Evaluation of Antioxidative Activity of Extracts from a Brown Seaweed,Sargassum

siliquastrum
Rumput laut coklat S. siliquastrum.

 Dicuci dengan air bersih, dilakukan

pengeringan dengan cara dibekukan
(freeze drying
 dihaluskan

10 gram serbuk Rumput laut coklat S. siliquastrum.

 Ekstraktor soxhlet dengan methanol 150 ml selama 6 jam

 Diulangi 2x

Ekstrak Metanol
Ekstrak methanol di evaporasi

Ekstrak kental berwarna hijau gelap

Ditambahkan aqua destilata

Suspensi

Ditambahkan DCM, +kan ethyl asetate, +kan ethyl asetate,

dievaporasi dievaporasi dievaporasi

Ekstrak dicholoro Ekstrak ethyl Ekstrak n-butanol Residu air

methane (DCM) asetate

Dikolom (1,7x20 cm) dengan silica gel gel 60 (70-230 mesh,

Merck), di elusi dengan chloroform/methanol : ( 99:1, 95: 5, 90:10,
80:20, and 50:50)

Semua fraksi di KLT dengan Fase diam silica gel (5 20 cm,

Kieselgel 60F, 0.25 mm, Merck) dan fase gerak
chloroform/ethanol/acetic acid/water (98:10:2:2 v/v)
F1 F1 F1 F1

 Setelah di KLT, Disemprotkan dengan penampak noda

Nitrogen
 Lalu dilakukan pengujian antioksidan

Fenolik dan Berpotensi

sebagain antioksidan
 EVALUASI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

Aktivitas antioksidative dari ekstrak Sargassum siliquastrum dapat diujikan dengan tiga cara yaitu
1) Penghambatan RBC (red blood cell) hemolisis yang diinduksi oleh radikal 2,2’-azobis(2-
amidinopropane) dihydrochloride (AAPH), 2) penekanan lemak peroksidasi dengan
menggunakan homogenasi otak tikus, dan 3) menguji aktivitas dari radikal superoksidasi. Dari
hasil isolasi diatas fraksi dari hasil ekstrak dichloro methane (DCM) yang terbukti bahwa
memiliki aktivitas antioksidan tertinggi pada pengujian penghambatan RBC (red blood cell)
hemolisis yang diinduksi oleh radikal 2,2 -azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)
dan penekanan lemak peroksidasi. Setelah dihasilkan 4 fraksi, yang terbukti paling efektif dalam
melindungi RBC terhadap radikal AAPH dan penghambat lemak peroxidasi adalah Fraksi 1.

Cara menguji aktivitas antioksidan :

1. Hemolysis Assays
Pada percobaan ini digunakan tikus jantan Sprague-Dawley (200 g). Diambil darah tikus
pada vena cava posterior lalu dimasukkan kedalam tabung heparinized. Sel darah merah
(RBC) disentrifugasi dan dicuci tiga kali dengan fosfat-buffered saline (PBS; 125 mM
NaCl dan 10 mM natrium fosfat buffer, pH 7,4). Plasma dan lapisan buffy dilepaskan
dengan hati-hati oleh hembusan setelah setiap mencuci. Setelah pencucian terakhir, RBC
disentrifugasi sebanyak 1000g selama 10 menit untuk mendapatkan preparasi sel yang
merata . RBC dicuci yang akhirnya di resuspended dalam PBS untuk memperoleh
suspense RBC 20%.
Hemolisis RBC dimediasi oleh 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH;
peroxyl radikal inisiator) diukur berdasarkan metode Miki et al. Sebagian dari suspensi
RBC (0, 1 mL) dicampur dengan 0, 1 mL larutan PBS yang mengandung konsentrasi
yang berbeda pecahan pelarut rumput laut dan subfraksi (F1-F4). 200 mm AAPH (0.2
mL, di PBS) kemudian ditambahkan ke campuran. Campuran reaksi terguncang dan
diinkubasi dalam penangas air pada 37 C selama 3 jam. Setelah inkubasi, salah satu
campuran reaksi diencerkan dengan 8 mL PBS (A), dan yang lain diencerkan dengan 8
mL air suling (B) untuk menginduksi hemolisis. Kedua reaksinya yang disentrifugasi
sebanyak 1000g dalam 10 menit. Absorbansi supernatants dari A dan B (Aabs dan Babs,
masing-masing) pada panjang gelombang 540 nm yang diukur dengan alat
 spektrofotometer (Milton Roy Spectronic 3000). Pada percobaan ini digunakan Vitamin
C sebagai kontrol. Penghambatan persen dihitung dengan menggunakan persamaan
berikut:
% inhibition = (1 - Aabs/Babs) × 100

2. Lipid Peroxidation Assay

Tikus jantan Sprague-Dawley (150 g) diambil otaknya dengan cepat, lalu dicuci dengan
20 mM Tris-HCl buffer dingin (pH 7.4). Otak tersebut dihomogenkan dengan Tris-HCl
buffer dingin menggunakan pengaduk magnet Polytron PT 3000, lalu di sentrifugasi 3000
g selama 10 menit. Supernatant digunakan untuk studi peroksidasi lipid. Lipid
peroxidation diuji menggunakan pembentukan malon-dialdehyde (MDA) sebagai
indikator. Efek pecahan rumput laut yang berbeda dan subfractions pada tikus otak
homogenate disebabkan oleh Fe2 + dirangsang askorbat lipid peroxidation ditentukan
berdasarkan metode Liu et al. yaitu dengan cara : Campuran reaksi terdiri dari 0,1 mL
homogenate otak,10 µM FeSO4, 0,1 mm asam askorbat, dan 0,2 mL pecahan rumput
laut dengan konsentrasi yang berbeda. Campuran diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 h.
Reaksi dihentikan dengan menambahkan asam trikloroasetat (TCA) dan thiobarbituric
asam (TBA). Campuran kemudian dipanaskan pada 80 ºC selama 20 menit. Setelah
pendinginan, sentrifugasi dilaksanakan selama 10 menit. Absorbansi MDA-TBA
kompleks di supernatant ditentukan pada panjang gelombang 532 nm pada
spectrophotometer. Hydroxyanisole butylated (BHA) digunakan sebagai kontrol dalam
percobaan ini.
3. Menguji aktivitas dari radikal superoksidasi
Superoksida yang dihasilkan dalam sistem nonenzymatic. Pengaruh ekstrak pada generasi
superoksida yang dievaluasi oleh Spektrofotometri pengukuran produk pada pengurangan
tetrazolium nitroblue (Netbios). Media reaksi terdapat 16 mM Tris-HCl penyangga (pH
8.0), 78 µM §-reduktase nikotinamida adenin dinukleotida (bentuk dikurangi, NADH),
50 µM Netbios, 10 µM phenazine methosulfate (PMS), dan ekstrak rumput laut dengan
konsentrasi yang berbeda. Sampel kosong tidak terkandung NADH. Campuran reaksi
diukur pada absorbansi di 560 nm dengan spectrophotometer, pada sampel kosong.
Vitamin C dan glukosa yang digunakan sebagai kontrol positif dan negatif dalam
percobaan ini.