MAINTENANCE HPLC

Gambar 1. Tampilan Umum HPLC system Ultimate 3000 (instrumental operation ultimate 3000)

Sistem iHPLC ni terdiri dari 5 kompartemen(dari atas):

1. Solvent rack (SRD-3600)
2. Dual pump (DGP-3600A)
3. Autosampler (Well Plate Sampler, WPS-3000SL)
4. Column compartment (Temperature Controlled Compartment, TCC 3200 2x2P-10P)
5. UV detector (Variable Wavelength Detector, VWD-3400)
1. Penyiapan fase gerak (Ahuja & Dong, 2005)
a. Fase gerak dibuat dengan mengukur volume komponen fase gerak secara terpisah
kemudian dicampur menjadi satu. Contoh : fase gerak dengan volume 1 liter
campuran methanol : air (50:50) maka pembuatannya yaitu siapkan 500 ml larutan
methanol dan 500 ml air pada wadah yang terpisah kemudian campur dalam satu
wadah. Pencamourannya bukan 500 ml methanol di-ad-kan 1000 ml air atau
sebaliknya. Hal ini penting karena teknik penyiapan fase gerak akan berpengaruh
pada waktu retensi dan pemisahan senyawa (resolusi) (lebih jelas ada di gambar hal
257 Ahuja & Dong, 2005).
b. Buffer sering digunakan untuk mengontrol pH dari fase gerak dimana akan
mempengaruhi retensi dari analit yang bersifat asam maupun basa. Buffer merupakan
campuran asam lemah dan garamnya atau basa lemah dan garamnya. Buffer
dilarutkan dalam air karena garam larut dalam air. Akan tetapi garam dapat
mengendap di kolom dan mengakibatkan kolom berkerak sehingga setelah selesai
pemakaian kolom harus dicuci dengan air.
Pembuatan buffer sebaiknya mengukur masing-masing volume komponennya dalam
bentuk larutan (molaritas) kemudian baru dicampur. Misal pembuatan buffer fosfat
pH 5,8 yaitu siapkan 50 ml kalium fosfat 0,2 M dan 3,6 ml NaOH 0,2 M. keduanya
dimasukkan dalam labu takar 200 ml kemudian di-adkan sampai 200 ml air (USP 32)
c. Pada HPLC pencampuran fase gerak dan buffer tergantung banyaknya pompa.
Apabila pompanya ada satu maka pencampuran buffer dengan fase gerak di luar alat
(dicampur dulu). Sedangkan apabila menggunakan 2 pompa, maka yang satu untuk
fase gerak dan satunya lagi untuk buffer.
d. Buffer akan mempengaruhi retensi analit yang bersifat asam atau basa (senyawa
netral tidak terpengaruh oleh perubahan pH). Contoh pada sistem RP-HPLC
(Reversed phased-HPLC dengan fase diam non polar) dengan kondisi sistem basa,
maka senyawa asam akan terion sehingga menjadi lebih polar dan akan lebih
berinteraksi dengan fase gerak (elusi menjadi lebih cepat karena senyawa tidak terikat
dengan fase diam). Oleh karena itu, pengaturan pH menjadi penting. Buffer akan
efektif pada rentang pH ± 1 unit dari pKa-nya. Contoh buffer fosfat dengan pKa 7,2
akan efektif untuk PH 6,2-8,2. Larutan buffer tidak boleh pekat, antara 10-20mM
jangan mencapai 50mM karena dapat mengakibatkan endapan di kolom.
 e. Sebaiknya buffer digunakan 1-2 hari setelah dibuat dan maksimal 1 minggu, jangan
melebihi 10 hari karena dapat mengakibatkan tumbuhnya bakteri (di dalam buffer ada
air yang merupakan media tumbuh bakteri/mikroba) sehingga dapat merusak kolom.
f. Jangan biarkan buffer tertinggal di kolom akan ada kemungkinan mengendap
(jalankan dengan kecepatan 0,1 ml/min when idling).
g. Apabila dalam komponen fase gerak terdapat buffer, maka pencucian kolom
dilakukan dengan menggunakan air atau 10% asetonitril
h. Asam-asam kuat biasanya tidak digunakan sebagai buffer karena dapat memutuskan
ikatan bonding kolom seperti TFA /trifluoroacetic acid yang mempunyai pKa 0,3
(hati-hati). Asam-asam yang sering digunakan dalam campuran fase gerak yaitu asam
fosfat, asam formiat, asam asetat.
i. Apabila dalam fase gerak mengandung senyawa trietilamin (TEA) sebaiknya kolom
C-18 dicuci dengan campuran methanol : asam fosfat 0,05% (50:50) agar TEA (basa)
dapat terlepas dari residu silanol (tidak masking). Gugus silanol pada kolom C-18
berfungsi untuk berinteraksi dengan bagian polar dari analit. Apabila kolom masking
oleh TEA, analit bersifat polar akan terus terbawa oleh fase gerak dan tidak tertahan
oleh fase diam (waktu retensinya menjadi cepat).

