Penentuan Komposisi dan Urut-urutan

asam amino
pada rantai peptida
Menentukan komposisi asam amino

• Hidrolisis total rantai peptida.

Dididihkan dalam HCl 6M. Cara ini akan
menyebabkan:
1. Rusaknya cincin indol dari triptofan (triptofan
harus ditentukan tersendiri)
2. Lepasnya amonia dari rantai samping glutamin
dan asparagin, menghasilkan as. glutamat dan as.
aspartat
 H

CH2 C COOH

NH2
N
Triptofan
+
H +
H2N C CH2 C COOH HO C CH2 C COOH + NH4
H2O
O NH2 O NH2
Asparagin Aspartat
+
+ NH4
+
H HO C (CH2)2 C COOH
H2N C (CH2)2 C COOH
H2O
O NH2 O NH2

Glutamin Glutamat
• Pemisahan asam amino
Pemisahan dilakukan dengan teknik ion-
exchange chromatography yang didasarkan
pada perbedaan affinitas antara masing-masing
asam amino dengan resin

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
• Pengukuran kuantitatif asam amino
Asam amino yang dipisahkan dapat ditentukan dengan
cara reaksi dengan ninhidrin yang menghasilkan produk
yang berwarna.

O
NH2
OH
R C COOH +
OH
H
O
O O

N + CO2 + RCHO + H2O

H
O O
Dr. Endang Saepudin
Dept. Kimia FMIPA-UI
 Pentingnya Penentuan Urut-urutan
Asam Amino
Berdasarkan atas:
• Sifat protein ditentukan oleh susunan
rangkaian asam amino dalam rantai
polipeptida
• Susunan asam amino ini merupakan Struktur
Primer dari protein

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
Pengetahuan mengenai susunan (sequence)
asam amino dalam protein berguna untuk:
• Membandingkan antara protein normal dan
protein mutant.
• Mendapatkan informasi yang vital untuk
menentukan struktur 3 dimensi protein
• Membandingkan antara protein sejenis pada
spesies atau organisme yang berbeda
sehingga berguna untuk mempelajari pohon
evolusi

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
• Struktur primer protein merupakan translasi dari
rangkaian DNA. Ini berarti begitu rangkaian DNA
berubah, maka protein juga berubah.
Rangkaian protein dari organisme yang berhubungan
dekat sangat mirip dan membandingkan protein dari
organisme yang berbeda dapat memberikan
informasi tentang hubungan evolusinya.
• Protein yang telah berubah dari nenekmoyang yang
sama dikatakan sebagai homolog.
Homologi protein dapat digunakan untuk
menentukan evolutionary relationships.
• A partial evolutionary tree derived from
Cytochrome C sequences

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
A partial evolutionary tree derived from
Cytochrome C sequences

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
 Informasi yang diperlukan untuk squensing

• Komposisi
→ berapa banyak jumlah asam amino yang ada pada rantai
peptidanya
• N-terminal → asam amino pertama dalam rantai peptida
dapat bereaksi dengan pereaksi SANGER /FDNB
(fluoradinitrobenzen) atau pereaksi EDMAN yg akan
membentuk derivat N-terminal
• C-terminal → asam amino terakhir dalam urutan rantai
peptida , untuk memotongnya biasanya digunakan enzim
karboksipepetidase
• Enzim-enzim yang dapat menghidrolisis ikatan peptida
 Langkah squensing
• Urut-urutan asam amino pada rantai peptida dapat
ditentukan dengan menggunakan pereaksi kimia
yang selektif dan secara enzimatic untuk memotong
rantai protein yang diikuti dengan metode
pemisahan dan analisis asam amino kemudian
ditentukan urut-urutan asam amino dari masing-
masing fragmen peptidanya.
• Seluruh asam amino dapat ditentukan urut-
urutannya menggunakan fragmen-fragmen dengan
urutan yang identik atau cocok secara overlapping
Urutan teknik sequencing
• Pemecahan jembatan disulfida dengan oksidator
seperti asam performat
• Penentuan N dan C terminal dengan pereaksi FDNB
atau pereaksi Edman
• Pemecahan protein dengan enzim yang spesifik
seperti tripsin, kimotripsin, dll. untuk mendapatkan
fragmen yang sederhana
• Hidrolisis total dan penentuan asam amino
• Membandingkan lokasi overlap

