Overview Cysteine

Memiliki kodon UGU & UGC

Asam amino yang biasanya diambil dalam
bentuk N-asetil-L-sistein (NAC)
Dapat dijadikan sebagai sumber bahan makanan
Dapat membantu mencegah efek samping yang
disebabkan oleh reaksi obat dan bahan kimia
beracun dan membantu memecah lendir di
dalam tubuh

Overview Threonine
Asam amino esensial
Memiliki kodon ACU, ACA, ACC, and ACG.
Threonine banyak terkandung pada
produk-produk darisusu dagingikan
danbijiwijen.
Memiliki 4 kemungkinan steroisomer

Mengapa Threonine perlu dimutagenesis

(T103C)

Membuat lebih stabil .Kestabilan

relatif dipengaruhi oleh energi bebas
Gibbs hasil denaturasi akibat
perbedaan tempratur antara gen asli
dan hasil mutasi
(mutan).Peningkatan kestabilan
mempengaruhi 2 ikatan alphahelices

RESTRIKSI

Tahapan 1: Menentukan
Site Restriksi

Pemilihan enzim
restriksi harus
menyesuaikan
dengan site
restriksi yang ada
ada Site
baik
gen insert
restriksi
adalah
sekuens
6 nukleotida
maupun
vektor
yang bersifat khusus di
plasmid
mana enzim-enzim
restriksi akan
memotong

Tahapan 2: Menentukan Enzim

Restriksi
Berdasarkan site restriksi
pada plasmid dan juga
pada GOI maka dipililah
enzim restriksi EcoRI
dan Hindlll.Karena di
dalam strain GOI dan
plasmid tidak terdapat
restriction site EcoRI dan
HindIII, sehingga enzim
restriksi tidak akan
memotong GOIdan
plasmid akan terpotong
spesifik.

Karakteristik EcoRI dan Hndlll

EcoRI
Berasal dari strain
E.coli RY13
Merupakan 6-cutters,
dan enzim restriksi
endonuklease.
Hasil pemotongan
berupa sticky end

Hndlll
Berasal dari strain
Haemophilus
influenzae Rd
Merupakan 6-cutters,
dan enzim restriksi
endonuklease.
Hasil pemotongan
berupa sticky end

Tahapan:Menentukan Larutan Buffer

Larutan buffer mempengaruhi
aktivitas enzim restriksi. Masingmasing enzim restriksi memilki jenis
buffer tertentu yang membuat
aktivitasnya maksimal. Apabila kita
hendak me-restriksi ganda (double
digest) pada satu waktu, maka buffer
harus dipilih yang sesuai dengan
aktivitas maksimal kedua enzim
tersebut.

Tahapan:Menentukan Larutan Buffer

Larutan buffer yang dipilih untuk enzim
restriksi EcoRI dan Hndlll ialah CutSmart
Komposisi nya adalah :
50mM Potassium Acetate
20mM Tris-acetate
10mM Magnesium Acetate
100g/ml BSA
Suhu penyimpanan : 25C
PH: 7.9

RESTRIKSI
Larutan ini kemudian dimasukkan enzim
restriksi dan diinkubasi selama 1 jam
pada 370C
DNA perlu direstriksi agar menjadi sticky
end
Plasmid hanya bisa dimasuki oleh DNA
yang sticky end.Sedangkan hasil
amplifikasi PCR akan menghasil DNA
yang blund end

Ligasi
Ligasi DNA mengacu pada reaksi yang
membentuk molekul DNA rekombinan dengan
cara mengikat bersama dua fragmen restriksi
dengan ujung yang kompatibel. Agar proses ligasi
dapat berlangsung, DNA ligase membutuhkan
ujung 5-P dan 3-OH pada molekul DNA. ketika
DNA dicerna oleh enzim restriksi yang
menghasilkan ujung lengket, ujung DNA yang
kompatibel dapat berikatan. Ligase dapat
mengikat secara kovalen 5-P dan 3-OH
berdekatan dengan sumber energi (ATP) dan
kofaktor Mg2+.

Mekanisme Ligasi:

Mekanisme Ligasi :
Pembentukan intermediet enzim berenergi tinggi
dengan transfer gugus adenosil dari ATP
ke gugus amino dari residu lisin pada DNA
Ligase
Membentuk ikatan pirofosfat yang teraktivasi
dengan Transfer gugus adenosil ke ujung fosfat 5
dari salah satu ujung DNA yang rusak
Penyerangan ujung 5 terativasi oleh gugus 3hidroksil pada ujung DNA yang berdekatan (ujung
rusak DNA), yang membentuk ikatan fosfodiester
diatara ujung-ujung DNA yang rusak
Pelepasan AMP

Tahapan Ligasi :

Tahapan Ligasi :
Penambahan Alkaline
phosphatase :
Ditambahkan pada saat
larutan vektor belum
dimasukan GOI.Tujuanya untuk
untuk menghilangkan gugus P
pada 5P sehingga menjadi
5OH (defosforilasi) sehingga
dapat meminimalisasi
terjadinya kemungkinan vektor
menyambung pada vektor itu
sendiri atau vektor
menyambung dengan vektor
lain (terjadi ligasi antar vektor)

Penambahan Larutan Buffer

mempertahankan pH pada nilai
tertentu agar DNA tidak
terdegradasi oleh adanya bahan
lain
Penambahan DNA Ligase
ditambahkan saat kondisi larutan
telah disesuaikan terlebih dahulu
agar ligasi dapat berjalan efektif
Inkubasi
inkubasi dilakukan dalam suhu
16oC.Deaktivasi enzim pada suhu
70oC selama 15 menit setalah
proses inkubasi