2. Filtrasi atau degassing (Ahuja & Dong, 2005)

a. Larutan jernih secara visual belum tentu bebas dari senyawa pengotor sehingga perlu
filtrasi. Begitu juga dengan fase gerak yang mengandung buffer dan ion pairing
agent, filtrasi harus dilakukan. Fase gerak yang menggunakan solven pro HPLC tidak
perlu difilter karena sudah difilter oleh manufakturnya.
b. Air yang digunakan pada sistem HPLC sebaiknya memiliki konduktivitas yang
rendah. Konduktivitas yang tinggi menandakan adanya pengotor logam (trace metal).
Air ini memiliki mengandung muatan sehingga dapat menghantarkan listrik yang
dapat mengakibatkan tailing (senyawa berikatan dengan logam). Sekarang ada sistem
yang dirancang untuk menghasilkan air untuk HPLC yaitu mili-Q water system for
HPLC. Sistem ini dapat meminimalkan trace logam. Selain konduktivitas air,
parameter lain yang harus diperhatikan yaitu pH dan kontaminan. TOC juga
sebaiknya memiliki angka yang kecil karena dikhawatirkan adanya senyawa organik
dapat berinteraksi dengan senyawa obat (kebanyakan obat senyawa organik)  non
polar interaction.
 c. Degassing yaitu menghilangkan gas di solven terutama jika pelarutnya air. Adanya
gas dalam solven / pelarut dapat mengakibatkan pump problem yaitu aliran tidak
stabil (unstable flow rate). Sebaiknya pengecekan flow rate 1 minggu sekali untuk
mengetahui adanya masalah pada pompa. Cara degassing yang efektif yaitu dengan
menggunakan in line vacuum degassing (build-in). Apabila belum ada, degassing
dapat dilakukan dengan menggunakan vacuum filtration atau sonikasi. Akan tetapi,
cara tersebut kurang efektif karena dalam beberapa saat akan terjadi re-gass ( oleh
karena sistem tidak tertutup).

3. HPLC-Pump Operating Guides (Ahuja & Dong, 2005)

Gambar. Bagian dalam pompa ganda (instrumental operation ultimate 3000)

Gambar. botol larutan pencuci seal belakang. Larutan Pencuci perlu diubah setiap minggu dan terdiri dari
20% metanol atau etanol. Botol dipasang di dudukan logam dan seluruh dudukan diangkat. (instrumental
operation ultimate 3000)
 1. Botol yang digunakan sebaiknya tertutup rapat karena jika tidak akan ada resiko
penguapan yang dapat mengubah komposisi fase gerak terutama yang mengandung
pelarut organik. Botol di-cover dengan parafilm untuk menghindari evaporasi dan
kontaminasi.
2. Setting pressure test yaitu 3500-4000 (set upper limit). Jangan mepet atas, misal limit
atas 4000 psi maka dipakai 3750 -3800 sehingga kolom sudah jenuh kemudian bisa
dinaikkan lagi.
3. Cuci kolom dengan methanol 100% (strong solvent) lalu dialiri dengan fase gerak
selama 5-10 menit sampai baseline dan pressure stabil.
4. Pemanasan kolom bertujuan untuk mengurangi viskositas fase gerak sehingga
alirannya lebih cepat dan menghasilkan peak yang ramping. Pemanasan kolom antara
35-40ºC, kalau melebihi 60ºC dapat melarutkan kolom.
5. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel sebaiknya sama dengan larutan fase
gerak. Apabila tidak campur, dan pelarut sampel solvent strengthnya lebih besar dari
fase gerak maka dapat mengakibatkan pecahnya peak. Oleh karena itu, sebaiknya
sampel yang diinjek sekecil mungkin sesuai minimum injeksi kolom.
6. Pada kolom RP, Fase gerak bisa dimodifikasi dengan air atau THF. Tapi THF bisa
memunculkan radikal jika disonifikasi. PEEK Tubing inkompatibel dengan DMSO,
THF, metilen klorida, dan asam anorganik, dapat menyebabkan PEEK Tubing meleleh.