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
 1) pemurnian
S S
Rantai A GIVEQCCASVCSLYQLENYCN
S S
S S
Rantai B FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

2) pemutusan ik. disulfida

3) pemisahan kedua rantai dan penentuan
N dan C terminal
- -
- - SO3
SO3 SO3 SO3
GIVEQCCASVCSLYQLENYCN FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA
- -
SO3 SO3
4) pemecahan menjadi
Tripsyn
fragmen kecil Chymotrypsin
5) penentuan susunan a.a
- -
- fragmen kecil SO
SO3 SO3 3

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER FVNQHLCGSHLVEALY
-
GFFYTPK SO 3
6) identifikasi dari rangkaian
A LVCGERGFF
yg overlap untuk menentukan
susunan rantai B secara utuh YTPKA
 - -
SO3 SO3
- SO3

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER FVNQHLCGSHLVEALY
-
GFFYTPK SO3
6) identifikasi dari rangkaian
A LVCGERGFF
yg overlap untuk menentukan
susunan rantai B secara utuh YTPKA

- -
SO3 SO3
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGER
-
SO3
-
FVNQHLCGSHLVEALY SO3
LVCGERGFF
GFFYTPK
YTPKA
A
- -
SO3 SO3
Rangkaian FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
Informasi yang diperlukan untuk squensing

• Komposisi
→ berapa banyak jumlah asam amino yang ada pada rantai
peptidanya
• N-terminal → asam amino pertama dalam rantai peptida
dapat bereaksi dengan pereaksi SANGER /FDNB
(fluoradinitrobenzen) atau pereaksi EDMAN yg akan
membentuk derivat N-terminal
• C-terminal → asam amino terakhir dalam urutan rantai
peptida , untuk memotongnya biasanya digunakan enzim
karboksipepetidase
• Enzim-enzim yang dapat menghidrolisis ikatan peptida
Enzim/pereaksi yang menghidrolisis ikatan peptida
• Chimotripsin
spesifik memotong ikatan peptida dar residu asam amino
dengan rantai samping aromatis pada sisi karboksil (sisi- C) →
Phe, Trp, dan Tyr
• Tripsin
spesifik memotong ikatan peptida dari residu asam amino
dengan rantai samping BASA pada sisi-C → Lys dan Arg
Tapi tidak dapat memeotong jika residu asam amino
berikutnya Pro
• Karboksipeptidase
memotong residu asam amino dengan C-terminal (asam amino
paling akhir dari rantai peptida)
• Cyano bromida /CNBr
soesifik memotong ikatan peptida dari asam amino Met pada
sisi -C
Penentuan N terminal
• Pereaksi FDNB (SANGER)
R1 O HF

O2N • Pereaksi
F +H N
2
CH
C
N FDNB
CH
C

O R2
FDNB NO2
R1 O

CH N C
O2N NH C CH

O R2
NO2 hidrolisis

R1 O
CH OH
O2N NH C + H2N C
CH
O R2
NO2 as. amino bebas
as. amino DNB
Dr. Endang Saepudin
(berwarna)
Dept. Kimia FMIPA-UI
Pereaksi Edman (degradasi Edman)
Fenilisotiosianat feniltiohidantoin

+
H
N
NH O N S
C C C
C S
-
S OH HCl H C NH
+ NH
NH2 R1
R1 CH
R1 CH NH2
C O
C O R2 CH
NH
NH C O
R2 CH
R2 CH C O
C O
Peptida minus
feniltiokarbamoil- as. amino terminal
Peptida peptida
 SISWATI SETIASIH - BIOKIMIA DEPT KIMIA
3/28/2015 19
FMIPA UI
 SISWATI SETIASIH - BIOKIMIA DEPT KIMIA
3/28/2015 20
FMIPA UI
Pemutusan pada residu metionin
• Pereaksi Sinogen bromida
Amino Amino
terminus NH terminus NH

