bergantung pada spesifitas
pasangan basa yang tinggi antara labeled, single stranded probe DNA dan RNA
dengan asam nukleat lainnya dengan sekuens yang komplementer.

B. Kloning DNA pada Bakteri

Tujuan dari kloning DNA adalah untuk

memproduksi banyak salinan dari sekuens DNA
yangdiinginkan.amplifikasi lah yang membuat
pemisahan segmen DNAyang mengandung gen
yang diinginkan dari keseluruhan genom dapat
dilakukan. Kloning DNA merupakan hal yang
penting dalam teknologi DNA rekombinan karena
kloning DNA merupakan poin awal untuk dapat
memahami fungsi dari bentangan DNA melalui
genom.

Fragmen DNA dapat disatukan bersama secara

in vitro menggunakan DNA ligase untuk
membentuk molekul DNA rekombinan yang dapat
ditemukan secara alami. DNA ligase berungsi
untuk mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil pada DNA. Setelah itu, DNA
rekombinan dapat dipelihara dan diamplifikasi dengan cara memasukannya kedalam
molekul DNA yang lebih besar yang dapat melakukan replikasi, seperti plasmid.
Molekl DNA rekombinan kemudian diperkenalkan kepada host cell yang dapat
membelah dengan cepat, biasanya beupa bakteri sehingga DNA dapat direplikasi
seiring dengan pembelahan sel pada bakteri.
Koleksi dari kromosom DNA yang telah dikloning akan merepresentasikan
genom utuh dari irganisme tersebut yang disebut dengan genomic lirary. Genomic
library ini biasanya mengndung jutaan kloning dari bakteri. Klon yang berbeda
membawa fragmen dari genom organisme yang berbeda pula. Terdapat pula cDNA
libraries yang mengandung kopian dari DNA yang telah dikloning dari total mRNA
dari jaringan atau tipe sel tertentu. Tidak sepertiklon gen pada DNA, klon cDNA
membawa sekuens predominantly protein-coding; yang hanya mempunyai sedikit
intron, sekuens regulator DNA, dan promotor. Walaupun begitu, klon cDNA tetap
berguna untuk dapat membuat protein.

C. Kloning DNA menggunakan PCR

Reaksi berantai Polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu

metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial sutu sekuen nukleotida
tertentu dengan cara in vitro. Metode PCR t sangat sensitif sehingga dapat digunakan
untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk
memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Terdapat
empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan yaitu fragmen
DNA yang akana dilipatgandakan, (2) oligonukleotida primer, yaitu sekue
oligonukleotida pendek (15-25 basa nukleotida) yang dignakan untuk mengawali
sintesis rantai DNA, (3) Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP,
dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim DNA polymerase yitu enzim yang melakukan
katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah
senyawa buffer.
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu
ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
2. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60 oC selama 20-40
detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA
template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

3. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA
polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan
dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya. Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga
ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan
diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
 Salah satu aplikasi dari teknik PCR adalah identifikasi sidik jari dalam bidang
forensik.. Tes sidik DNA dalam kasus Pita DNA terdiri dari gula pentose dan fosfat
Nukleotida yang saling berpasangan forensik utamanya dilakukan untuk tujuan
identifikasi korban walaupun sekarang tes sidik DNA juga bisa dilakukan untuk
melacak pelaku kejahatan. Pelacakan identitas forensik akan dilakukan dengan
mencocokkan antara DNA korban dengan terduga keluarga korban. Hampir semua
sampel biologis tubuh dapat digunakan untuk sampel tes sidik DNA, tetapi yang
sering digunakan adalah darah. Teknologi DNA berhasil mendemonstrasikan bahwa
DNA memiliki bagian-bagian pengulangan (sekuen) yang bervariasi. Hal ini
dinamakan polimorfisme, yang dapat digunakan sebagai sarana identifikasi spesifik
(individual) dari seseorang.

D. Exploring and Exploiting Gene Function

Teknik sekuensng DNA berkembang sangat pesat dan bisa dilakukan dengan
murah, sehingga dari waktu ke watu sudah banyak keseluruhan genom dari ribuan
organisme sudah diketahui termasuk ribuan indivisu manusia. Dengan menggunkan
teknik DNA rkombinan, protein dapat digabungkan dengan suatu molecular tag,
seperti contohnya adaah green fluorescent protein (GFP) yang pergerakannya bisa
dapat disusur didalam sel, dan pada kasus tertentu didalam organisme. Hibridisasi
asam nukleat secara insitu dapat digunakan untuk mendeteksi lokasi tepat dari gen
dalam kromsom dan RNAs padasel dan jaringan. DNA microarays dan RNA-Seq
dapat digunakan untuk memantau ekpresi 10000 gen dalam satu waktu. Gen yang
telah diklon dapat diubah secara in vitro dan dengan stabil dapat disisipkan kedalam
genom pada sel atau organisme tertetntu untuk dipelajari funngsinya. Mutan tertentu
disebut sebagai organisme transgenik. Ekspresi dari gen tertentu pada sl ataupun
organisme dapat diinhibisi menggunakan teknik RNA interference (RNAi) yang akan
mencegah mRNA ditranslasikan menjadi protein. Bakteri, ragi, dan sel mamalia dapat
diatur atau dimodifikasi untuk mensintesis protein dalam jumlah besar yang gennya
sudah diklon, sehingga memungkinkan untuk mempelajari suatu protein yang jarang
atau suit untuk diisolasi.