4. Maintenance kolom /HPLC-Column operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)

Gambar. Internal kompartemen kolom dengan dua katup pemutar 10-port. Panah biru menunjukkan arah
aliran, yang harus sesuai dengan arah aliran kolom. (instrumental operation ultimate 3000)
 a. Simpan kolom dengan mengandung air atau metanol atau campuran air dan pelarut
organik. Jangan sampai kolom mengalami drying out.
b. Kolom dapat di-backflush dengan flow rate yang kecil, tapi ada juga yang tidak. Jika
ada tanda panah berarti tidak bisa di-backflush (tergantung merk dan supplier). Jika
akan di-backflush jangan pada kolom yang sudah ada tanda panahnya atau arah flow-
nya (arrow-nya). Pada saat backflush, gunakan flow rate separuh dari yang biasa
digunakan dan sebentar saja.
c. Pengaturan pH disesuaikan daya kolom terhadap pH (ada di CoA kolom). Jika tidak
ada biasanya pH 2-8 (sebaiknya kolom dilabeli). Jika pH > 8 maka silika akan
melarut, tapi jika pH < 2 maka akan terjadi hidrolisis sehingga kolom rusak (ppt
MANAGEMENT KOLOM HPLC)
d. Masa berlaku kolom sebaiknya didasarkan atas jumlah injek. Injek kolom maksimal
3000 (jangan diregenerasi) dan jangan menggunakan patokan waktu.
e. Untuk pengaturan suhu disesuaikan juga dengan kemampuan kolom. Sebaiknya suhu
di bawah temperature limit kolom.
f. Performance kolom menurun signifikan ditandai dengan back pressure dan peak yang
melebar.
g. Kolom baru  verifikasi performance-nya dengan senyawa yang ada di CoA saja.
Apabila theoritical plate-nya < 80 % dikembalikan saja.
h. Carry-over  senyawa yang tertinggal di kolom atau di syringe, tertinggal karena
sampel terlalu pekat (Sebaiknya konsentrasi jangan pekat agar sisa sampel tidak
tertinggal di kolom)
i. Untuk sampel semi solid  panaskan dengan methanol/air sampai meleleh. Ambil
lapisan bawah dan tetap lakukan penyaringan. Setelah bekerja dengan sampel semi
solid  pencucian dilakukan dengan menggunakan larutan yang dapat mengelusi
sample (ppt HPLC Penting A).

5. Detector operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)

a. Hidupkan lampu 15 menit untuk pemanasan
b. Set panjang gelombang dan waktu responnya.
c. Masa hidup lampu detector < 2000 jam.
d. Pada saat conditioning sebaiknya lampu dimatikan untuk menghemat masa hidup
lampu
6. Kuantifikasi / Quantitation Operating Guide (Ahuja & Dong, 2005)
a. Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan peak Area (tidak terpengaruh oleh flow
rate karena fluktuasinya hanya akan memberikan sedikit variasi). Apabila resolusi
mencapai 1,8/1,9 maka sebaiknya di-kuantifikasi menggunakan peak height saja
sehingga apabila peak area TMS sedangkan peak height MS, hasil masih dapat
digunakan. Kuantifikasi menggunakan peak height hanya terdapat di GC tetapi bisa
juga diterapkan pada HPLC apabila peak area cenderung tailing, namun tailing
faktornya masih memenuhi syarat
b. Gunakan baku eksternal untuk analisis sehari-hari (assay dan disolusi). Sedangkan
Bracketed standard digunakan untuk meningkatkan akurasi seperti pada validasi yaitu
digunakan sebagai jaminan dimana metode menghasilkan respon yang proporsional
antara kadar dan respon atau penjaminan bahwa analisis yang dilakukan dalam
rentang kadar tertentu adalah valid. Baku bracketed dilakukan pada rentang 80-
120 %.

7. Performance check (Chan dkk, 2004)

8. Key success on HPLC (Ahuja & Dong, 2005)
a. Rawat dan Kalibrasi HPLC secara periodic  0,5 tahun sekali.
b. Cek sistem performance dengan senyawa yang ada di CoA
c. Selalu verifikasi bahwa baseline dan pressure normal
d. Menggunakan solven pro HPLC dan Degassing  jika ada air
e. Clean up dan filter sampel. Larutkan sampel dalam fase gerak. Kalau tidak larut 
gunakan volume sekecil mungkin
f. Selalu cuci kolom sebelum dan setelah digunakan
g. N  theoretical plate kurang dari CoA atau setengah dari CoA (warning  ganti
kolom).
h. Check  dengan prosedur referens menggunakan senyawa yang ada di CoA untuk
verifikasi performance

9. Uji kesesuain system / UKS

 Untuk menjamin data atau hasil yang diperoleh dari system HPLC proper/sesuai.
 Chan dkk, 2004 (chapter pperformance verification HPLC)
UKS hanya menunjukkan bahwa instrument sesuai dengan analisis tertentu pada
waktu tertentu tidak bisa menunjukkan tes verifikasi performa dari instrument HPLC.
Sebagai contoh UKS untuk HPLC dengan deteksi UV  tidak aan menunjukkan
adanya masalah pada akurasi panjang gelombang yang digunakan karena baik sampel
maupun standar diukur pada panjang gelombang yang sama.

DAFTAR PUSTAKA

1. Ahuja, S., and Dong, M.W. 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC,
Seventh Volume, Elsevier Academic Press, New York.
2. Chan, C.C., Lam, H., Lee, Y.C. and Zang, X.M. 2004, Analytical Method Validation
and Instrument Performance Verification, John Wiley & Sons, Inc, Canada