HC R1 HC R1
C O C O
+ CH3SCN
NH NH
CNBr H2
HC CH2 CH2 S CH3 HC C
metionin CH2
C O C O
O
NH +
NH2
HC R2
Karboksi HC R2
terminus C O Karboksi
terminus C O

Dr. Endang Saepudin

Dept. Kimia FMIPA-UI
 Enzim Pemecah Protein (Endopeptidase)
Peptidase Titik Pemotongan Residu asam amino

Pepsin atau OH
O R' O R O
Phe Tyr
C NHCHC NHCHC
NH
Trypsin O R O R' O (CH 2)4 NH2 (CH 2)3 C NH2
Lys atau Arg
C NHCHC NHCHC

Chymotrypsin O R O R' O OH
C NHCHC NHCHC
Phe Tyr atau Trp

CH 3
O R O R' O (CH 2)4 NH2 CH 2 CH
Papain
C NHCHC NHCHC CH 3
Dr. Endang Saepudin Lys atau Leu, Arg, Gly
Dept. Kimia FMIPA-UI
 Latihan

• Suatu campuran alanin, asam glutamat, dan

arginin akan dipisahkan dengan kromatografi
penukar-ion pada pH 6,1. Apakah asam-asam
amino ini dapat terpisah, jika jawabannya ya,
perkirakan urutan keluarnya asam amino dari
kolom tersebut.
 Soal 1
• Suatu oktapeptida telah dapat diisolasi dari sejenis kapang.
Ketika dihidrolisis didapat komposisi asam amino:
2 Lys, Asp, Tyr, Phe, Gly, Ser, dan Ala
Reaksi oktapeptida dengan FDNB kemudian hidrolisis
menghasilkan DNP-alanin dan 2 mol e-DNP-lisin.
Reaksi dengan trypsin menghasilkan fragmen-fragmen yang
komposisinya adalah: (Lys, Ala, Ser), dan (Gly, Phe, Lys) serta
dipeptida.
Reaksi dengan Chymotrypsin menghasilkan asam aspartat
bebas, tetrapeptida dengan komposisi (Lys, Ser, Phe, Ala), dan
tripeptida yang komposisinya (Gly, Lys, Tyr).
Tentukan rangkaian tetrapeptida tersebut?
 Soal 2
A group of peptides that influence nerve transmission in certain parts of the
brain has been isolated from normal brain tissue. These peptides are known
as opioids, because they bind to specific receptors that also bind opiate
drugs, such as morphine and naloxone. Opioids thus mimic some of the
properties of opiates. Some researchers consider these peptides to be the
brain’s own pain killers. Using the information below, determine the amino
acid sequence of the opioid leucine enkephalin. Explain how your structure is
consistent with each piece of information.
(a) Complete hydrolysis by 6 M HCl at 110 oC followed by amino acid analysis
indicated the presence of Gly, Leu, Phe, and Tyr, in a 2:1:1:1 molar ratio.
(b) Treatment of the peptide with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene followed by
complete hydrolysis and chromatography indicated the presence of the
2,4-dinitrophenyl derivative of tyrosine. No free tyrosine could be found.
(c) Complete digestion of the peptide with pepsin followed by
chromatography yielded a dipeptide containing Phe and Leu, plus a
tripeptide containing Tyr and Gly in a 1:2 ratio.
Conventions Associated with the Common Amino
Acids Found in Proteins

Amino acid Abbreviation/ symbol

Nonpolar, aliphatic R groups
Glycine Gly G
Alanine Ala A
Proline Pro P
Valine Val V
Leucine Leu L
Isoleucine Ile I
Methionine Met M
Aromatic R groups
Phenylalanine Phe F
Tyrosine Tyr Y
Tryptophan Trp W
Polar, uncharged R groups
Serine Ser S
Threonine Thr T
Cysteine Cys C
Asparagine Asn N
Glutamine Gln Q
Positively charged R groups
Lysine Lys K
Histidine His H
Arginine Arg R
Negatively charged R groups
Aspartate Asp D
Glutamate Glu E